截形葉螨雌成螨應(yīng)對高溫脅迫的轉(zhuǎn)錄組分析

俞才蘭,李文亮,張 潔,宋麗雯

(甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué) 植物保護(hù)學(xué)院/甘肅省農(nóng)作物病蟲害生物防治工程實驗室,蘭州 730070)

截形葉螨(Tetranychustruncatus)屬蛛形綱(Arachnida)葉螨科(Tetranychidae)。其在甘肅河西地區(qū)主要為害玉米,由于該地區(qū)晝夜溫差大,氣候干旱,玉米種植面積大,導(dǎo)致該地區(qū)截形葉螨增長迅速,已成為玉米害螨的優(yōu)勢種,對雜交制種試驗田中玉米的產(chǎn)量和質(zhì)量造成嚴(yán)重影響[1-2]。葉螨主要集聚于葉片的背部通過吮吸汁液對作物產(chǎn)生為害,初期葉片上會出現(xiàn)小白斑,為害后期會使寄主植株枯萎甚至死亡[3-4]。

溫度是影響昆蟲生存、生長、繁殖、發(fā)育和傳播的重要因素之一[5-6]。高溫會加快昆蟲個體發(fā)育,縮短世代歷期,降低昆蟲繁殖力[7]。此外,高溫也會改變昆蟲種群動態(tài),降低物種豐富度以及昆蟲的存活率,可以通過向高緯度地區(qū)遷移擴(kuò)張來應(yīng)對溫度的變化[8]。高溫直接或間接影響昆蟲的所有生理過程,通過調(diào)整自身的免疫調(diào)節(jié)途徑或一些酶類來應(yīng)對逆境脅迫,包括熱激蛋白的上調(diào)表達(dá)以及過氧化氫酶(Catalase,CAT)、超氧化物歧化酶(Superoxide dismutase,SOD)、過氧化物酶(Peroxidase,POD)和谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶(Glutathione-S-transferase,GST)等抗氧化酶含量的變化[8-11]。目前,在全球氣候變暖的大背景下,極端高溫天氣出現(xiàn)的頻率顯著增加。因此,昆蟲對高溫的耐受性及其機(jī)理已經(jīng)成為近年來昆蟲學(xué)研究領(lǐng)域中深受重視的問題。

目前,關(guān)于溫度對于截形葉螨影響的研究大多集中在生態(tài)學(xué)和生理生化方面,甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)作物病蟲害生物防治工程實驗室前期研究也證明高溫脅迫對葉螨的生長、發(fā)育和繁殖造成了一定的影響,并且引起了體內(nèi)蛋白、保護(hù)酶等含量的變化[12-14]。且由于截形葉螨目前尚未公布基因組圖譜。因此,本研究采用轉(zhuǎn)錄組測序的方法,分析截形葉螨雌成螨應(yīng)對熱脅迫的差異表達(dá)基因主要功能類群及相關(guān)代謝通路,挖掘潛在的與截形葉螨熱脅迫相關(guān)基因,可為后續(xù)截形葉螨熱脅迫相關(guān)基因的功能研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 供試葉螨

截形葉螨(Tt-S):采集于未施任何農(nóng)藥的玉米田,在甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)作物病蟲害生物防治工程實驗室室溫條件下采用雌(體橢圓形,紅色,體軀兩側(cè)有兩對黑斑,腹部末端呈鈍角)雄(體類似棱形,比雌螨小,淡紅色,腹部末端呈銳角)單系(一雌一雄在飼養(yǎng)臺上飼養(yǎng))飼養(yǎng)擴(kuò)繁,飼養(yǎng)擴(kuò)繁2個月后,將葉螨轉(zhuǎn)移至已提前種好的豇豆幼苗上飼養(yǎng)80代以上,飼養(yǎng)期間葉螨不接觸任何藥劑,以保證其具有較高敏感性。

1.2 供試試劑和儀器

試劑:Trizol,美國Invitrogen公司;NovoStart SYBR qPCR SuperMix Plus試劑盒,近岸蛋白質(zhì)科技有限公司;PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser試劑盒,寶生物工程(大連)有限公司。

儀器:普通T100TMPCR儀,美國伯樂(Bio-Rad)公司;ABI Q5熒光定量PCR儀,美國Applied Bio systems(ABI)公司;NanoPhotometer-N50微量分光光度計,德國Implen公司;B-60S制冰機(jī),太倉市華利達(dá)實驗設(shè)備有限公司。

1.3 葉螨處理

挑取2～3日齡截形葉螨雌成螨200頭于飼養(yǎng)臺,置于40 ℃下處理1 h,記做Tt-MH-S,將處理后存活的葉螨收集到無酶(RNase)離心管,對照為25 ℃下飼養(yǎng)的截形葉螨雌成螨(Tt-S),每個處理設(shè)置4個重復(fù),共計8個樣品。將收集好的樣品用液氮冷凍后在―80 ℃的冰箱中保存。

1.4 Illumina測序與分析

1.4.1 cDNA文庫構(gòu)建與測序 將“1.3”收集到的樣品送至廣州基迪奧生物科技有限公司(廣州)進(jìn)行測序,cDNA文庫的構(gòu)建及上機(jī)測序由該公司完成,測序平臺為Illumina HiSeq 4000。

1.4.2 差異表達(dá)基因功能分析和通路富集分析 由Illumina平臺測序得到原始圖像數(shù)據(jù),經(jīng)過堿基識別(base calling)轉(zhuǎn)化為序列數(shù)據(jù)(raw data),對下機(jī)得到的raw data利用fastp軟件進(jìn)行質(zhì)控,過濾低質(zhì)量數(shù)據(jù),獲得高質(zhì)量過濾數(shù)據(jù)(clean data)。再與前期已測得的截形葉螨三代轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)(由卵和各螨態(tài)雌、雄螨組成的混合樣品經(jīng)測序平臺Pacbio測序技術(shù)得到)進(jìn)行轉(zhuǎn)錄本的校正,并對其進(jìn)行FPKM(基因轉(zhuǎn)錄的每千堿基片段數(shù)/百萬片段測序)轉(zhuǎn)換。使用DESeq2軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析,獲得高溫處理截形葉螨雌成螨的差異表達(dá)基因集?；诓町惙治鼋Y(jié)果,篩選FDR(錯誤發(fā)現(xiàn)率)<0.05且差異倍數(shù) |log2FC|>2的基因為顯著差異基因(DEGs),并對差異基因集進(jìn)行GO(Gene Ontology)功能富集和KEGG(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes)通路富集分析。

1.5 RT-qPCR驗證測序結(jié)果

1.5.1 cDNA的合成 用Trizol法提取總RNA,每個樣品雌成螨約150頭,具體方法參照文獻(xiàn)[15]。取少量RNA在超微量分光光度儀進(jìn)行濃度測定后,根據(jù)寶生物PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser試劑盒反轉(zhuǎn)錄RNA合成第一鏈cDNA,在-20 ℃下保存。

1.5.2 候選基因的引物設(shè)計 為檢驗測序結(jié)果的可靠性與準(zhǔn)確性,根據(jù)轉(zhuǎn)錄組測序數(shù)據(jù)選取21個差異基因進(jìn)行熒光定量驗證。根據(jù)篩選出基因的序列,利用Primer 6設(shè)計出相應(yīng)的定量引物。內(nèi)參基因選用RPS18[16]和Actin[17]。引物序列設(shè)計如表1所示,合成由廣州擎科生物技術(shù)有限公司完成。

表1 截形葉螨qRT-PCR引物序列Table 1 Primer sequences of qRT-PCR for Tetranychus truncatus

1.5.3 RT-qPCR反應(yīng) 采用NovoStart SYBR qPCR SuperMix Plus試劑盒在ABI Q5熒光定量PCR儀中進(jìn)行RT-qPCR反應(yīng)。具體反應(yīng)體系與程序參照文獻(xiàn)[15]。

1.6 數(shù)據(jù)分析

基因的相對表達(dá)量采用2-△△CT方法進(jìn)行計算和分析[18]。采用Origin 2018軟件和SPSS 23軟件對試驗數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 轉(zhuǎn)錄組質(zhì)量測序評估

截形葉螨雌成螨在熱脅迫下的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)如表2所示,共得到高質(zhì)量過濾堿基(Clean bases)約為52.94 Gb,其中各樣本的高質(zhì)量過濾堿基(Clean bases)均超過6.86 Gb。過濾后各樣本讀數(shù)(reads)占比均超過各自原始reads的99%;序列的質(zhì)量參數(shù)Q20(質(zhì)量值達(dá)到20的堿基所占百分比)百分比大于97%,Q30(質(zhì)量值達(dá)到30的堿基所占百分比)百分比大于92%,過濾后的堿基GC含量(堿基G和C的總和占總堿基數(shù)的百分比)大于38%。全部可以比對到參考基因上的讀數(shù)占有效reads的百分比均超過93%。說明此次測序組裝結(jié)果比較可靠,可用于后續(xù)試驗分析。

表2 轉(zhuǎn)錄組測序數(shù)據(jù)質(zhì)量評估Table 2 Quality evaluation of transcriptome sequencing

2.2 差異表達(dá)基因分析

2.2.1 截形葉螨熱脅迫下的差異表達(dá)基因 對高溫和室溫處理下截形葉螨雌成螨的DEGs進(jìn)行火山圖分析(圖1)。發(fā)現(xiàn)相比對照,截形葉螨雌成螨高溫脅迫后,共有17 577個基因的轉(zhuǎn)錄水平發(fā)生了變化,其中12 831個基因表現(xiàn)為上調(diào), 4 746個基因表現(xiàn)為下調(diào)。

紅色表示高溫脅迫上調(diào)表達(dá)的差異基因;藍(lán)色表示高溫脅迫下調(diào)表達(dá)的差異基因(判斷標(biāo)準(zhǔn)為 FDR<0.05, 且差異倍數(shù)兩倍以上),綠色表示沒有差異

2.2.2 差異表達(dá)基因的GO功能分析 截形葉螨雌成螨經(jīng)熱脅迫后DEGs的GO富集分析如圖2所示,這些差異表達(dá)基因主要被注釋到生物學(xué)過程(Biological process)、細(xì)胞成分(Cellular component)和分子功能(Molecular function)3個類別的56個GO terms中,其中參與分子功能的7 481個差異基因注釋到12個terms中,主要在催化活性(Catalytic activity)以及結(jié)合(Binding)等功能顯著富集;參與細(xì)胞組分的6 017個差異基因注釋到20個terms中,顯著富集在細(xì)胞(Cell)、細(xì)胞組分(Cell part)和細(xì)胞器(Organelle)中;參與生物學(xué)過程的8 174個差異基因注釋到24個terms中。主要參與細(xì)胞過程(Cellular process)、單一生物過程(Single-organism process)、代謝過程(Metabolic process)、生物調(diào)節(jié)(Biological regulation)和發(fā)育過程(Developmental process)等生物學(xué)過程。

1.細(xì)胞過程;2.單一生物過程;3.代謝過程;4.生物調(diào)節(jié);5.發(fā)育過程;6.生物過程調(diào)控;7多細(xì)胞有機(jī)過程;8.細(xì)胞組分組織或生物發(fā)生;9刺激響應(yīng);10.細(xì)胞內(nèi)定位;11.信號;12.繁殖;13.繁殖過程;14.多有機(jī)體過程;15.生物過程的負(fù)調(diào)控;16.運動;17.生物過程調(diào)控;18.習(xí)性;19.生長;20.生物附著;21.免疫系統(tǒng)過程;22.節(jié)律過程;23.參與突觸傳遞的突觸前過程;24.生物階段;25.細(xì)胞;26.細(xì)胞組分;27.細(xì)胞器;28.大分子配合物;29.膜;30.細(xì)胞器組分;31.膜組分;32.膜封閉腔;33.細(xì)胞結(jié)合;34.胞外區(qū)域;35.胞外區(qū)域組分;36.突觸;37.突觸組分;38.超分子纖維;39.病毒體;40.病毒組分;41.細(xì)胞外基質(zhì);42.其他有機(jī)體;43.其他有機(jī)體組分;44.細(xì)胞外基質(zhì)成分;45.催化活性;46.結(jié)合;47.轉(zhuǎn)運活性;48.核酸結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子活性;49.信號傳感器活動;50.分子轉(zhuǎn)導(dǎo)活性;51.分子功能調(diào)節(jié)劑;52.結(jié)構(gòu)分子活性;53.轉(zhuǎn)錄因子活性,蛋白質(zhì)結(jié)合;54.抗氧化活性;55.翻譯調(diào)節(jié)活性;56.電子載體活性。橫坐標(biāo)為二級GO term,縱坐標(biāo)為該term里的基因數(shù)量,紅色表示上調(diào),綠色表示下調(diào)

2.2.3 差異表達(dá)基因的KEGG通路富集 對差異基因進(jìn)行KEGG分析,發(fā)現(xiàn)共有5 882個DEGs被注釋到144條通路,圖3為富集顯著的前20條通路,差異表達(dá)基因在代謝途徑(Metabolic pathways,2 146條基因)、溶酶體(Lysosome,598條基因)、碳代謝(Carbon metabolism,335條基因)、脂肪酸代謝(Fatty acid metabolism,257條基因)、氨基酸生物合成(Biosynthesis of amino acids 207條基因)和氧化磷酸化(Oxidative phosphorylation,204條基因)等6條通路顯著富集。

縱坐標(biāo)表示差異顯著前20通路;橫坐標(biāo)為富集因子(該通路中差異基因除以所有數(shù)量);大小表示數(shù)量多少,顏色越紅Q值越小

2.2.4 RT-qPCR驗證測序結(jié)果 本研究對轉(zhuǎn)錄組測序結(jié)果中13條上調(diào)表達(dá)的基因和8條下調(diào)表達(dá)的基因(圖4)進(jìn)行RT-qPCR驗證,結(jié)果表明,12條基因上調(diào)表達(dá),5條基因下調(diào)表達(dá)(圖5)。即截形葉螨雌成螨熱脅迫后有17條基因的RT-qPCR結(jié)果與轉(zhuǎn)錄組測序結(jié)果一致,表明轉(zhuǎn)錄組測序結(jié)果可靠。

圖4 截形葉螨差異基因在RNA-Seq中的表達(dá)量Fig.4 Relative expression of T.truncatus in RNA-Seq

*表示基因差異顯著(P<0.05);**表示基因差異極顯著(P<0.01)

3 討論與結(jié)論

本研究對熱脅迫下的截形葉螨雌成螨進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測序和差異表達(dá)基因分析,GO功能富集發(fā)現(xiàn)這些DEGs主要在細(xì)胞過程(Cellular process)、單生物過程(Single-organism process)、代謝過程(Metabolic process)催化活性(Catalytic activity)和細(xì)胞(Cell)中富集,這些富集注釋主要與細(xì)胞分化(cell differentiation)、生殖發(fā)育(Reproductive development)、細(xì)胞組成(Cell composition)、蛋白質(zhì)的分泌和攝入(Protein secretion and intake)以及酶的合成和代謝(Synthesis and metabolism of enzymes)等有關(guān)。因此推測葉螨可能通過能量代謝及其代謝產(chǎn)物來應(yīng)對溫度脅迫。Li等[19]研究發(fā)現(xiàn),當(dāng)昆蟲受到熱應(yīng)激時,大多數(shù)蛋白質(zhì)的合成會減少。KEGG分析發(fā)現(xiàn),差異基因主要富集在代謝途徑(Metabolic pathways)和溶酶體(Lysosome)等通路。Vatanparast等[20]對高溫脅迫秋粘蟲后差異基因的研究發(fā)現(xiàn),秋粘蟲的DEGs通常在與能量代謝相關(guān)的途徑中積累,且許多代謝過程基因的轉(zhuǎn)錄在高溫環(huán)境下受到抑制。Ran等[21]發(fā)現(xiàn)氨基酸合成代謝上調(diào),產(chǎn)生大量氨基酸,為耐熱蛋白的合成提供原料。本研究結(jié)果也表明高溫脅迫下DEGs在葉螨各種能量代謝的途徑中富集,其體內(nèi)脂肪酸代謝合成途徑的表達(dá)響應(yīng)高溫而上調(diào)。

有關(guān)研究發(fā)現(xiàn)抗氧化酶是保護(hù)昆蟲免受高溫脅迫的一類重要酶系。如程杰[5]研究發(fā)現(xiàn)高溫會引起昆蟲的氧化應(yīng)激反應(yīng),昆蟲會產(chǎn)生CAT、SOD和POD等抗氧化酶來消除活性氧的影響。崔娟等[22]研究發(fā)現(xiàn)抗氧化酶在昆蟲抵御高溫脅迫的過程中發(fā)揮著重要作用,篩豆龜蝽(Megacoptacribraria)成蟲可有效抵御熱脅迫誘導(dǎo)的活性氧,進(jìn)而表現(xiàn)出對高溫較強(qiáng)的適應(yīng)性。本研究發(fā)現(xiàn)截形葉螨雌成螨在熱脅迫后,體內(nèi)抗氧化酶基因均顯著上調(diào)表達(dá),推測抗氧化酶基因在截形葉螨應(yīng)對高溫脅迫時發(fā)揮著重要的作用。

此外,熱激蛋白作為一類分子伴侶,也是昆蟲響應(yīng)高溫脅迫的重要組成部分。朱宇等[8]發(fā)現(xiàn)二化螟(Chilosuppressalis)熱激蛋白Hsp70、熱激蛋白Hsp90和小分子熱激蛋白能夠提高二化螟幼蟲對高溫的適應(yīng)性。宋杰[9]研究結(jié)果顯示,在42 ℃持續(xù)高溫脅迫下,二化螟熱休克轉(zhuǎn)錄因子蛋白基因的相對表達(dá)量會顯著上調(diào),以抵消高溫對自身造成的影響。楊麗紅[23]研究發(fā)現(xiàn)柑橘全爪螨(Panonychuscitri)的PcHsp90和PcHsp70基因在抵御高溫脅迫方面發(fā)揮著重要作用。本研究結(jié)果顯示,截形葉螨雌成螨熱脅迫后,熱激蛋白基因的表達(dá)量發(fā)生了變化,推測熱激蛋白可能在截形葉螨雌成螨應(yīng)對熱脅迫時也發(fā)揮了作用。

綜上所述,截形葉螨雌成螨可能從能量代謝、抗氧化防御、分子伴侶等多方面應(yīng)對高溫脅迫,因此,后期可采用RT-qPCR和RNA干擾相結(jié)合的方法篩選對熱脅迫相關(guān)重要基因進(jìn)行功能分析和驗證,為揭示截形葉螨耐熱機(jī)制奠定一定的基礎(chǔ)。