葛根素通過調(diào)控NF-κB通路對大鼠心肌梗死后室性心律失常及體表心電圖參數(shù)的影響

黃宏偉,岳 瑩,馬良晨,殷國田

心肌梗死(myocardial infarction,MI)是心血管系統(tǒng)常見急危重癥,心律失常是常見的并發(fā)癥之一。研究表明,各種類型心律失常是導(dǎo)致急性心肌梗死病人死亡的重要原因,75%～90%的急性心肌梗死病人可合并心律失常,其中,嚴(yán)重心律失常的發(fā)生率占5%～15%[1]。因此,尋求有效治療急性心肌梗死后心律失常的藥物對改善病人預(yù)后意義重大。葛根素是從中藥葛根中分離的異黃酮類衍生物。葛根素具有多種藥理活性,已被廣泛應(yīng)用于治療心血管疾病,如心絞痛、心肌缺血、心律失常、心力衰竭等[2]。既往研究表明,葛根素能清除活性自由基,發(fā)揮抗氧化作用,抑制炎癥反應(yīng)[3]。核轉(zhuǎn)錄因子κB(nuclear factor κB,NF-κB)途徑可以調(diào)節(jié)炎癥相關(guān)基因的表達(dá),該通路被激活后可增加腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)和白細(xì)胞介素(interleukin,IL)的表達(dá)與分泌,從而導(dǎo)致心肌損傷[4]。目前,葛根素對抗心肌梗死、心律失常的改善作用研究較少,治療心臟疾病的機(jī)制尚不清楚。本研究擬通過構(gòu)建大鼠心肌梗死模型,觀察葛根素對大鼠心肌梗死后室性心律失常(ventricular arrhythmia,VA)及體表心電圖的影響,并探究其可能機(jī)制,為臨床預(yù)防和治療心肌梗死提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物 選取80只無特定病原體(SPF)級雄性SD大鼠,8周齡,體質(zhì)量(220±20)g,購自上海斯萊克實驗動物有限責(zé)任公司,生產(chǎn)許可證號:SCXK(滬)2017-0005。飼養(yǎng)環(huán)境:溫度20～25 ℃,相對濕度(50±5)%,光照周期10～12 h。本研究方案已獲得我院倫理委員會批準(zhǔn),并符合國際活體動物使用指南要求。

1.1.2 藥品、主要試劑和儀器 葛根素(純度98%)購自四川維克奇生物技術(shù)有限公司;脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)購自湖南一格制藥有限公司;大鼠TNF-α、IL-1β酶聯(lián)免疫吸附實驗(ELISA)試劑盒均購自美國R&D公司;兔抗大鼠p-p65、NF-κB p65、NF-κB抑制劑α(inhibitor of NF-κBα,IκBα)、β-actin抗體購自美國Santa Cruz公司,山羊抗兔辣根過氧化物酶標(biāo)記二抗購自英國Abcam公司;KARTIZER3300心電機(jī)購自日本NEC公司;多功能酶標(biāo)儀購自芬蘭雷勃公司;蛋白凝膠電泳儀購自上海天能科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 心肌梗死模型制備[5]與動物分組 隨機(jī)選取65只SD大鼠,腹腔注射40 mg/kg戊巴比妥鈉麻醉大鼠,氣管插管并連接呼吸機(jī)輔助呼吸,于大鼠胸骨左側(cè)第3肋與第4肋間開胸,剪開心包暴露心臟,距左心耳尖下緣1～2 mm處結(jié)扎左冠狀動脈前降支。術(shù)中進(jìn)行心電監(jiān)護(hù),Ⅱ?qū)?lián)心電圖ST段抬高,心臟搏動短暫性減弱,結(jié)扎區(qū)域心尖部和左室前壁顏色變白,證明造模成功。另外15只大鼠只剪開心包不結(jié)扎冠狀動脈作為假手術(shù)組。將61只造模成功的大鼠(造模過程中有4只大鼠死亡)隨機(jī)分為模型組(16只)、葛根素組(15只)、LPS組(15只)、LPS+葛根素組(15只),造模成功后24 h,葛根素組給予腹腔注射120 mg/kg葛根素1次;LPS組給予腹腔注射0.5 mg/kg LPS 1次;LPS+葛根素組給予0.5 mg/kg LPS腹腔注射1次,間隔2 h再注射120 mg/kg葛根素,每日1次,連續(xù)7 d;假手術(shù)組和模型組實驗期間給予腹腔注射等量生理鹽水。

1.2.2 VA誘發(fā)及有效不應(yīng)期(effective refractory period,ERP)檢測 末次藥物干預(yù)后次日,使用程序電刺激室性期前收縮法誘發(fā)大鼠VA,BL-420F生物信號采集與處理系統(tǒng)記錄電生理參數(shù)。程序電刺激S1S2周長間隔100 ms,S1S2強(qiáng)度、波寬為5 V和2 ms,S1波間隔98 ms,脈沖數(shù)8個;S2脈沖數(shù)1個。S1S2間期每次遞減2 ms進(jìn)行期前刺激,至S2不再出現(xiàn)RP間期或誘發(fā)出VA。引起心室顫動的最低強(qiáng)度為心室顫動閾值,S1S2程控電刺激,脈寬2 ms,S2強(qiáng)度為2倍舒張閾,從舒張晚期逐漸向前掃描,以期前收縮前1個基本心搏的R波至不能引起室性期前收縮的最長S2間距作為ERP。

1.2.3 體表心電圖檢測 VA誘發(fā)后次日,腹腔注射5%戊巴比妥鈉麻醉大鼠,仰臥位固定,四肢皮下連接肢體導(dǎo)聯(lián)心電圖機(jī)進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)肢體導(dǎo)聯(lián)心電圖(走紙速度25 mm/s,電壓2 mV),記錄20 min內(nèi)各組大鼠體表心電圖。

1.2.4 ELISA檢測血清TNF-α和IL-1β含量 心電監(jiān)護(hù)完畢,自主動脈取血至無菌試管中,室溫下靜置1 h,3 000 r/min(離心半徑8 cm)離心10 min,取上清分裝后置于-20 ℃冰箱備用。酶標(biāo)板設(shè)置空白孔、標(biāo)準(zhǔn)品孔和樣品孔,空白孔不加樣品和酶標(biāo)試劑,標(biāo)準(zhǔn)品孔加入梯度稀釋的標(biāo)準(zhǔn)品,樣品孔先加樣品稀釋液40 μL,再加血清樣品10 μL(最終稀釋度為5倍),混勻后封板,37 ℃孵育0.5 h,清洗液洗滌5次,除空白孔外每孔加50 μL酶標(biāo)試劑,封板,37 ℃孵育1 h,清洗液洗滌5次,每孔加入100 μL顯色液混勻,37 ℃避光顯色20 min,待標(biāo)準(zhǔn)品孔前5孔出現(xiàn)明顯的顏色梯度變化時,每孔加50 μL終止液終止反應(yīng),15 min內(nèi)以空白孔調(diào)零,450 nm波長測量各孔的吸光度值(OD值),以標(biāo)準(zhǔn)品的濃度為橫坐標(biāo),OD值為縱坐標(biāo),使用CurveExpert軟件繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,計算出樣品濃度。

1.2.5 2,3,5-氯化三苯基四氮唑(TTC)染色觀察大鼠心肌梗死面積 采血完畢,脊椎脫臼法處死大鼠,解剖取大鼠心尖部心肌組織,用磷酸緩沖鹽溶液(PBS)清洗,液氮快速冷凍,10%甲醛固定12 h,沿左室長軸中點進(jìn)行組織切片,置于37 ℃預(yù)熱1%TTC溶液中,水浴恒溫振蕩器中37 ℃避光染色20 min,4%多聚甲醛固定24 h,梗死區(qū)域呈灰白色,正常組織呈磚紅色,Image J軟件分析心肌梗死面積百分比,心肌梗死面積百分比=梗死區(qū)面積/總面積×100%。

1.2.6 蛋白免疫印跡法(Western Blot)檢測心肌組織中NF-κB p65、IκBα蛋白表達(dá)水平 取100 mg液氮冷凍心肌組織,研磨后提取心肌組織總蛋白,二喹啉甲酸(BCA)試劑盒檢測蛋白濃度。95 ℃金屬浴使蛋白變性,10%十二烷基磺酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE),80 V恒壓電泳30 min,100 V恒壓電泳約1 h(溴酚藍(lán)接近膠板底端),濕式轉(zhuǎn)膜儀將蛋白轉(zhuǎn)移至聚偏氟乙烯(PVDF)膜上,300 mA恒流轉(zhuǎn)膜1 h,5%脫脂牛奶室溫封閉1 h,分別用稀釋比例1∶1 000 p-p65、NF-κB p65、IκBα、β-actin一抗4 ℃孵育過夜,TBST洗膜10 min,3次,再用辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記的二抗(1∶2 000)室溫孵育1 h,TBST洗膜10 min,3次,電化學(xué)發(fā)光(ECL)液于暗室曝光顯影,Image J軟件對蛋白條帶進(jìn)行灰度值分析,以目的蛋白條帶灰度值/內(nèi)參β-actin蛋白條帶灰度值的比值作為目的蛋白相對表達(dá)量。

2 結(jié) 果

2.1 各組大鼠VA誘發(fā)率、ERP和心室顫動閾值比較 各組大鼠VA誘發(fā)率、ERP、心室顫動閾值比較,差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。與假手術(shù)組比較,模型組VA誘發(fā)率升高,ERP縮短,心室顫動閾值降低,均P<0.05;與模型組比較,葛根素組VA誘發(fā)率降低,ERP延長,心室顫動閾值升高;LPS組VA誘發(fā)率升高,ERP縮短,心室顫動閾值降低,均P<0.05;與葛根素組比較,LPS+葛根素組VA誘發(fā)率升高,ERP縮短,心室顫動閾值降低,均P<0.05;與LPS組比較,LPS+葛根素組VA誘發(fā)率降低,ERP延長,心室顫動閾值升高,均P<0.05。詳見表1。

表1 各組大鼠心肌梗死相關(guān)指標(biāo)比較(±s)

2.2 各組大鼠體表心電圖參數(shù)比較 各組大鼠心電圖QT間期、T波幅度、ST段抬高幅度比較,差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。與假手術(shù)組比較,模型組心電圖QT間期延長,T波幅度、ST段抬高幅度升高,均P<0.05;與模型組比較,葛根素組心電圖QT間期縮短,T波幅度、ST段抬高幅度降低,LPS組心電圖QT間期延長,T波幅度、ST段抬高幅度升高,均P<0.05;與葛根素組比較,LPS+葛根素組心電圖QT間期延長,T波幅度、ST段抬高幅度升高,均P<0.05;與LPS組比較,LPS+葛根素組心電圖QT間期縮短,T波幅度、ST段抬高幅度降低,均P<0.05。詳見表2。

表2 各組大鼠體表心電圖參數(shù)比較(±s)

2.3 各組大鼠血清TNF-α和IL-1β水平比較 各組大鼠血清TNF-α和IL-1β水平比較,差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。與假手術(shù)組比較,模型組血清TNF-α、IL-1β水平升高,均P<0.05;與模型組比較,葛根素組血清TNF-α和IL-1β水平降低,LPS組血清TNF-α和IL-1β水平升高,均P<0.05;與葛根素組比較,LPS+葛根素組血清TNF-α和IL-1β水平升高,均P<0.05;與LPS組比較,LPS+葛根素組血清TNF-α和IL-1β水平降低,均P<0.05。詳見表3。

表3 各組大鼠血清TNF-α、IL-1β水平比較(±s) 單位:pg/mL

2.4 各組大鼠心肌梗死面積比較 各組大鼠心肌梗死面積比較,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。與假手術(shù)組比較,模型組心肌梗死面積增大(P<0.05);與模型組比較,葛根素組心肌梗死面積減小,LPS組心肌梗死面積增大,均P<0.05;與葛根素組比較,LPS+葛根素組心肌梗死面積增大P<0.05);與LPS組比較,LPS+葛根素組心肌梗死面積減小(P<0.05)。詳見表4。

表4 各組大鼠心肌梗死面積比較(±s) 單位:%

2.5 各組大鼠心肌組織p-p65、NF-κB p65、IκBα蛋白表達(dá)水平比較 各組大鼠心肌組織p-p65、IκBα蛋白相對表達(dá)量比較,差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。與假手術(shù)組比較,模型組p-p65相對表達(dá)量升高,IκBα相對表達(dá)量降低,均P<0.05;與模型組比較,葛根素組p-p65相對表達(dá)量降低,IκBα相對表達(dá)量升高,LPS組p-p65相對表達(dá)量升高,IκBα相對表達(dá)量降低,均P<0.05;與葛根素組比較,LPS+葛根素組p-p65相對表達(dá)量升高,IκBα相對表達(dá)量降低,均P<0.05;與LPS組比較,LPS+葛根素組p-p65相對表達(dá)量降低,IκBα相對表達(dá)量升高,均P<0.05。各組大鼠心肌組織NF-κB p65蛋白相對表達(dá)量比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。詳見表5、圖1。

圖1 各組大鼠心肌組織p-p65、NF-κB p65、IκBα蛋白表達(dá)條帶圖

表5 各組大鼠心肌組織p-p65、NF-κB p65、IκBα蛋白相對表達(dá)量比較(±s)

3 討 論

心肌梗死是冠心病最嚴(yán)重的臨床類型,常伴有休克、心力衰竭、心律失常等并發(fā)癥,嚴(yán)重威脅病人的生命健康。研究證實,多數(shù)心肌梗死病人并發(fā)不同程度心律失常,其中,持續(xù)性VA最常見,其引起的心臟猝死占心血管疾病死亡率的50%以上[6]。心肌梗死的發(fā)病機(jī)制主要是冠狀動脈血管堵塞導(dǎo)致急性、持續(xù)性缺氧及供血不足所引起的心肌壞死,壞死細(xì)胞釋放損傷相關(guān)分子模式蛋白觸發(fā)心肌和全身炎癥反應(yīng),細(xì)胞因子、趨化因子誘導(dǎo)內(nèi)皮黏附分子上調(diào)介導(dǎo)梗死心肌的白細(xì)胞募集,清除死細(xì)胞和基質(zhì)碎片,并激活成纖維細(xì)胞和血管細(xì)胞的修復(fù),但也導(dǎo)致纖維化,加劇心肌細(xì)胞凋亡,導(dǎo)致心律失常[7]。心肌梗死的治療原則是恢復(fù)心肌血液灌注、減輕心肌缺氧缺血、改善心臟功能及處理并發(fā)癥等。目前,心肌梗死的臨床治療手段主要是溶栓治療、經(jīng)皮冠狀動脈介入治療、冠狀動脈搭橋術(shù)及藥物治療等[8-11]。其中,藥物治療作為主要治療方式對提高心肌梗死治療效果、改善病人預(yù)后具有重要意義。

葛根素在臨床上多用于心腦血管疾病的治療,具有減輕巨噬細(xì)胞浸潤、神經(jīng)細(xì)胞凋亡、炎癥反應(yīng),降低心臟、腦內(nèi)凋亡基因和炎性因子表達(dá)等藥理作用[12]。動物實驗研究證實,葛根素可有效減輕大鼠心臟缺血再灌注后的損傷程度[13]。Li等[14]研究發(fā)現(xiàn),葛根素晶體形式(葛根素-V)治療異丙腎上腺素誘發(fā)的心肌梗死小鼠后,可顯著改善心室壁梗死,降低死亡率,減輕心臟炎癥環(huán)境并抑制心肌損傷標(biāo)志物水平。He等[15]研究表明,葛根素可以通過過氧化物酶體增殖物激活受體α途徑抑制慢性心力衰竭大鼠心肌細(xì)胞凋亡和炎癥反應(yīng)。Gao等[16]研究顯示,丹參酮ⅡA和葛根素聯(lián)合治療心肌缺血小鼠,可抑制炎性細(xì)胞浸潤,改善心臟功能,減少心肌細(xì)胞損傷、膠原蛋白合成,抑制心肌纖維化和心室重構(gòu),從而改善血流動力學(xué)。本研究通過結(jié)扎冠狀動脈建立心肌梗死大鼠模型,經(jīng)葛根素干預(yù)后心肌梗死大鼠VA誘發(fā)率、T波幅度、ST段抬高幅度、心肌梗死面積、血清TNF-α和IL-1β水平均降低,ERP延長,心電圖QT間期縮短,心室顫動閾值升高。提示葛根素可改善大鼠心肌梗死后VA,影響體表心電圖參數(shù)。

NF-κB是一種核轉(zhuǎn)錄因子,可以與特異性基因啟動子或增強(qiáng)子區(qū)域的特定序列結(jié)合,啟動其轉(zhuǎn)錄。穩(wěn)定狀態(tài)下,NF-κB一般以p50/p65二聚體形式與IκB結(jié)合存在于胞漿中,形成無活性異源復(fù)合體,抑制蛋白激酶A催化NF-κB磷酸化、NF-κB核轉(zhuǎn)位、NF-κB與靶基因結(jié)合[17]。胞外刺激信號作用下,IκB發(fā)生磷酸化降解,釋放NF-κB從胞漿入核,p65亞基與靶基因κB位點結(jié)合使DNA構(gòu)象發(fā)生變化,啟動或增強(qiáng)其轉(zhuǎn)錄,誘導(dǎo)單核、巨噬細(xì)胞產(chǎn)生免疫炎性細(xì)胞因子如TNF-α、IL-1β等,最終導(dǎo)致炎癥反應(yīng)。Lai等[18]研究發(fā)現(xiàn),闊葉黃檀酚可通過調(diào)控NF-κB/IL-6信號通路改善心肌炎癥,從而預(yù)防心肌梗死。Wang等[19]研究表明,培哚普利通過Toll樣受體4(TLR4)/NF-κB途徑抑制急性心肌梗死小鼠的心肌細(xì)胞凋亡。本研究結(jié)果顯示,經(jīng)葛根素治療后,心肌梗死大鼠心肌組織IκBα表達(dá)水平升高,NF-κB p65表達(dá)水平降低,LPS呈相反的作用效果。LPS干預(yù)后再進(jìn)行葛根素治療,LPS對NF-κB通路相關(guān)蛋白表達(dá)的促進(jìn)或抑制作用被逆轉(zhuǎn),提示葛根素可以通過調(diào)控NF-κB信號通路改善大鼠心肌梗死后VA以及影響其體表心電圖參數(shù)。

綜上所述,葛根素可以改善大鼠心肌梗死后VA,影響體表心電圖參數(shù),可能與調(diào)控NF-κB信號通路相關(guān)蛋白的表達(dá)有關(guān)。此結(jié)果為葛根素相關(guān)藥物的研發(fā)及應(yīng)用于心肌梗死的臨床治療提供了理論支持。

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