糖蛋白Ⅲa的PlA1/A2多態(tài)性與心肌梗死易感性關(guān)系研究

吳慶湘,史振羽,倪偉智,黃琪容,袁 丁

血小板活化在急性心肌梗死(AMI)的發(fā)病中發(fā)揮重要作用,血小板活化介導(dǎo)的血栓形成會(huì)加重AMI病情,提升病人死亡率[1]。研究發(fā)現(xiàn),血小板活化的早期,其表面發(fā)生糖蛋白(GP)Ⅱb/Ⅲa復(fù)合物構(gòu)型改變,GPⅡb/Ⅲa受體的活化表達(dá)能進(jìn)一步介導(dǎo)血小板聚集與釋放,因此,GPⅡb/Ⅲa被認(rèn)為是血小板早期活化的標(biāo)志物[2-3]。GPⅢa基因位于17號(hào)染色體長(zhǎng)臂上17q21.32,多態(tài)性表現(xiàn)為PIA1、PIA2。但目前GPⅡb/Ⅲa受體的PlA1/A2多態(tài)性在AMI發(fā)病中的作用以及對(duì)疾病進(jìn)展的影響尚存在較大爭(zhēng)議,有報(bào)道指出,PlA1/A2多態(tài)性主要影響血小板聚集成單核細(xì)胞,PlA2等位基因的攜帶與AMI存在顯著相關(guān)性[4-5]。但也有學(xué)者認(rèn)為PlA1/A2多態(tài)性并非AMI的病理風(fēng)險(xiǎn)因素[6]。本研究擬通過研究健康人群與AMI病人PlA1/A2多態(tài)性,分析GPⅢa的PlA1/A2多態(tài)性與心肌梗死易感性的關(guān)系,現(xiàn)報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選取2020年9月—2021年9月廣州中醫(yī)藥大學(xué)第五臨床醫(yī)學(xué)院收治的70例AMI病人,男41例,女29例;年齡30～76(65.47±9.52)歲。納入標(biāo)準(zhǔn):①符合《急性ST段抬高型心肌梗死診斷和治療指南(2019)》[7]關(guān)于AMI的診斷標(biāo)準(zhǔn);②通過血清心肌酶譜、心電圖及冠狀動(dòng)脈造影等檢查確診為AMI;③能夠配合完成各項(xiàng)檢查治療;④臨床資料完整。排除標(biāo)準(zhǔn):①已接受GPⅡb/Ⅲa受體抑制劑、阿司匹林治療者;②有心臟病史(包括心肌病、風(fēng)濕性心臟病、主動(dòng)脈夾層等)和腦梗死病史;③合并免疫系統(tǒng)疾病、血液系統(tǒng)疾病、急慢性感染、惡性腫瘤;④病人存在血緣關(guān)系;⑤精神疾病病人。同期選取本院體檢健康志愿者70名作為對(duì)照組,男39名,女31名,年齡28～80(66.30±9.45)歲。所有試驗(yàn)對(duì)象對(duì)研究?jī)?nèi)容充分知情且簽署書面同意書,本研究經(jīng)過醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)審查批準(zhǔn)。

1.2 方法

1.2.1 基線資料收集 采集兩組研究對(duì)象性別、年齡、體質(zhì)指數(shù)(BMI)、血壓、吸煙史、病史、血脂4項(xiàng)、磷酸肌酸激酶同工酶(CK-MB)、心肌肌鈣蛋白I(cTnI)、N末端腦鈉肽前體(NT-proBNP)等資料,其中,血脂4項(xiàng)指標(biāo)包括總膽固醇(TC)、三酰甘油(TG)、低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)、高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)。

1.2.2 標(biāo)本采集 采集病人入院時(shí)和健康對(duì)照者空腹靜脈血5 mL于真空采血管中,乙二胺四乙酸(EDTA)抗凝,1 h內(nèi)送實(shí)驗(yàn)室完成檢測(cè)。

1.2.3 DNA提取 ①取上述新鮮抗凝全血樣品300 μL于EP管中,加入等量磷酸緩沖鹽溶液(PBS)稀釋,混勻。②在另1個(gè)EP管中加入3 mL人外周血單個(gè)核細(xì)胞分離液(北京索萊寶科技有限公,P9011),使用巴氏德吸管吸取稀釋后的血漿小心地平鋪到分離液液面上方,注意保持兩液面界面清晰。③室溫下離心(3 000 r/min,半徑15 cm)20 min,離心后液體呈明顯分層,吸取血漿層與分離液層間白膜層即為單個(gè)核細(xì)胞層。④使用移液槍吸取白膜層至15 mL潔凈EP管中,10 mL PBS洗滌,離心(2 000 r/min,半徑10 cm)10 min,棄去上清液,重復(fù)3次。⑤使用DNA提取試劑盒(德國(guó)QIAGEN公司)提取出基因組DNA,再行瓊脂糖凝膠電泳,測(cè)定DNA濃度。

1.2.4 PlA1/A2基因多態(tài)性檢測(cè) 使用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)-限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性(RFLP)技術(shù)測(cè)定PlA1/A2基因多態(tài)性,使用軟件Primer 5設(shè)計(jì)引物5′-TGCTGGACTTCTCTTTGGGC-3′和 5′-TCAGGTC TCTCCCCGCAAAG-3′,引物委托上海生工生物有限公司合成,PCR反應(yīng)條件:95 ℃預(yù)變性5 min,經(jīng)(94 ℃變性30 s,57 ℃退火40 s,72 ℃延伸30 s)39個(gè)循環(huán),72 ℃延伸10 min。

1.2.5 基因多態(tài)性分析 取10 μL PCR擴(kuò)增后產(chǎn)物,加入1 μL限制性內(nèi)切酶TaqⅠ(美國(guó)NEB公司)進(jìn)行酶切,再對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行核苷酸序列測(cè)定,測(cè)序由上海生工生物有限公司完成,測(cè)序結(jié)果使用DNAMAN軟件進(jìn)行分析。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 PlA1/A2的基因型及等位基因頻率等定性資料比較使用χ2檢驗(yàn),以確定其是否符合Hardy-Weinberg遺傳定律,年齡、BMI、血脂指標(biāo)等定量資料比較使用t檢驗(yàn)或方差分析。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 兩組臨床資料比較 AMI組糖尿病史、高血壓史占比明顯高于對(duì)照組(P<0.05),且AMI組TG、TC、LDL-C、CK-MB、cTnI及NT-proBNP水平均高于對(duì)照組,而HDL-C水平低于對(duì)照組,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。兩組性別、年齡、BMI、吸煙史比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。詳見表1。

表1 兩組臨床資料比較

2.2 Hardy-Weinberg平衡吻合度檢測(cè) 對(duì)照組與AMI組GPⅢa的PlA1/A2位點(diǎn)基因型分布及等位基因頻率均符合Hardy-Weinberg平衡定律(P>0.05),表明PlA1/A2位點(diǎn)基因型分布在本研究的人群中達(dá)到了遺傳平衡,具有良好的群體代表性。詳見表2。

表2 GPⅢa基因型Hardy-Weinberg平衡吻合度檢測(cè)

2.3 GPⅢa基因的PlA1/A2多態(tài)性分析 GPⅢa基因的PlA1/A2多態(tài)性基因型為 PlA1/A1、PlA1/A2、PlA2/A2,對(duì)照組與AMI組的主要基因型為PlA1/A1、PlA2/A2。兩組基因型分布及等位基因頻率比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),且PlA1、PlA2等位基因突變與AMI發(fā)病有關(guān)。詳見表3。

表3 對(duì)照組與AMI組GPⅢa的基因型及等位基因頻率分布 單位:例(%)

2.4 PlA1/A2多態(tài)性與血脂、心肌酶指標(biāo)及NT-proBNP的關(guān)系 AMI組PlA2/A2基因型病人的TG、TC、LDL-C、CK-MB、cTnI及NT-proBNP水平均明顯高于其他基因型病人,而HDL-C水平明顯低于其他基因型病人,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。詳見表4。

表4 AMI組不同GPⅢa PLA1/A2基因型血脂、心肌酶指標(biāo)及NT-proBNP水平比較(±s)

3 討 論

AMI病情兇險(xiǎn),死亡率高,我國(guó)AMI發(fā)病率仍呈上升趨勢(shì),極易錯(cuò)過最佳治療窗口,危及病人生命安全[8]。動(dòng)脈粥樣硬化易損斑塊破裂后引發(fā)的血小板活化、黏附和聚集是心肌梗死重要的病理基礎(chǔ),在AMI的病情進(jìn)展及預(yù)后中起著關(guān)鍵性作用[9]。研究表明,GPⅢa高表達(dá)的心血管疾病病人血小板活性顯著增強(qiáng)[3],提示GPⅢa在血小板聚集調(diào)控過程中發(fā)揮關(guān)鍵作用。相關(guān)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)也證實(shí),雙聯(lián)抗血小板藥物可下調(diào)GPⅢa受體表達(dá),減輕AMI引發(fā)的缺血和再灌注損傷[10]。而受遺傳變異性的影響,GPⅢa存在PlA1/A2多態(tài)性,其中攜帶PlA2基因病人心臟疾病發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)較未攜帶者增加4倍,尤其男性病人[11]。有研究認(rèn)為,與PlA1相比,PlA2多態(tài)性血小板對(duì)GPⅡb/Ⅲa具有更強(qiáng)的激活作用,介導(dǎo)GPⅡb/Ⅲa與纖維蛋白原的結(jié)合[12]。說明GPⅢa A2多態(tài)性血小板更有助于誘導(dǎo)血栓的形成,導(dǎo)致不良心血管事件發(fā)生。但當(dāng)前關(guān)于GPⅢa的PlA1/A2多態(tài)性與心肌梗死易感性的相關(guān)研究報(bào)道鮮見。

本研究檢測(cè)了研究對(duì)象血GPⅢa的PlA1/A2基因多態(tài)性分布情況,結(jié)果發(fā)現(xiàn),AMI病人與健康人群均存在PlA1/A1、PlA1/A2、PlA2/A2 3種基因型,基因型分布符合Hardy-Weinberg平衡定律,但AMI組PlA2/A2基因型頻率為55.71%,較對(duì)照組明顯增加;同時(shí)等位基因PlA2的頻率(65.71%)也明顯升高,且PlA1、PlA2等位基因突變與AMI發(fā)病有相關(guān)性,表明PlA1/A2基因多態(tài)性在AMI的發(fā)病中起著關(guān)鍵性作用,PlA2位點(diǎn)突變可能增加AMI發(fā)病風(fēng)險(xiǎn),與AMI遺傳易感性相關(guān)。但目前GPⅢa的PlA1/A2基因多態(tài)性對(duì)AMI發(fā)病影響的機(jī)制尚不明確。血小板質(zhì)膜上GPⅢa以共價(jià)鍵與GPⅡb結(jié)合形成二聚體復(fù)合物GPⅡb/Ⅲa,是血小板膜上纖維蛋白原受體,GPⅡb/Ⅲa活化后與纖維蛋白原結(jié)合是各種血小板激動(dòng)劑介導(dǎo)血小板凝集的最后共同通路。GPⅢa PlA具有多態(tài)性,且會(huì)對(duì)GPⅡb/Ⅲa的結(jié)構(gòu)與功能造成較大影響[13]。Michelson等[14]比較了不同GPⅡb/Ⅲa基因型冠狀動(dòng)脈綜合征病人血小板激活、GPⅡb/Ⅲa激活和纖維蛋白原結(jié)合的閾值,PlA2/A2基因型病人均為最低,PlA1/A2次之,PlA1/A1最高。提示PlA2基因活化程度更高,有更強(qiáng)的血栓形成傾向。有研究發(fā)現(xiàn),雙聯(lián)抗血小板治療可挽救缺血心肌和改善心功能,但PlA1/A1的血小板對(duì)阿司匹林、氯吡格雷等不敏感,PlA1/A2與PlA2/A2基因型組則敏感性更高[15]。這種對(duì)抗血小板藥物不同的敏感性可能具有潛在的臨床意義,提示在AMI臨床治療中可根據(jù)PlA基因型精準(zhǔn)調(diào)整抗血小板治療方案。

本研究還發(fā)現(xiàn),AMI組PlA2/A2基因型病人TG、TC、LDL-C、CK-MB、cTnI及NT-proBNP水平均明顯高于其他基因型病人,而HDL-C水平明顯低于其他基因型病人。提示GPⅢa 的PlA1/A2多態(tài)性會(huì)影響AMI病人血脂代謝,導(dǎo)致或加重心肌損傷。目前國(guó)內(nèi)外關(guān)于GPⅢa的PlA1/A2多態(tài)性與血脂異常具體相關(guān)機(jī)制的報(bào)道鮮見,分析PlA2純合基因病人血小板活化閾值低,動(dòng)脈粥樣硬化斑塊破裂后能迅速介導(dǎo)血小板聚集,造成局部血栓形成,引發(fā)心肌損傷;與此同時(shí),GPⅡb/Ⅲa復(fù)合體被活化后使血小板超微結(jié)構(gòu)發(fā)生病理變化,還可能通過刺激血小板釋放血小板微粒,調(diào)控血管平滑肌細(xì)胞、成纖維細(xì)胞的凋亡,從而參與心肌細(xì)胞損害,具體作用機(jī)制仍有待進(jìn)一步研究。

綜上所述,GPⅢa的PlA1/A2多態(tài)性與AMI發(fā)病有關(guān),PlA2等位基因可能是AMI發(fā)病的易感基因。本研究由于納入病例數(shù)較少,且未考慮研究對(duì)象的種族、地區(qū)差異,研究結(jié)果可能存在偏倚,仍有必要進(jìn)行多中心、大樣本研究來進(jìn)一步探討GPⅢa的PlA1/A2多態(tài)性與AMI易感性的確切關(guān)系。

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