Nrf2-GPX4 信號通路與冠心病患者相關(guān)性研究

邢布點，李 輝，強甜甜，魏 婷，盧園園，康品方，張寧汝

（1.蚌埠醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院心內(nèi)科，安徽 蚌埠 233000；2.蚌埠醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院心腦血管疾病基礎(chǔ)與臨床重點實驗室，安徽 蚌埠 233000；3.蚌埠醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院眼科，安徽 蚌埠 233000；4.蚌埠醫(yī)學(xué)院附屬蚌埠市第三人民醫(yī)院，安徽 蚌埠233000）

冠心病（coronary heart disease，CHD）是主要是由于冠狀動脈狹窄或者供血不足，繼而引發(fā)心肌供氧和血供應(yīng)不足、心肌血管耗氧急劇增加，最終導(dǎo)致心肌壞死［1-3］。流行病學(xué)調(diào)查結(jié)果表明，CHD 嚴重危害人類生命健康，并呈現(xiàn)年輕化、發(fā)病率逐年上升的趨勢［4］。

谷胱甘肽過氧化物酶4（glutathione peroxidase4，GPX4）是一種重要的抗氧化酶，能夠?qū)⒅|(zhì)ROS 還原為無毒的脂質(zhì)醇，減少脂質(zhì)過氧化，有效預(yù)防了細胞的氧化應(yīng)激，從而抑制了鐵死亡進程［5］。近期研究發(fā)現(xiàn)GPX4 介導(dǎo)的鐵死亡與CHD 有著密切的聯(lián)系［6］。Nrf2 抗氧化劑是細胞氧化應(yīng)激和鐵死亡重要的信號通路［7，8］。近年來相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)，激活Nrf2 可通過促進GPX4 的表達進而抑制鐵死亡［9，10］。而目前Nrf2-GPX4 信號通路介導(dǎo)的鐵死亡在CHD中的發(fā)病機制尚不明確。本研究擬通過檢測Nrf2及GPX4 水平，分析其與冠狀動脈狹窄程度不同CHD 病人的關(guān)系，為CHD 診斷治療提供新依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 材料試劑

Nrf2 抗體（貨號：12721S；產(chǎn)地：美國CST）、GAPDH 抗體（貨號：5174；產(chǎn)地：美國CST）；ELISA 檢測試劑盒：HumanNrf2（上海羽朵）、HumanGPX4（上海羽朵）

1.2 研究對象

收集2020 年6 月～2022 年6 月我院540 例疑診CHD 患者，平均（64.52±9.66）歲，根據(jù)CHD 診斷指南［11］，以任意一支主要冠脈狹窄≥50%即可診斷為CHD。其中，360 例明確診斷為CHD，冠狀動脈造影無異常180 例患者納入CON 組。入選患者均簽署知情同意書。所有入選患者均排除既往有心肌炎、心肌病、惡性腫瘤類疾病、風(fēng)濕免疫系統(tǒng)疾病、內(nèi)分泌及代謝性疾病及感染性疾病［12］。入選患者均簽署知情同意書，研究方案獲得本院倫理委員會批準（2019KY023）。

1.3 方法

1.3.1 標本采集 所有患者入院后空腹過夜后，抽取外周靜脈血10 mL，置于肝素抗凝管中，3 000 r/min 離心10 min 后吸取上清，并于-80 ℃下冷凍保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2 ELISA 檢測患者血清中Nrf2、GPX4 水平采用 HumanNrf2、GPX4（上海羽朵）檢測受試者血清中Nrf2、GPX4 的表達水平，嚴格按說明書進行操作。

1.3.3 Western blot 檢測Nrf2-GPX4 信號通路在CHD 組和CON 組中的Nrf2 蛋白的表達 提取PBMCS 中總蛋白，依據(jù)BCA 蛋白定量法，測定各組蛋白濃度，配置10%SDS-PAGE 電泳，PVDF 膜轉(zhuǎn)膜，抗體稀釋比：抗Nrf2 兔單克隆抗體1∶1 000、抗GAPDH 兔單克隆抗體1∶10 000；一抗二抗孵育；洗膜后ECL 發(fā)光液曝光，成像系統(tǒng)獲取圖像［13］。

1.3.4 統(tǒng)計學(xué)方法 組間比較采用t檢驗、卡方檢驗，應(yīng)用Pearson 分析法分析指標間的相關(guān)性，以上數(shù)據(jù)采用SPSS26.0 軟件分析。

2 結(jié)果

2.1 受試者一般資料和生化指標分析

與CON 組比較，CHD 組年齡、吸煙史、高血壓病史、糖尿病史、TG、LDL 均是升高的；而HDL 卻是降低的（P均＜0.05）；而兩組間性別比、BMI、WBC、AST、ALT、TC、和Scr 無明顯差異（P＞0.05），見表1。

表1 CON 組和CHD 組的一般資料和生化指標比較Tab 1 Comparison of general data and biochemical indexes between the CON group and the CHD group

2.2 CON 組和CHD 組受試者Nrf2、GPX4 以及Gensini 評分

與CON 組比較，CHD 組血清Nrf2、GPX4 活性水平均是降低的；而Gensini 評分卻是明顯增大的（P均＜0.05）。見表2。

表2 CON 組和CHD 組受試者Nrf2、GPX4 以及Gensini 評分比較(±s）Tab 2 Comparison of Nrf2，GPX4 and Gensini scores between the CON group and the CHD group(±s）

表2 CON 組和CHD 組受試者Nrf2、GPX4 以及Gensini 評分比較(±s）Tab 2 Comparison of Nrf2，GPX4 and Gensini scores between the CON group and the CHD group(±s）

指標CON 組CHD 組tP Nrf2（pg/mL）281.43±40.75 236.08±36.95-10.592 0.000 GPX4（ng/mL）76.17±11.62 35.36±4.65-13.272 0.000 Gensini 評分23.40±14.16 56.24±24.41 11.242 0.000

2.3 CON 組和CHD 組受試者（各90 例）PBMCS中Nrf2 蛋白表達水平

CHD 組Nrf2（0.25±0.05）蛋白表達水平較CON 組（0.87±0.16）是呈下調(diào)趨勢的（P＜0.05），見圖1、2。

圖1 CON 組和CHD 組患者PBMCs 中蛋白條帶Fig 1 Protein bands in PBMCs of patients in the CON and CHD groups

圖2 兩組PBMCs 中蛋白表達量相對大小Fig 2 Relative magnitude of protein expression in PBMCs of two groups of patients

2.4 Nrf2、GPX4 與Gensini 評分以及血液指標的相關(guān)性

經(jīng)Pearson 相關(guān)性分析：血清Nrf2、GPX4 水平與Gensini 評分負相關(guān)（Nrf2：r=-0.347，P＜0.001；GPX4：r=-0.423，P=0.001）；Nrf2、GPX4 與TG負相關(guān)（Nrf2：r= - 0.284，P＜0.001；GPX4：r=-0.275，P=0.001）；Nrf2 和GPX4 水平與 LDL 呈負相關(guān)（Nrf2：r= - 0.418，P＜0.05；GPX4：r=-0.426，P＜0.05）；Nrf2 和GPX4 水平與HDL 呈正相關(guān)（Nrf2：r=0.318，P＜0.05；GPX4：r=0.428，P＜0.05）；Nrf2 與GPX4 呈正相關(guān)（r=0.456，P＜0.01）。見表3。

表3 血清Nrf2 及GPX4 活性水平與 Gensini 評分以及血液指標的相關(guān)性分析Tab 3 Correlation analysis of serum Nrf2 and GPX4 activity levels with Gensini scores and blood indexes

3 討論

CHD 是臨床上最常見、最主要的疾病，主要由冠脈粥樣硬化介導(dǎo)的管腔狹窄或堵塞所導(dǎo)致，且隨著冠脈病變的加重，從而更容易造成冠狀動脈的狹窄或者供血不足，最終引起心肌功能障礙［14，15］。迄今為止，CHD 發(fā)病機制尚未明確。CHD 高致殘率與致死率的特點，給患者的生命安全與生活質(zhì)量造成影響。因而，深入地研究CHD 發(fā)生機理，有助于CHD 的診療及早期預(yù)防。

研究表明，血脂異常為CHD 發(fā)生的一種重要危險因素［16］。已有相關(guān)研究指出，高TG 血癥、高LDL 血癥、低HDL 血癥與CHD 的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)，且通過改善患者血脂水平，有利于緩解CHD癥狀，促進病情轉(zhuǎn)歸［17，18］。在本次研究中，CHD 組TG、LDL 明顯高于CON 組，而HDL 水平卻是降低的，考慮機制可能與血脂異常致動脈粥樣硬化有關(guān)。

鐵死亡是非凋亡的細胞死亡的一種形式，依賴于鐵元素的脂質(zhì)活性氧（ROS）的積累。脂質(zhì)ROS在細胞內(nèi)的不斷堆積，引發(fā)細胞內(nèi)的氧化應(yīng)激反應(yīng)，逐步誘發(fā)細胞的鐵死亡［19］。近年來多項研究表明［20，21］，鐵死亡與CHD 密切相關(guān)。

GPX4 是一種選擇性中和脂質(zhì)氫過氧化物的硒酶，被認為是鐵死亡的重要內(nèi)源性調(diào)節(jié)劑。有研究表明［22］，抑制GPX4 的活性，其催化的還原反應(yīng)不能代謝過氧化脂質(zhì)，脂質(zhì)過氧化產(chǎn)生的Fe2+和ROS 的不斷積累最終導(dǎo)致鐵死亡。鑒于GPX4 在鐵死亡進程中的起著重要作用，其成為鐵死亡調(diào)控因子的研究熱門。Meng 等［23］在糖尿病動脈粥樣化小鼠模型中觀察到，GPX4 活性降低引起脂質(zhì)過氧化，繼而引起鐵死亡，促進了動脈粥樣硬化的發(fā)展，而鐵死亡抑制劑通過增加GPX4 活性，減少脂質(zhì)活性氧的生成，進而減緩了動脈粥樣硬化的發(fā)展，該現(xiàn)象表明GPX4 活性可能與可能與心肌缺血性疾病CHD 有潛在聯(lián)系。FENG 等［24］研究發(fā)現(xiàn)，鐵死亡抑制劑通過增加GPX4 活性，減少了脂質(zhì)活性氧的生成，繼而保護大鼠心臟減輕缺血性損傷。此外，Li 等［25］通過實驗發(fā)現(xiàn)，恢復(fù)GPX4 活性水平，能夠抑制鐵死亡，繼而可保護小鼠心肌免受缺血再灌注損傷。近期臨床實驗研究發(fā)現(xiàn)，ACS 患者GPX4 活性水平明顯低于非ACS 病人［6］。這與本此研究結(jié)果相類似，本研究發(fā)現(xiàn)相較于CON 組，CHD 患者GPX4 活性水平是降低的，提示GPX4 可能參與了CHD 的發(fā)生、發(fā)展。

Nrf2 作為鐵死亡主要調(diào)節(jié)因子，其不僅是氧化應(yīng)激反應(yīng)和鐵死亡的參與者，同時也是氧化應(yīng)激反應(yīng)和鐵死亡過程的調(diào)控者。Nrf2 調(diào)控著與鐵死亡相關(guān)的酶和蛋白質(zhì)如GPX4［9］。Yu 等［26］通過研究發(fā)現(xiàn)，抑制Nrf2 可通過下調(diào)GPX4 表達，增加了鐵死亡，進而促進了小鼠動脈粥樣硬化的形成，而鐵死亡抑制劑可通過激活Nrf2，增加GPX4 表達，使鐵死亡進程受抑制，繼而抑制了小鼠動脈粥樣硬化的形成，該現(xiàn)象表明Nrf2-GPX4 信號通路介導(dǎo)的鐵死亡可能與CHD 有潛在的聯(lián)系。據(jù)報道，柚皮素可以通過調(diào)節(jié)大鼠體內(nèi)Nrf2-GPX4 信號通路，抑制鐵死亡，減輕心肌缺血性損傷［27］。陳玉等［10］通過實驗觀察到，激活Nrf2-GPX4 信號通路，能夠抑制鐵死亡，減輕了大鼠心肌缺血性損傷。本研究結(jié)果顯示，較CON 組相比，CHD 組患者血清Nrf2 活性水平是明顯降低的，此外，本研究完善了PBMCS 中Nrf2 蛋白濃度的測定，WB 蛋白濃度變化趨勢與ELISA 結(jié)果一致，繆瑩［28］也報道了類似結(jié)果。Pearson 相關(guān)分析顯示，CHD 患者血清Nrf2 與GPX4 呈正相關(guān)關(guān)系，而其作用機制可能通過氧化應(yīng)激和鐵死亡相互聯(lián)系，從而可能參與了CHD 的發(fā)生、發(fā)展。

Gensini 評分是評估冠脈狹窄嚴重程度的有效方法，分值越高，提示冠脈狹窄越嚴重［29］。本次研究發(fā)現(xiàn)，Nrf2 和GPX4 與Gensini 評分均呈負相關(guān)，這一結(jié)果提示Nrf2-GPX4 信號通路介導(dǎo)的鐵死亡與CHD 病變程度有關(guān)，對于評價CHD 患者嚴重性具有一定的積極意義。

綜上所述，與CON 組比較，CHD 組血清Nrf2與GPX4 活性水平是降低的，Nrf2 與TG、LDL、以及GPX4 水平之間呈正相關(guān)，Nrf2 和GPX4 分別與HDL 呈負相關(guān)，且Nrf2 和GPX4 與Gensini 評分均呈負相關(guān)。因此，Nrf2-GPX4 信號通路介導(dǎo)的鐵死亡對于判斷冠脈病變程度及CHD 的發(fā)病機制具有一定的參考價值。本研究存在以下不足：納入樣本量少、數(shù)據(jù)誤差不可避免，因此，本文結(jié)果還需大規(guī)模多中心研究進一步驗證。

作者貢獻度說明：

邢布點：數(shù)據(jù)分析、文章撰寫工作；強甜甜、魏婷、盧園園：收集數(shù)據(jù)，負責(zé)相關(guān)實驗操作；李輝、康品方、張寧汝：設(shè)計實驗，指導(dǎo)寫作。

作者聲明不存在利益沖突關(guān)系。