血管活性腸多肽對(duì)老齡勃起功能障礙大鼠的作用及機(jī)制研究

張存明 王軍衛(wèi) 陳 松 吳忠標(biāo) 葉海波

勃起功能障礙（erectile dysfunction，ED）是指持續(xù)或反復(fù)出現(xiàn)的無(wú)法達(dá)到和/或維持陰莖勃起完成性活動(dòng)，而年齡是ED 最為重要的發(fā)病原因之一，ED發(fā)病率隨著年齡增長(zhǎng)而升高[1]。ED 是最常見(jiàn)的男性性功能障礙，40～69 歲的男性患病率為61%，而70歲以上男性患病率則高達(dá)77%[2]。血管活性腸多肽（vasoactive intestinal polypeptide，VIP）是非腎上腺素能非膽堿能抑制性神經(jīng)的重要遞質(zhì)，具有擴(kuò)張血管、松弛平滑肌、抗炎等作用。前期研究表明，VIP 可以改善性腺功能障礙大鼠的勃起功能[3]。本研究通過(guò)延長(zhǎng)飼養(yǎng)時(shí)間并進(jìn)行勃起功能測(cè)試，構(gòu)建老齡模型ED 大鼠，探討VIP 對(duì)老齡模型ED 大鼠的治療作用及其機(jī)制。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 動(dòng) 物 SPF 級(jí)雄性SD 大鼠40 只，6 月齡，體質(zhì)量300～320 g。購(gòu)自上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限責(zé)任公司，動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK（滬）2019-0005，飼養(yǎng)于浙江中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用許可證SYXK（浙）2019-0098。本實(shí)驗(yàn)經(jīng)浙江中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物管理與倫理委員會(huì)審核通過(guò)。動(dòng)物飼養(yǎng)：溫度（20±2）℃，濕度55%，照明/黑夜：12 h/12 h，自由飲食、飲水的環(huán)境。

1.2 藥品和試劑 阿撲嗎啡（B6936，批號(hào)ZJK-0921）購(gòu)自ApexBio Technology；BCA 蛋白濃度測(cè)定試劑盒（P0012S，批號(hào)198273）、極超敏ECL 化學(xué)發(fā)光試劑盒（P0018FS，批號(hào)238924）、RIPA 裂解液（P0013K，批號(hào)938475）購(gòu)自上海碧云天生物公司；環(huán)磷酸腺苷（cyclic adenosine monophosphate，cAMP）（H164，批號(hào)KD-3944）、一氧化氮（NO）酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）檢測(cè)試劑盒（A012-1-2，批號(hào)20219434），均購(gòu)自南京建成生物有限公司；VIP 購(gòu)自Sigma 公司（V0131，批號(hào)SE-62344）；蛋白激酶A（protein kinase A，PKA）（ab75991，批號(hào)D-1892）、內(nèi)皮源性一氧化氮合酶（endothelial nitric oxide synthase，eNOS）（ab300071，批號(hào)D-8823）、血管性血友病因子（von willebrand factor，vWF）（ab6994，批號(hào)D90287）、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（VEGF）（ab214424，批號(hào)D0938），均購(gòu)自英國(guó)Abcam 公司；HRP 羊抗鼠二抗（RS0002，批號(hào)R2903-2）、β-actin 兔抗大鼠單克隆抗體（YM3028，批號(hào)KL20384-8），購(gòu)自北京Immunoway 公司。

1.3 儀 器 信息化生物信號(hào)采集與處理儀器（泰盟BL-420N），Olympus 正置圖文采集系統(tǒng)顯微鏡（BX53M），微量高速冷凍離心機(jī)（M1324R），蛋白垂直電泳儀及轉(zhuǎn)膜儀（美國(guó)Bio-Rad 公司），F(xiàn)luor chem R 成像儀（Protein Simple 公司），脫水機(jī)、組織蠟塊切片機(jī)（美國(guó)Thermo Scientific 公司，HM340E）。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 模型建立及分組處理 將40 只SD 大鼠飼養(yǎng)至18 個(gè)月齡，使用阿撲嗎啡進(jìn)行勃起誘導(dǎo)實(shí)驗(yàn)，陰莖頭充血及末端陰莖出現(xiàn)記為1 次勃起，勃起次數(shù)≥1 次為陽(yáng)性，勃起次數(shù)為0 分為ED 大鼠[4]。將篩選出的21 只大鼠按照隨機(jī)數(shù)字表法分為老齡勃起功能正常大鼠組（正常組）、老齡ED 大鼠組（ED 組）和老齡ED 大鼠藥物干預(yù)組（干預(yù)組），干預(yù)組大鼠使用VIP 25 ng/kg 隔日腹腔注射，治療28 d[5]。

2.2 海綿體內(nèi)壓及平均動(dòng)脈壓（mean arterial pressure，MAP）測(cè)定 所有大鼠用戊巴比妥鈉（40 mg/kg）麻醉后沿腹正中線切口切開(kāi)，使用顯微器械暴露走形往陰莖方向的腹側(cè)海綿體神經(jīng)進(jìn)行電刺激，電刺激參數(shù)設(shè)定為：頻率20 Hz，寬度5 ms，電壓5 v，持續(xù)60 s，間隔休息時(shí)間5 min。同時(shí)將連接生理信號(hào)采集處理系統(tǒng)的22 號(hào)紫色輸液針置入陰莖海綿體內(nèi)，暴露同側(cè)頸動(dòng)脈置入PE-50 管以監(jiān)測(cè)MAP[6]。

2.3 組織免疫熒光染色法檢測(cè)大鼠陰莖海綿體vWF 表達(dá) 機(jī)能實(shí)驗(yàn)結(jié)束后獲取的陰莖海綿體組織用4%多聚甲醛固定過(guò)夜，石蠟包埋后切成5 μm 切片，脫蠟及乙醇脫水，枸櫞酸鈉進(jìn)行抗原修復(fù)后使用10%山羊血清37%濕盒內(nèi)封閉30 min，一抗4 ℃孵育過(guò)夜，二抗在37 ℃避光孵育1 h，加入DAPI 染色液室溫避光孵育10 min。防熒光淬滅封片劑封片后使用熒光顯微鏡觀察并記錄。

2.4 ELISA 法檢測(cè)海綿體組織cAMP 和NO 含量大鼠陰莖組織獲取后置于-80 ℃冰箱備用，臨用時(shí)在組織中加入9 倍體積的磷酸鹽緩沖溶液，勻漿后5000 r/min 離心15 min，獲取的上清液按試劑盒說(shuō)明書(shū)操作，測(cè)定cAMP 和NO 含量。

2.5 蛋白印跡法檢測(cè)陰莖海綿體組織PKA、eNOS、vWF 及VEGF 蛋白表達(dá) 大鼠陰莖海綿體組織粉碎后加入蛋白裂解試劑提取組織總蛋白，使用BCA 試劑進(jìn)行蛋白定量后將樣品與5×蛋白上樣緩沖液按4∶1 在冰上配置混合液體混勻后于100 ℃水浴鍋中煮沸10 min，冷卻后置于-20 ℃冰箱保存?zhèn)溆?。后續(xù)實(shí)驗(yàn)室時(shí)將等量蛋白加入聚丙烯酰胺凝膠上樣孔內(nèi)，以110 V 的恒壓電泳，當(dāng)溴酚藍(lán)進(jìn)入底部后進(jìn)行轉(zhuǎn)膜操作，以300 mA 電流轉(zhuǎn)膜80 min 至聚偏二氟乙烯（PVDF）印跡膜。PVDF 膜5%脫脂牛奶封閉1 h，一抗（PKA、eNOS、vWF、VEGF、β-actin 1∶1000）4 ℃孵育過(guò)夜，相應(yīng)二抗室溫下?lián)u床孵育2 h 后使用ECL發(fā)光液，使用Image J 分析條帶灰度值，以β-actin作為內(nèi)參，分析各目的蛋白相對(duì)表達(dá)水平。

2.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS 22.0 軟件分析所得數(shù)據(jù)，符合正態(tài)分布的計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，方差齊的數(shù)據(jù)使用單因素方差分析（one-way ANVOVA），P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 各組老齡大鼠勃起功能比較 正常組、ED 組及干預(yù)組大鼠各組間基礎(chǔ)ICP、MAP 比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。與正常組比較，ED 組Max ICP 與Max ICP/MAP 明顯降低（P＜0.01）；與ED 組比較，干預(yù)組Max ICP、Max ICP/MAP 增高（P＜0.05 或P＜0.01）。見(jiàn)表1。

表1 各組老齡大鼠勃起功能比較（）

表1 各組老齡大鼠勃起功能比較（）

注：正常組為老齡勃起功能正常大鼠；ED 組為老齡勃起功能障礙大鼠；干預(yù)組為老齡勃起功能障礙大鼠使用血管活性腸多肽腹腔注射；Base ICP 為基礎(chǔ)陰莖海綿體內(nèi)壓；Max ICP 為陰莖海綿體內(nèi)壓最大值；MAP 為平均動(dòng)脈壓；1 mmHg=0.133 kPa；與正常組比較，aP＜0.01；與ED 組比較，bP＜0.05，cP＜0.01

3.2 各組小鼠陰莖海綿體組織vWF 表達(dá)比較 免疫熒光結(jié)果顯示，正常組紅色熒光表達(dá)明亮，ED 組與正常組比較，紅色熒光明顯減弱。干預(yù)組與ED 組比較，紅色熒光明顯增加。同時(shí)ED 組中，海綿竇充血間隙空間減少，而VIP 治療后間隙增加，見(jiàn)圖1。

圖1 熒光顯微鏡觀察各組大鼠陰莖海綿體組織vWF 蛋白熒光強(qiáng)度表達(dá)（×100）

3.3 各組大鼠陰莖海綿體組織cAMP 和NO 表達(dá)量比較 與正常組比較，ED 組大鼠陰莖海綿體組織上清液cAMP 與NO 含量降低（P 均＜0.05）。與ED 組比較，干預(yù)組cAMP 明顯升高（P＜0.01），同時(shí)NO 升高（P＜0.05）。見(jiàn)表2。

表2 各組大鼠陰莖海綿體cAMP 和NO 表達(dá)水平比較（）

表2 各組大鼠陰莖海綿體cAMP 和NO 表達(dá)水平比較（）

注：正常組為老齡勃起功能正常大鼠；ED 組為老齡ED 大鼠；干預(yù)組為老齡ED 大鼠使用血管活性腸多肽腹腔注射；cAMP 為環(huán)磷酸腺苷；NO 為一氧化氮；ED 為勃起功能障礙；與正常組比較，aP＜0.01；與ED 組比較，bP＜0.05，cP＜0.01

3.4 各組大鼠陰莖海綿體組織PKA、eNOS、vWF 及VEGF 蛋白表達(dá)比較 與正常組比較，ED 組PKA、vWF 及VEGF 蛋白表達(dá)量顯著降低（P＜0.01）；eNOS蛋白表達(dá)降低（P＜0.05）。與ED 組比較，干預(yù)組PKA、eNOS、VEGF 蛋白表達(dá)增加（P＜0.05）；vWF 蛋白表達(dá)顯著升高（P＜0.01）。見(jiàn)圖2 和表3。

圖2 各組大鼠陰莖海綿體組織PKA、eNOS、vWF、VEGF 表達(dá)注：正常組為老齡勃起功能正常；ED 組為老齡ED 大鼠；干預(yù)組為老齡ED 大鼠使用血管活性腸多肽腹腔注射

表3 各組大鼠陰莖海綿體PKA、eNOS、vWF、VEGF 蛋白表達(dá)水平比較（）

表3 各組大鼠陰莖海綿體PKA、eNOS、vWF、VEGF 蛋白表達(dá)水平比較（）

注：正常組為老齡勃起功能正常大鼠；ED 組為老齡ED 大鼠；干預(yù)組為老齡ED 大鼠使用血管活性腸多肽腹腔注射；PKA 為蛋白激酶A；eNOS 為內(nèi)皮源性一氧化氮合酶；vWF 為血管性血友病因子；VEGF 為血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子；β-actin 為β-肌動(dòng)蛋白；ED 為勃起功能障礙；與正常組比較，aP＜0.05，bP＜0.01；與ED 組比較，cP＜0.05，dP＜0.01

4 討論

衰老所致的陰莖海綿體內(nèi)皮細(xì)胞損傷是導(dǎo)致ED 的主要病因之一，血管新生能力減弱伴隨者內(nèi)皮細(xì)胞的功能及數(shù)量降低，導(dǎo)致eNOS 表達(dá)減弱，從而導(dǎo)致NO 生成不足，平滑肌舒張能力減弱誘發(fā)ED[7-8]。VIP 勃起神經(jīng)遞質(zhì)通過(guò)與陰莖海綿體平滑肌細(xì)胞膜上的G-蛋白偶聯(lián)受體結(jié)合，活化腺苷酸環(huán)化酶后使三磷酸腺苷轉(zhuǎn)化為cAMP，特異性激活PKA 后陰莖充血勃起。近年來(lái)研究表明，VIP 在大鼠陰莖海綿體的表達(dá)與大鼠年齡差異無(wú)關(guān)[9]，并且能夠通過(guò)非雄激素依賴(lài)的通路參與海綿體平滑肌松弛與勃起[3]，男性ED 患者陰莖海綿體注射VIP 聯(lián)合酚妥拉明能夠顯著改善ED[10]，但是其治療機(jī)制尚未明確。

ICP 檢測(cè)結(jié)果表明，對(duì)老齡ED 大鼠腹腔注射VIP 后大鼠陰莖海綿體內(nèi)壓增高，表明血管擴(kuò)張后流入陰莖海綿體內(nèi)的充血量及壓力增加，側(cè)面反映出大鼠勃起功能障礙得到改善。陰莖內(nèi)皮細(xì)胞功能減退影響血管張力，vWF 主要來(lái)源于內(nèi)皮細(xì)胞，是其重要的生物標(biāo)志物。本研究結(jié)果表明，VIP 干預(yù)后vWF的熒光強(qiáng)度及海綿竇間隙明顯增加，表明VIP 干預(yù)后陰莖海綿體內(nèi)皮細(xì)胞數(shù)量顯著增加。陰莖海綿體內(nèi)VEGF 蛋白表達(dá)隨著機(jī)體衰老而減少，而VEGF作為一種強(qiáng)效血管生成因子與通透因子，其與血管的生成密切相關(guān)。此外動(dòng)物研究證據(jù)表明，VEGF 不僅可以促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞的生成，同時(shí)能夠激活eNOS 生成NO[11]，因此VEGF 調(diào)控的血管生成是改善老齡ED 的重要機(jī)制。VIP 腹腔注射能夠促進(jìn)老年ED 陰莖海綿體內(nèi)VEGF 的表達(dá)，熒光結(jié)果顯示vWF 增加，提示應(yīng)用VIP 后陰莖海綿體內(nèi)血管再生的同時(shí)伴隨著內(nèi)皮細(xì)胞的增生。

老年ED 大鼠海綿體內(nèi)皮細(xì)胞減少后eNOS 蛋白表達(dá)量亦明顯降低，當(dāng)VIP 治療后eNOS 蛋白表達(dá)量增加，同時(shí)cAMP 與NO 的表達(dá)增加。因此，VIP可能通過(guò)VEGF 促進(jìn)大鼠陰莖海綿體血管以及內(nèi)皮細(xì)胞的生成，而內(nèi)皮細(xì)胞來(lái)源的eNOS 生成的NO 增加是導(dǎo)致陰莖海綿體內(nèi)灌注及海綿體內(nèi)壓恢復(fù)的重要機(jī)制。VIP 能夠激活cAMP/PKA 信號(hào)通路促進(jìn)VEGF 介導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞增殖，從而促進(jìn)局灶性腦缺血的血管生成[12]。本研究中老齡ED 大鼠陰莖海綿體低表達(dá)的cAMP 與PKA 被VIP 逆轉(zhuǎn)，因此VIP 能調(diào)節(jié)大鼠陰莖海綿體cAMP/PKA 信號(hào)通路從而促進(jìn)VEGF 表達(dá)以及海綿體內(nèi)血管增生，促進(jìn)eNOS 表達(dá)釋放NO 進(jìn)而修復(fù)勃起功能。

綜上所述，VIP 能夠有效改善老齡大鼠的勃起功能，其作用機(jī)制可能通過(guò)調(diào)控cAMP/PKA 通路以及改善陰莖海綿體內(nèi)皮功能有關(guān)。