血小板中Toll樣受體表達(dá)與急性冠脈綜合征的關(guān)系

毛先軍,左益檠

血小板除了在促進(jìn)止血和加速凝血方面發(fā)揮主要作用外,還能分泌多種黏附分子,在內(nèi)皮細(xì)胞和其他免疫細(xì)胞之間的相互作用中起著至關(guān)重要的作用[1]。研究表明,血小板通過(guò)釋放P-選擇素和CD40L或形成血小板-白細(xì)胞聚集體與白細(xì)胞相互作用并調(diào)節(jié)其功能[2]。血小板上Toll樣受體(TLRs)的表達(dá)可能在血小板與免疫反應(yīng)之間發(fā)揮重要的作用[3-5]。以往的研究主要集中于血小板TLRs在血小板減少癥、膿毒癥、失血性休克或感染繼發(fā)的嚴(yán)重血栓性并發(fā)癥(如腦卒中或心肌梗死)中的作用[6-8]。然而,據(jù)報(bào)道,TLRs不僅能感知外源性微生物分子,還能感知宿主來(lái)源的分子[9]。動(dòng)脈粥樣硬化被認(rèn)為是一種無(wú)菌性炎癥相關(guān)性疾病,這提示TLRs在動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)生發(fā)展中可能發(fā)揮一定的作用。本研究旨在探索血小板TLR-2和TLR-4的表達(dá)與急性冠脈綜合征(ACS)之間的關(guān)系。現(xiàn)報(bào)道如下。

1 對(duì)象與方法

1.1 研究對(duì)象 選取2019年9月—2020年8月我院心內(nèi)科收治的首次診斷為ACS的病人50例[包括不穩(wěn)定型心絞痛(UAP)、非ST段抬高型心肌梗死(NSTEMI)、ST段抬高型心肌梗死(STEMI)]作為試驗(yàn)組,選擇相同時(shí)間段年齡、性別匹配且冠狀動(dòng)脈正常者50例作為對(duì)照組。納入標(biāo)準(zhǔn):①試驗(yàn)組病人符合《急性冠脈綜合征急診快速診治指南(2019)》[10]中ACS的診斷標(biāo)準(zhǔn);②試驗(yàn)組病人自身?xiàng)l件允許行冠狀動(dòng)脈造影檢查;③所有病人未接受過(guò)抗血小板或抗凝藥物治療;④研究對(duì)象對(duì)此項(xiàng)臨床研究知情并簽署知情同意書(shū)。排除標(biāo)準(zhǔn):①有冠心病病史者;②合并肝腎功能嚴(yán)重?fù)p害者;③患有惡性腫瘤者;④合并各種血液系統(tǒng)疾病者;⑤患有感染、自身免疫性疾病等全身性炎癥性疾病者;⑥近3個(gè)月內(nèi)有手術(shù)史者。本研究經(jīng)我院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)審核通過(guò)。

1.2 方法

1.2.1 臨床資料收集 收集研究對(duì)象年齡、性別、冠心病常見(jiàn)危險(xiǎn)因素(如高血壓、糖尿病、高脂血癥、吸煙、冠心病家族史)、體質(zhì)指數(shù)(BMI)、用藥情況[他汀類藥物、β受體阻滯劑、血管緊張素轉(zhuǎn)換酶抑制劑(ACEI)、血管緊張素受體拮抗劑(ARB)等]、實(shí)驗(yàn)室指標(biāo)[血清肌酐、空腹血糖、低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)、高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)、血紅蛋白、白細(xì)胞計(jì)數(shù)、血小板計(jì)數(shù)、肌酸激酶同工酶(CK-MB)、肌鈣蛋白T]、左室射血分?jǐn)?shù)(LVEF)。

1.2.2 血小板TLR表達(dá)水平檢測(cè) 采集研究對(duì)象外周靜脈血樣本,且采樣前均未接受抗血小板或抗凝藥物治療。采集血樣后15 min內(nèi)用流式細(xì)胞儀檢測(cè)血小板TLR的表達(dá)水平。用含有檸檬酸鈉的采血管收集全血(5 mL),3 000 r/min離心15 min,收集富含血小板的部分,用含0.1%牛血清白蛋白緩沖液(17.5 mmol/L Na2HPO4,8.9 mmol/L Na2EDTA,154 mmol/L NaCl,pH 6.9,0.1%牛血清白蛋白)洗滌血小板2次;210×g離心5 min,用4-羥乙基哌嗪乙磺酸(HEPES)緩沖液(132 mmol/L NaCl,6 mmol/L KCl,1 mmol/L MgSO4,1.2 mmol/L KH2PO4,20 mmol/L HEPES,pH 7.4,5 mmol/L葡萄糖)重懸血小板。用流式細(xì)胞儀(Beckman Coulter XLMCL,美國(guó))檢測(cè)血小板TLR-2和TLR-4的表達(dá)。106個(gè)血小板與10 μL TLR-2 PE(CD282,cloneT2.5,Biolegend)、10 μL TLR-4 FITC(CD284,HTA125,Biolegend)抗體、同位素對(duì)照(MsIgG1 FITC、MsIgG1PE,Biolegend)在4 ℃條件下避光孵育30 min,用磷酸緩沖鹽溶液(PBS)洗滌1次,上機(jī)檢測(cè)。

2 結(jié) 果

2.1 兩組臨床資料比較 試驗(yàn)組與對(duì)照組年齡、性別、BMI比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。在心血管危險(xiǎn)因素中,試驗(yàn)組高血壓、糖尿病、吸煙、冠心病家族史、高脂血癥比例明顯高于對(duì)照組(P<0.05)。試驗(yàn)組服用他汀類藥物、β受體阻滯劑、ACEI/ARB比例明顯高于對(duì)照組(P<0.05)。試驗(yàn)組白細(xì)胞計(jì)數(shù)、空腹血糖水平明顯高于對(duì)照組(P<0.05)。試驗(yàn)組HDL-C水平明顯低于對(duì)照組(P<0.05),而兩組LDL-C、血清肌酐水平、血小板計(jì)數(shù)差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。試驗(yàn)組LVEF低于對(duì)照組(P<0.05)。詳見(jiàn)表1。

表1 兩組臨床資料比較

2.2 兩組血小板TLRs表達(dá)情況比較 ACS病人血小板TLR-2和TLR-4表達(dá)水平明顯高于冠狀動(dòng)脈正常者(TLR-2中位數(shù)分別為30.4%與4.5%,P<0.001;TLR-4中位數(shù)分別為44.4%與5.7%,P<0.001)。詳見(jiàn)圖1。血小板TLR-2、TLR-4的表達(dá)水平在UAP、NSTEMI、STEMI 3組病人間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。詳見(jiàn)表2。

圖1 試驗(yàn)組與對(duì)照組血小板TLR-2和TLR-4表達(dá)水平比較

表2 ACS各亞型病人血小板TLR-2和TLR-4表達(dá)水平比較[M(QR)] 單位:%

2.3 血小板TLR表達(dá)與心血管危險(xiǎn)因素及服藥情況的關(guān)系 有高血壓、糖尿病、高脂血癥、吸煙史和冠心病家族史及服用他汀類藥物、β受體阻滯劑、ACEI/ARB的ACS病人,血小板TLR-2和TLR-4的表達(dá)水平明顯升高(P<0.05)。詳見(jiàn)表3、表4。

表3 血小板TLR-2表達(dá)與心血管危險(xiǎn)因素及服藥情況的關(guān)系[M(QR)] 單位:%

表4 血小板TLR-4表達(dá)與心血管危險(xiǎn)因素及服藥情況的關(guān)系[M(QR)] 單位:%

2.4 血小板TLRs表達(dá)與ACS病人基線特征的相關(guān)性 血小板TLR-2表達(dá)與空腹血糖、白細(xì)胞計(jì)數(shù)、肌鈣蛋白T峰值呈正相關(guān),與HDL-C、LVEF呈負(fù)相關(guān)。而血小板TLR-4表達(dá)與空腹血糖、白細(xì)胞計(jì)數(shù)、CK-MB峰值、肌鈣蛋白T基線值、肌鈣蛋白T峰值呈正相關(guān),與HDL-C、LVEF呈負(fù)相關(guān)。詳見(jiàn)表5。

表5 血小板TLR表達(dá)與ACS病人基線特征的相關(guān)性(r值)

2.5 ACS的影響因素分析 冠心病家族史、服用他汀類藥物、血小板TLR-2和TLR-4的表達(dá)與ACS的發(fā)生獨(dú)立相關(guān)(P<0.05)。詳見(jiàn)表6。

表6 ACS預(yù)測(cè)因素的Logistic回歸分析結(jié)果

3 討 論

本研究結(jié)果表明,與冠狀動(dòng)脈正常的病人相比,ACS病人血小板TLR-2和TLR-4的表達(dá)明顯增加,并且有高血壓、糖尿病、高脂血癥、吸煙史和冠心病家族史、服用他汀類藥物、β受體阻滯劑、ACEI/ARB的病人血小板TLR-2和TLR-4的表達(dá)水平較高。此外,血小板TLR-2和TLR-4的表達(dá)是ACS的獨(dú)立預(yù)測(cè)因子。

動(dòng)脈粥樣硬化的特征是血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷、單核細(xì)胞黏附和遷移、巨噬細(xì)胞脂質(zhì)堆積和泡沫細(xì)胞的形成[11-12]。在TLR家族中,特別是TLR-4早已被發(fā)現(xiàn)在動(dòng)脈粥樣硬化性疾病的發(fā)生和發(fā)展中起著至關(guān)重要的作用[13-15]。已有研究報(bào)道了ACS病人外周血單核細(xì)胞(PBMC)中TLRs在循環(huán)系統(tǒng)中連接病理信號(hào)與促血栓形成和促炎信號(hào)之間的關(guān)系[16-17]。ACS病人單核細(xì)胞亞群、白細(xì)胞、PBMC以及冠狀動(dòng)脈血栓中CD14標(biāo)記的單核細(xì)胞上TLR-2和TLR-4的表達(dá)水平明顯升高[16,18]。除ACS外,穩(wěn)定型心絞痛病人單核細(xì)胞上TLR-4的mRNA和蛋白表達(dá)水平也明顯升高,并且其表達(dá)水平與冠狀動(dòng)脈嚴(yán)重狹窄的血管數(shù)量相關(guān)[19]。Kuwahata等[20]認(rèn)為單核細(xì)胞上TLR-2的高表達(dá)可能是動(dòng)脈粥樣硬化形成的獨(dú)立危險(xiǎn)因素。

研究表明,血小板激活和血小板中TLRs表達(dá)增強(qiáng)有很強(qiáng)的相關(guān)性[21]。血小板激活后表面TLRs的表達(dá)增強(qiáng)[22],活化的血小板細(xì)胞膜上TLR-2和TLR-9的表達(dá)增加,而TLR-4的表達(dá)減少。但在活化的血小板細(xì)胞內(nèi)TLR-2、TLR-4和TLR-9的表達(dá)均增加[23]。研究表明,刺激血小板TLR-2可增加P-選擇素的表面表達(dá),激活整合素αIIbβ3,產(chǎn)生活性氧,并在人全血中形成血小板-中性粒細(xì)胞異型聚集體[24-25]。然而,除了TLR-2和TLR-4的病原體相關(guān)配體外,目前還缺乏關(guān)于改變自身配體的研究,這些配體已經(jīng)被證明能誘導(dǎo)血小板的血栓炎癥反應(yīng),并且這種反應(yīng)可以被血小板TLRs識(shí)別并轉(zhuǎn)化為病理反應(yīng)[26-27]。

在本研究中,與冠狀動(dòng)脈正常的病人相比,ACS病人血小板TLR-2和TLR-4的表達(dá)水平明顯升高。提示通過(guò)改變TLRs的自身配體可能導(dǎo)致血小板活化,這可能是導(dǎo)致ACS病人促血栓形成的主要原因。由于STEMI病人中TLRs的表達(dá)明顯升高,推測(cè)血小板TLRs在ACS病人中的表達(dá),特別是在STEMI病人中的表達(dá),可能在導(dǎo)致血栓形成的非自限性級(jí)聯(lián)反應(yīng)中起至關(guān)重要的作用。這與Semeraro等[28]的研究結(jié)果是一致的,其研究結(jié)果已經(jīng)證明死亡細(xì)胞釋放的細(xì)胞外組蛋白通過(guò)血小板TLR-2和TLR-4促進(jìn)凝血酶的產(chǎn)生。然而,本研究沒(méi)有發(fā)現(xiàn)血小板TLRs的表達(dá)在ACS 3種亞型(如UAP、NSTEMI、STEMI)病人中的表達(dá)有差異。這可以用相對(duì)較小的研究人群來(lái)解釋。另一方面,ACS病人血小板TLR-2和TLR-4的表達(dá)與肌鈣蛋白T峰值水平相關(guān),表明TLRs的表達(dá)還與心肌梗死的嚴(yán)重程度密切相關(guān)。

有研究表明,用合成的TLR-2/TLR-1激動(dòng)劑Pam3CSK4孵育分離的血小板,可直接誘導(dǎo)血小板聚集和與膠原黏附[29-30]。這些反應(yīng)在TLR-2缺陷的小鼠中被抑制,同時(shí)在人血小板中可以被TLR-2阻斷抗體預(yù)處理所抑制[24,31]。這一研究結(jié)果具有重要的臨床意義,提示血小板TLRs可能成為治療ACS的新靶點(diǎn)。目前需要進(jìn)一步的研究來(lái)證明TLRs在ACS發(fā)病機(jī)制中的確切作用,以及改變TLR-2和TLR-4的配體或TLRs本身可能成為ACS的治療靶點(diǎn)。

本研究存在一些局限性,首先,這是一項(xiàng)觀察性研究。其次,表面TLRs的表達(dá)不足以衡量血小板中TLRs的產(chǎn)生,本研究未對(duì)細(xì)胞內(nèi)TLRs的表達(dá)進(jìn)行評(píng)估,而mRNA的檢測(cè)可以提供更準(zhǔn)確的信息。

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