鹽堿脅迫對歐洲醋栗生理指標的影響

陳一鳴，裴 毅，李得萍，汪 融，王 楠，聶江力

（天津農(nóng)學院 園藝園林學院，天津 300384）

世界上大部分地區(qū)的植物都會受到不同程度土壤鹽堿化的影響，土壤鹽漬化以及次生鹽漬化是阻礙植物生長發(fā)育的非生物逆境之一[1]。鹽堿條件下的植株會出現(xiàn)建植困難、發(fā)黃萎蔫、生長緩慢以及品質與產(chǎn)量下降等問題[2]。歐洲醋栗（Ribes reclinatumL.）為虎耳草科、茶藨子屬植物，落葉灌木，又名鵝眉、燈籠果[3]，可露地越冬，抗寒性、抗病性強。作為第三代新興的漿果樹種，歐洲醋栗生長期短，結實早，果實富含氨基酸、蛋白質、維生素、糖類、有機酸以及多種礦質營養(yǎng)成分，具有很高的營養(yǎng)價值[4]。天津市存在大規(guī)模的鹽堿化土壤，探究歐洲醋栗對鹽堿脅迫條件的抗逆性為歐洲醋栗引種到天津地區(qū)栽植有很大幫助。學者們對各類植物的耐鹽堿性做了大量研究，但對于歐洲醋栗耐鹽堿性的研究還鮮有報道。為此，本文研究分析了NaCl 和NaHCO3脅迫對歐洲醋栗生理指標的影響，為歐洲醋栗耐鹽堿機理研究提供參考，并為天津地區(qū)鹽堿地大規(guī)模引種歐洲醋栗提供依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

試驗材料為歐洲醋栗（Ribes reclinatumL.）二年生植株，引自黑龍江省尚志市石頭河子鎮(zhèn)。

1.2 試驗方法

在天津農(nóng)學院園藝植物試驗基地中選取長勢基本相同的歐洲醋栗二年生植株進行盆栽試驗?；|配比為草炭∶珍珠巖∶蛭石= 2 ∶1 ∶1，花盆尺寸為外口直徑25.5 cm、高16.5 cm。共栽培50 盆，培養(yǎng)一段時間待其緩苗完成后，選取其中25盆長勢相同且良好的植株作為試驗材料。

1.2.1 氯化鈉中性鹽對歐洲醋栗生長的影響 參考張琳琳等[5]中性鹽和堿性鹽脅迫試驗的耐受閾值，以不添加任何脅迫處理為對照（CK），設置中性鹽（NaCl）50、100、150、200 mmol·L-15 個濃度梯度。每個處理重復3 次，以直接澆灌鹽溶液的方式進行。根據(jù)周晗等[6]所述，鹽脅迫處理在上午9：00—10：00 進行，每隔5 d 澆灌1 次，每次澆灌400 mL，對照（CK）以澆灌蒸餾水作為替代，如托盤中留有溶液則倒回花盆中，直至被完全吸收為止。15 d 后測定各處理下歐洲醋栗的生理指標。

1.2.2 碳酸氫鈉堿性鹽對歐洲醋栗生長的影響試驗方法同1.2.1，以不添加任何鹽處理為對照（CK），設置堿性鹽（NaHCO3）50、100、150、200 mmol·L-15 個濃度梯度，進行直接澆灌處理，每個處理重復3 次，每次在上午9：00—10：00進行，每隔5 d 澆灌1 次，每次澆灌400 mL，對照（CK）以澆灌蒸餾水作為替代，如托盤中有滲入溶液則倒回花盆中，直至被完全吸收為止，15 d 后取樣測定各處理歐洲醋栗的生理指標。

1.2.3 生理指標測定 在鹽脅迫15 d 后取葉片測定歐洲醋栗各項抗逆生理生化指標。葉綠素含量采用分光光度法測定[7]；丙二醛（MDA）含量采用硫代巴比妥酸（TBA）法測定；抗氧化酶系統(tǒng)中，超氧化物歧化酶（SOD）活性采用氯化硝基四氮唑藍（NBT）還原法測定[8]；過氧化物酶（POD）活性采用創(chuàng)愈木酚法測定[9]；過氧化氫酶（CAT）活性采用紫外吸收法測定。以上指標每個處理重復測定3 次。

1.3 數(shù)據(jù)分析與處理

利用Microsoft Office 2010 對歐洲醋栗各項指標進行數(shù)據(jù)整理以及圖表繪制，利用SPSS 22.0對歐洲醋栗所測得的各項性狀數(shù)據(jù)進行差異顯著性分析。

2 結果與分析

2.1 氯化鈉中性鹽對歐洲醋栗生理指標的影響

由圖1 可知，隨著NaCl 鹽濃度的增加，歐洲醋栗葉片內葉綠素含量呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢。在鹽濃度為50 mmol·L-1時，歐洲醋栗葉片內葉綠素含量比對照（CK）增加了3.73%，但兩者間不存在顯著性差異；在鹽濃度為100 mmol·L-1時，歐洲醋栗葉片內葉綠素含量顯著升高，相對于對照（CK）增加了36.57%，且顯著高于其他各處理；當鹽濃度達到150 mmol·L-1和200 mmol·L-1時，歐洲醋栗葉片內葉綠素含量明顯降低，已經(jīng)低于對照（CK），相對于對照（CK）分別降低了61.19%和79.10%；其中在鹽濃度為200 mmol·L-1時，歐洲醋栗葉片內葉綠素含量處于最低水平。

圖1 鹽脅迫對歐洲醋栗葉片葉綠素含量的影響

丙二醛（MDA）是膜脂過氧化的最終分解產(chǎn)物，是植物細胞膜質過氧化程度的體現(xiàn)，其含量可以反映植物遭受逆境傷害的程度。丙二醛含量高，說明植物細胞膜質過氧化程度高，細胞膜受到的傷害嚴重[10]。由圖2 可知，在鹽濃度為50 mmol·L-1和100 mmol·L-1時，歐洲醋栗植株葉片內丙二醛含量與對照（CK）無明顯差異，說明這兩個鹽脅迫處理下的歐洲醋栗葉片細胞膜并未受到損傷；當鹽濃度達到150 mmol·L-1時，歐洲醋栗葉片內丙二醛含量開始顯著升高；在鹽濃度為200 mmol·L-1時達到最高，相對于對照（CK）分別增加了37.50%和162.50%，這說明歐洲醋栗葉片細胞膜受損程度嚴重。

圖2 鹽脅迫對歐洲醋栗葉片丙二醛含量的影響

超氧化物歧化酶（SOD）作為植物體內超氧陰離子自由基的清除劑，能有效防止它們對植物機體的損害，參與植物在應對脅迫時所作出的各種生理生化反應，是植物體內很重要的一種抗氧化酶類[11]。由圖3 可知，隨著NaCl 鹽濃度的增加，歐洲醋栗葉片內SOD 活性呈現(xiàn)先升高后降低、再升高的趨勢。在鹽濃度為50 mmol·L-1和100 mmol·L-1之間時，歐洲醋栗葉片內SOD 活性無顯著差異，其他各處理之間差異顯著，對照（CK）歐洲醋栗葉片內SOD 活性最低；在鹽濃度為200 mmol·L-1時，歐洲醋栗葉片內SOD 活性達到最高。

圖3 鹽脅迫對歐洲醋栗葉片SOD 活性的影響

過氧化物酶（POD）是植物體內酶促防御系統(tǒng)的一種保護酶，能有效催化過氧化氫分解成水，從而有效阻止過氧化氫在植物體內的累積，排除其對植物細胞膜結構的潛在傷害[12]。由圖4可知，隨著NaCl 鹽濃度的增加，歐洲醋栗葉片內POD 活性呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢。在鹽濃度為50 mmol·L-1時達到最高，顯著高于對照（CK）；在鹽濃度為150 mmol·L-1時，與對照（CK）無明顯差異；在鹽濃度為200 mmol·L-1時，歐洲醋栗葉片內POD 活性則顯著低于對照（CK）。

圖4 鹽脅迫對歐洲醋栗葉片POD 活性的影響

過氧化氫酶（CAT）與過氧化氫具有較高的親和力，可以清除逆境條件下植株產(chǎn)生的過氧化氫，其含量變化是植物體內過氧化氫含量變化的映射[13]。由圖5 可知，隨著NaCl 鹽濃度的增加，歐洲醋栗葉片內CAT 含量呈現(xiàn)逐漸升高的趨勢，各鹽濃度處理下的歐洲醋栗葉片內CAT 活性均顯著高于對照（CK），其中在鹽濃度為50 mmol·L-1和100 mmol·L-1時，歐洲醋栗葉片內CAT 活性無顯著差異；在鹽濃度為150 mmol·L-1和200 mmol·L-1時，歐洲醋栗葉片內CAT 活性也無顯著差異，但后兩者的歐洲醋栗葉片內CAT 活性均顯著高于前兩者。

圖5 鹽脅迫對歐洲醋栗葉片CAT 活性的影響

2.2 碳酸氫鈉堿性鹽對歐洲醋栗生理指標的影響

由圖6 可知，在NaHCO3不同堿濃度處理下，歐洲醋栗葉片內葉綠素含量呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢，其中在堿濃度達到100 mmol·L-1時，葉片內葉綠素含量最高，顯著高于其他處理，相對于對照（CK）增加了33.58%；在堿濃度為50 mmol·L-1和150 mmol·L-1時，歐洲醋栗葉片內葉綠素含量與對照（CK）無明顯差異；在堿濃度達到200 mmol·L-1時，歐洲醋栗葉片內葉綠素含量最低，相對于對照（CK）降低了58.21%。

圖6 堿脅迫對歐洲醋栗葉片葉綠素含量的影響

由圖7 可知，隨著NaHCO3濃度的逐漸增加，歐洲醋栗葉片內丙二醛含量呈現(xiàn)逐漸升高的趨勢，表明葉片細胞膜受損程度逐漸嚴重。在堿濃度為50 mmol·L-1時，歐洲醋栗葉片內丙二醛含量比對照（CK）增加了42.86%，表現(xiàn)出顯著性差異；在堿濃度為100 mmol·L-1和150 mmol·L-1時，歐洲醋栗葉片內丙二醛含量無顯著差異，但均顯著高于對照（CK）；在堿濃度為200 mmol·L-1時，歐洲醋栗葉片內丙二醛含量最高，葉片細胞膜受損程度最嚴重。

圖7 堿脅迫對歐洲醋栗葉片丙二醛含量的影響

由圖8 可知，在NaHCO3不同濃度的堿脅迫處理下，歐洲醋栗葉片內SOD 活性相對于對照（CK）均有所增加，在堿濃度為200 mmol·L-1時的SOD 活性最高，相對于對照（CK）增加了62.65%；在堿濃度為100 mmol·L-1時的SOD 活性增幅最低，相對于對照（CK）僅增加了16.26%；在堿濃度為50 mmol·L-1和150 mmol·L-1時，歐洲醋栗葉片內SOD 活性未達到顯著差異。

圖8 堿脅迫對歐洲醋栗葉片SOD 活性的影響

由圖9 可知，隨著堿濃度的增加，歐洲醋栗葉片內POD 活性呈現(xiàn)先降低后升高、再降低的趨勢。在堿濃度為50 mmol·L-1時，歐洲醋栗葉片內POD 活性相對于對照（CK）降低了32.45%；在堿濃度為100 mmol·L-1時的POD活性最高，為對照（CK）的2.06 倍，且顯著高于其他堿處理；在堿濃度為150 mmol·L-1時的POD 活性次之，在堿濃度為200 mmol·L-1時，歐洲醋栗葉片內POD 活性與對照（CK）和堿濃度為50 mmol·L-1時的POD 活性無明顯差異。

圖9 堿脅迫對歐洲醋栗葉片POD 活性的影響

由圖10 可知，在NaHCO3堿性條件脅迫下，歐洲醋栗葉片內CAT 活性隨著堿濃度升高而逐漸升高，均顯著高于對照（CK），與各NaCl 鹽濃度處理的變化規(guī)律一致。在堿濃度為50 mmol·L-1和100 mmol·L-1之間時，歐洲醋栗葉片內CAT 活性無顯著差異，在堿濃度為150 和200 mmol·L-1時葉片CAT 活性無顯著差異；其中在堿濃度為200 mmol·L-1時，歐洲醋栗葉片內CAT 活性達到最高，是對照（CK）的3.71 倍，在堿濃度為150 mmol·L-1時次之，相對于對照（CK）增加了214.28%。

圖10 堿脅迫對歐洲醋栗葉片CAT 活性的影響

3 結論與討論

光合作用是植物體所需物質和能量的重要來源，植物通過光系統(tǒng)Ⅰ（PS Ⅰ）和光系統(tǒng)Ⅱ（PS Ⅱ）將光能轉化為化學能，提供自身生長所需營養(yǎng)物質。有研究表明，葉綠體是植物響應植物鹽堿脅迫最重要的細胞器之一[14]，此外還有研究發(fā)現(xiàn)植物光合作用的強弱可通過植物葉片葉綠素含量多少來表示[15]，同時可以通過葉片葉綠素含量的變化來分析植物在鹽堿脅迫條件下的生長情況，所以植物葉片葉綠素含量可作為植物耐鹽堿性的參考指標。本試驗在低鹽堿濃度50 mmol·L-1下，歐洲醋栗植株葉片中的葉綠素含量與對照（CK）相比無明顯差別；當鹽堿濃度升高到100 mmol·L-1時，歐洲醋栗葉片中的葉綠素含量也并未出現(xiàn)減少的情況，說明低濃度的鹽堿條件并不會對歐洲醋栗的生長產(chǎn)生影響，這可能是由于植物自身通過提高葉片中保護酶的活性來適應逆境條件；當鹽堿濃度達到150 mmol·L-1和200 mmol·L-1時，歐洲醋栗葉片中的葉綠素含量降低，這可能是由于光系統(tǒng)Ⅱ（PS Ⅱ）對逆境條件比較敏感，遇到較高鹽堿濃度時光合系統(tǒng)受到破壞，光合膜蛋白減少，葉綠素合成酶的活性遭到破壞，導致植物葉綠素合成下降，葉綠素含量降低[16]。

鹽堿脅迫對植物的影響還表現(xiàn)在對植物細胞膜透性的影響方面。植物處于逆境條件時，脂膜的過氧化作用會促進丙二醛的產(chǎn)生，因此可以通過丙二醛的含量分析脂膜過氧化程度，從而了解植物對逆境條件反應的強弱，探究其抗逆性[17]。本研究中，歐洲醋栗植株在不同濃度的鹽堿脅迫下，葉片丙二醛含量隨著鹽堿濃度的增加而遞增，在李會云和郭修武[18]的研究中發(fā)現(xiàn)在鹽脅迫條件下植物葉片中丙二醛含量隨著鹽濃度的增加而升高，孫明茂和劉麗霞[19]在對于百合苗的抗逆性研究中也發(fā)現(xiàn)，隨著Na2CO3處理濃度的增加，百合葉片中丙二醛含量也在逐漸升高，本研究與上述學者的研究結果一致。從歐洲醋栗的鹽脅迫試驗中發(fā)現(xiàn)，在低鹽濃度時，歐洲醋栗葉片內丙二醛含量并沒有升高，與對照（CK）并無明顯差異，這可能是由于低鹽濃度下，歐洲醋栗葉片的保護酶活性較強，可以清除其內部自由基。當鹽濃度增加到150 mmol·L-1時，鹽濃度超過了細胞保護酶的保護能力范圍，脂膜過氧化程度升高，細胞膜遭到破壞，歐洲醋栗葉片內丙二醛含量升高，這與趙風斌等[20]的研究結果一致。另外可以發(fā)現(xiàn)，在相同濃度的堿性脅迫條件和單鹽脅迫條件下，堿性脅迫條件下的歐洲醋栗葉片內丙二醛含量總是高于單鹽脅迫，說明堿脅迫逆境條件下，歐洲醋栗葉片細胞脂膜過氧化程度更高，損傷更大，其對堿脅迫的耐受性更差。

植物對鹽堿脅迫的響應包括細胞內抗氧化酶活性的改變。植物細胞內的氧自由基主要是通過抗氧化酶系統(tǒng)清除的，用于阻止細胞氧化損傷，適應逆境條件?？寡趸钢饕谐趸锲缁福⊿OD）、過氧化物酶（POD）、過氧化氫酶（CAT），在逆境條件時植物細胞通過提高這些抗氧化酶的活性來適應環(huán)境[21]。在鹽堿脅迫未超過植物耐受閾值時，植物自身可以通過增加SOD、POD、CAT 酶活性來消除逆境環(huán)境對植物的影響，從而使植物在逆境條件下生長，但鹽堿濃度一旦超過植物的耐受閾值，隨著鹽堿濃度的升高，這三種酶活性開始降低，氧自由基無法被清除，從而造成細胞膜的損傷，嚴重時導致植物死亡。三種酶發(fā)揮協(xié)同作用共同調節(jié)植物體內活性氧產(chǎn)生和清除之間的動態(tài)平衡[22]。

本研究中，低鹽濃度時歐洲醋栗葉片內MDA 含量并未增加，此時發(fā)揮主要作用的是歐洲醋栗葉片細胞內的抗氧化酶，可以看出在50 mmol·L-1和100 mmol·L-1NaCl 鹽濃度處理下，歐洲醋栗葉片內SOD、POD、CAT 三種酶的活性都有所增加。在較高鹽濃度時，總體上歐洲醋栗葉片內POD 酶活性顯著降低，可能是由于其調節(jié)能力有限。高鹽濃度的脅迫使歐洲醋栗葉片內POD 酶活性有所降低，此時發(fā)揮主要作用的是歐洲醋栗葉片內SOD 和CAT，用于清除葉片內的活性氧自由基，但是其清除速度達不到自由基的產(chǎn)生速度，使歐洲醋栗植物葉片積累了過量的活性氧自由基，導致了膜過氧化，所以產(chǎn)生了大量MDA。在不同濃度的堿脅迫處理下，歐洲醋栗葉片內SOD 活性一直維持在較高水平，可見SOD在細胞抗逆中發(fā)揮了重要作用，在100 mmol·L-1NaHCO3堿濃度處理下，歐洲醋栗葉片內POD 活性達到最高，說明在此逆境條件下主要是POD發(fā)揮清除自由基的作用，150 mmol·L-1的堿濃度使歐洲醋栗葉片內POD 活性開始降低，在200 mmol·L-1時活性最低，這說明較高的堿濃度抑制了歐洲醋栗葉片內POD 活性。歐洲醋栗葉片內CAT 含量隨著堿濃度的增加一直升高，其用于催化細胞內過氧化氫的分解，防止過氧化，這與張永峰和殷波[23]的研究結果一致。

歐洲醋栗對中性鹽的耐受能力強于堿性鹽。低鹽濃度在0 ～100 mmol·L-1時，不會影響歐洲醋栗生長，葉片葉綠素含量增加，光合作用提高，歐洲醋栗葉片內抗氧化酶活性增加，植株對鹽堿脅迫表現(xiàn)出一定的耐受性。鹽堿濃度在150 mmol·L-1～200 mmol·L-1時，會超過歐洲醋栗的耐受能力，活性氧自由基的產(chǎn)生和清除平衡被打破，脂膜會過氧化，細胞遭到破壞，影響歐洲醋栗生長。此外，歐洲醋栗的耐鹽性強于其耐堿性，選擇生長地區(qū)時其土壤pH 不宜過高。