煙曲霉暴露對(duì)哮喘大鼠氣道微環(huán)境的影響及藥物干預(yù)的作用

周霞 杜春玲

支氣管哮喘(簡(jiǎn)稱哮喘)是一種以氣道高反應(yīng)性為特征的慢性氣道炎癥性疾病,氣道微環(huán)境改變可能適合煙曲霉定植,而后者又是炎癥慢性化的主要原因[1]。氣道黏液纖毛系統(tǒng)發(fā)揮作用依賴適宜的微環(huán)境。研究發(fā)現(xiàn),囊性纖維化患者氣道氯離子分泌及鈉離子吸收引起纖毛層厚度減少和粘液分泌增加,導(dǎo)致氣道防御受損,有利于細(xì)菌生長(zhǎng)及炎癥爆發(fā)[2]。纖毛層含有黏蛋白[3],煙曲霉暴露可上調(diào)哮喘氣道MUC5AC表達(dá),有利于曲霉粘附定植[4]。研究還發(fā)現(xiàn)氣道pH值是上皮屏障和先天防御的重要決定者[5]。然而,對(duì)哮喘、真菌定植與氣道微環(huán)境的關(guān)系研究較少,藥物對(duì)氣道微環(huán)境的影響也不明確。因此,本研究主要觀察糖皮質(zhì)激素、抗生素對(duì)哮喘氣道微環(huán)境及煙曲霉孢子清除力的影響。

資料與方法

一、材料

1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

Wistar大鼠購(gòu)于上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限責(zé)任公司,SPF級(jí)雄性,體重180～200g,實(shí)驗(yàn)前于復(fù)旦大學(xué)醫(yī)學(xué)院動(dòng)物房適應(yīng)性飼養(yǎng)一周,恒溫環(huán)境(23℃),相對(duì)濕度(40%),12小時(shí)晝夜,自由進(jìn)食和取水,并觀察生長(zhǎng)情況。動(dòng)物飼養(yǎng)及實(shí)驗(yàn)方案均嚴(yán)格按照復(fù)旦大學(xué)動(dòng)物倫理委員會(huì)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)規(guī)范執(zhí)行(SYXK2014-0029)。

2 煙曲霉菌株

AF293煙曲霉標(biāo)準(zhǔn)株為復(fù)旦大學(xué)附屬華山醫(yī)院真菌室保存菌株饋贈(zèng)。由肺曲霉菌病患者臨床痰液標(biāo)本中分離并鑒定而得。

3 主要試劑

卵白蛋白(Grade V,美國(guó)Sigma公司),氫氧化鋁(美國(guó)Sigma公司),乙酰甲膽堿(美國(guó)Sigma公司),注射用地塞米松磷酸鈉注射液(馬鞍山豐原制藥),注射用頭孢曲松鈉(悅康藥業(yè)集團(tuán)有限公司),BCA蛋白測(cè)定試劑盒(江蘇碧云天生物技術(shù)有限公司),乳酸脫氫酶試劑盒(南京建成生物工程研究所);馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基(上海盛思公司),易氟烷(美國(guó)百特公司),戊巴比妥鈉(德國(guó)默克公司)。

4 主要儀器設(shè)備

壓縮式霧化器(型號(hào)AG CLASSIC,飛利浦公司),血?dú)狻㈦娊赓|(zhì)生化分析儀(型號(hào)cobas b 221,羅氏診斷產(chǎn)品上海有限公司),組織勻漿機(jī)(型號(hào)Tissuelyser-24,上海凈信公司)。

二、動(dòng)物分組及干預(yù)方案

40只雄性Wistar大鼠隨機(jī)分為5組,每組8只。1)空白對(duì)照組;2)單純哮喘組;3)哮喘+孢子組;4)地塞米松組;5)頭孢曲松組(見(jiàn)表1)。

表1 動(dòng)物分組及干預(yù)方法(n=8)

三、哮喘模型的建立

根據(jù)我們前期的研究方案造模[6]:單純哮喘組和哮喘+孢子組于實(shí)驗(yàn)第1、8天給予OVA懸液腹腔注射致敏(1 mL/只,1 mg OVA+100 mg氫氧化鋁溶于1 mL無(wú)菌生理鹽水中,現(xiàn)配現(xiàn)用);第15天起,將大鼠置于透明密閉霧化箱(20cm×40cm×50cm)中給予連續(xù)6周的1% OVA懸液霧化吸入以激發(fā)哮喘(每周5次,每次30 min)?？瞻讓?duì)照組予生理鹽水致敏、激發(fā)作為對(duì)照處理。

四、藥物干預(yù)方法

1 地塞米松組和頭孢曲松組哮喘模型建立同單純哮喘組。地塞米松組于1% OVA激發(fā)期間給予每周3次(每周一、三、五,霧化前30分鐘),0.5 mg/kg 地塞米松腹腔注射;頭孢曲松組于1% OVA激發(fā)期間給予每周3次(每周一、三、五,霧化前30分鐘),50 mg/kg頭孢曲松鈉腹腔注射。

2 煙曲霉孢子滴鼻:第57天起,哮喘+孢子組、地塞米松組、頭孢曲松組于異氟烷麻醉后垂直位放置,用移液槍吸取100 μL 1.0×107/mL 煙曲霉孢子懸液緩慢滴入每側(cè)鼻腔,連續(xù)3天;空白對(duì)照組、單純哮喘組給予生理鹽水滴鼻作為對(duì)照。

五、標(biāo)本收集

腹腔注射2 %戊巴比妥鈉麻醉大鼠后腹主動(dòng)脈取血,3000 rpm/min(有效離心半徑為10 cm),4℃,離心15 min,取上清于-80 ℃凍存。結(jié)扎右肺根部后氣管插管并固定,使用無(wú)菌PBS行左肺肺泡灌洗,3次共10 mL,肺泡灌洗液(BALF)于1000 rpm/min(有效離心半徑為10 cm),4℃,離心10 min,取上清于-80 ℃凍存。取右肺上葉迅速置入4 %多聚甲醛中固定、脫水、石蠟包埋,5 μm厚切片。

六、指標(biāo)檢測(cè)

全血和BALF收集后(0～4℃ 保存)取2 mL立即使用羅氏血?dú)夥治鰞x測(cè)定pH值和電解質(zhì)濃度。按BCA蛋白測(cè)定試劑盒說(shuō)明書(shū)檢測(cè)血清和BALF中總蛋白質(zhì)含量。根據(jù)試劑盒說(shuō)明書(shū),使用微板法測(cè)定BALF和血清中乳酸脫氫酶(LDH)活力。

七、煙曲霉菌定植的觀察

取大鼠肺組織的相同部位,稱重、勻漿(100 mg/mL PBS,置于無(wú)菌EP管中)。取肺組織勻漿液和BALF各100 μL均勻涂于加有雙抗的PDA培養(yǎng)基,37 ℃培養(yǎng)24 h后肉眼觀察菌落形成。

八、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

結(jié) 果

一、各組大鼠血和BALF中pH值、電解質(zhì)水平的比較

空白對(duì)照組、單純哮喘組、哮喘+孢子組三組比較,單純哮喘組血和BALF K+水平較空白對(duì)照組無(wú)顯著變化(P>0.05),而哮喘+孢子組血K+水平較空白對(duì)照組明顯降低[(6.50±0.59)mmol/Lvs(8.00±0.92) mmol/L,P=0.003],同時(shí)BALF K+水平明顯升高[(2.39±0.38)mmol/Lvs(1.87±0.27)mmol/L,P=0.009]。哮喘+孢子組大鼠血中K+水平較單純哮喘組有所降低[(6.50±0.59 )mmol/Lvs(7.70±1.35)mmol/L,P=0.052]、BALF中K+水平有所上升[(2.39±0.38)mmol/Lvs(2.04±0.19)mmol/L,P=0.053],血和BALF二者間的K+濃度差在哮喘+孢子組和單純哮喘組間比較具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P=0.025)。哮喘+孢子組、地塞米松組、頭孢曲松組三組比較,地塞米松組和頭孢曲松組血和BALF中K+水平較哮喘+孢子組無(wú)明顯改變。各組大鼠血和BALF中的pH值、Na+、Cl-、Ca2+(BALF中Ca2+檢測(cè)均大于上限)水平無(wú)顯著性差異(見(jiàn)表2,3)。

表2 各組大鼠血中電解質(zhì)含量和pH值的比較

表3 各組大鼠BALF中電解質(zhì)含量和pH值的比較

二、各組大鼠血清和BALF中總蛋白、LDH活力的比較

空白對(duì)照組、單純哮喘組、哮喘+孢子組三組比較,單純哮喘組血清和BALF中總蛋白水平較空白對(duì)照組無(wú)顯著變化(P>0.05),而哮喘+孢子組血清和BALF蛋白水平均較空白對(duì)照組明顯升高[血清(1987.96±139.41) mg/mLvs(1633.34±292.23) mg/mL,P=0.035;BALF (8.92±0.75) mg/mLvs(5.83±1.21) mg/mL,P<0.001]。哮喘+孢子組血清和BALF中的總蛋白含量較單純哮喘組均明顯增加[血清(1987.96±139.41 ) mg/mLvs(1634.53±210.71) mg/mL,P=0.014;BALF (8.92±0.75) mg/mLvs(4.66±1.38) mg/mL,P<0.001]。哮喘+孢子組、地塞米松組、頭孢曲松組三組比較,頭孢曲松組血清和BALF中的總蛋白含量較哮喘+孢子組均明顯減少[血清(1743.46±187.09) mg/mLvs(1987.96±139.41) mg/mL,P=0.047;BALF (4.94±1.72) mg/mLvs(8.92±0.75) mg/mL,P=0.002],而地塞米松組較哮喘+孢子組無(wú)顯著變化。各組間血清LDH活力無(wú)顯著性差異,BALF中檢測(cè)不到LDH活性(見(jiàn)表4)。

表4 各組大鼠血和BALF中總蛋白含量以及LDH活性的比較

三、各組大鼠肺組織煙曲霉培養(yǎng)的觀察

PDA培養(yǎng)結(jié)果顯示,空白對(duì)照組、單純哮喘組肺組織勻漿和BALF培養(yǎng)均未見(jiàn)煙曲霉菌落形成,哮喘+孢子組、地塞米松組、頭孢曲松組肺組織勻漿煙曲霉陽(yáng)性率分別為50%(4/8)、100%(7/7)、50%(4/8),BALF煙曲霉陽(yáng)性率分別為50%(4/8)、57%(4/7)、50%(4/8)(見(jiàn)表5和圖1)。

表5 肺組織勻漿、BALF煙曲霉培養(yǎng)陽(yáng)性率(n=8)

圖1 各組大鼠肺組織、BALF煙曲霉培養(yǎng)的觀察

討 論

在世界范圍內(nèi),約18%～50%的家庭存在室內(nèi)真菌暴露,主要為煙曲霉菌和青霉菌,真菌暴露與哮喘發(fā)病及急性加重有著明確的因果關(guān)系[7]。煙曲霉菌是一種廣泛存在于環(huán)境中的重要的條件致病菌,其微小的孢子結(jié)構(gòu)使之吸入后易于達(dá)到宿主肺泡,通過(guò)菌絲生長(zhǎng)而定植于氣道內(nèi)或引發(fā)侵襲性感染[8]。不合理使用抗生素、糖皮質(zhì)激素引起的生態(tài)紊亂和免疫抑制是誘發(fā)機(jī)會(huì)性真菌感染的重要因素[9-10],而真實(shí)世界研究表明抗生素使用對(duì)哮喘加重患者有益的證據(jù)非常有限[11-13]。在本研究中,我們發(fā)現(xiàn)地塞米松組肺組織勻漿(100%)和BALF(57%)的煙曲霉培養(yǎng)陽(yáng)性率明顯增加,頭孢曲松組肺組織勻漿煙曲霉菌落形成數(shù)量也明顯高于哮喘+孢子組,表明糖皮質(zhì)激素和抗生素使用增加了哮喘大鼠真菌感染的風(fēng)險(xiǎn)。但是,哮喘+孢子組肺組織勻漿和BALF煙曲霉陽(yáng)性率也各達(dá)50%,這可能與哮喘慢性氣道炎癥所致上皮細(xì)胞損傷脫落以及基底膜暴露等病理變化有助于煙曲霉孢子在氣道內(nèi)粘附以及肺內(nèi)滯留有關(guān)[1]。

氣道微環(huán)境穩(wěn)態(tài)(酸堿穩(wěn)態(tài)、離子濃度穩(wěn)態(tài)、葡萄糖穩(wěn)態(tài)等)對(duì)發(fā)揮氣道正常粘液纖毛清除功能及抗菌效應(yīng)至關(guān)重要。本研究中,我們發(fā)現(xiàn)煙曲霉暴露使哮喘大鼠血中的K+濃度降低,肺泡灌洗液中的K+濃度升高,既往研究也發(fā)現(xiàn)哮喘患者低鉀血癥發(fā)生率(28.6%)明顯高于肺炎對(duì)照組(7.3%)[14]。此外,還有研究發(fā)現(xiàn),哮喘患者下呼吸道浸潤(rùn)的T細(xì)胞中鉀離子通道Kv1.3高表達(dá),其選擇性抑制劑可減少哮喘大鼠Th2型細(xì)胞因子的產(chǎn)生[15]。煙曲霉暴露造成哮喘大鼠血鉀降低的原因可能為哮喘大鼠過(guò)度通氣引起呼吸性堿中毒,血H+濃度降低使細(xì)胞內(nèi)H+轉(zhuǎn)移到細(xì)胞外,H+-K+交換又使K+進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)而引起轉(zhuǎn)移性低鉀血癥[16]。但在本研究中,煙曲霉暴露的哮喘大鼠其血液和氣道是否存在離子通道的開(kāi)放及鉀離子的流動(dòng),目前不明確,需進(jìn)一步探究。

本研究中還發(fā)現(xiàn)煙曲霉暴露使哮喘大鼠血清和BALF中總蛋白含量明顯升高,既往研究也顯示在暴露于組胺型介質(zhì)(白三烯、前列腺素、血小板活化因子、緩激肽)數(shù)分鐘后,人和豚鼠氣道表面液體中血漿蛋白的含量顯著增加[17],研究者們也提出了“血漿大分子滲出可能是氣道粘膜第一道防線的一部分”的理論[18-19]。氣道蛋白滲出也在一定程度上反映了肺泡毛細(xì)血管屏障功能障礙,頭孢曲松鈉在本研究中具有較好改善毛細(xì)血管通透性的作用,但考慮到其增加機(jī)會(huì)性感染的風(fēng)險(xiǎn),需權(quán)衡利弊后使用。

綜上所述,煙曲霉暴露、糖皮質(zhì)激素和抗生素使用改變了哮喘大鼠氣道微環(huán)境,增加了真菌氣道定植甚至肺內(nèi)感染的風(fēng)險(xiǎn)。但關(guān)于哮喘氣道微環(huán)境穩(wěn)態(tài)的確切調(diào)節(jié)機(jī)制(如鈉鉀泵的運(yùn)轉(zhuǎn)等)有待更深入的研究。