羥苯磺酸鈣對7種基于Trinder反應(yīng)原理的生化檢驗項目的干擾性研究*

梁 莉,王鳳英,李衛(wèi)彬,韋燕金,羅昌亮△

1.廣西壯族自治區(qū)人民醫(yī)院檢驗科,廣西南寧 530000;2.廣西壯族自治區(qū)賓陽縣人民醫(yī)院檢驗科,廣西南寧 530400;3.廣西壯族自治區(qū)橫州市婦幼保健院檢驗科,廣西橫州 530300

生化檢驗是臨床診斷和治療的重要輔助手段。隨著檢驗技術(shù)的不斷進步,生化檢驗的結(jié)果也更加全面、準確、快速。但由于分析過程的復雜性,在實際檢測時有諸多影響結(jié)果分析的干擾因素。目前,許多實驗室都存在難以把控分析前質(zhì)量控制的現(xiàn)狀,因藥物干擾導致檢測結(jié)果不準確的現(xiàn)象越來越受到臨床和檢驗工作者的重視。因為被干擾的結(jié)果可能會誤導臨床以為是藥物的藥理作用或者患者病情發(fā)生變化[1],影響醫(yī)生的判斷和患者的治療,降低實驗室信任度。所以,研究藥物干擾機制,尋求更優(yōu)檢測方法仍然是檢驗工作者的重任。

Trinder反應(yīng)(偶聯(lián)終點比色法)作為經(jīng)典生化反應(yīng),有許多檢驗項目都以其為反應(yīng)基礎(chǔ)。比如肌氨酸氧化酶法檢測肌酐(Cr),尿酸氧化酶-過氧化物酶(POD)法檢測尿酸(UA),膽固醇氧化酶法檢測膽固醇,甘油磷酸氧化酶(GPO)-POD法檢測甘油三酯(TG),色原底物法檢測脂肪酶(LPS),氧化酶法檢測葡萄糖等。由于催化Trinder反應(yīng)的POD對底物的特異性較差,谷胱甘肽、膽紅素、維生素C、酚磺乙胺、左旋多巴、羥苯磺酸鈣等多種具有還原性的物質(zhì)都可能使檢測結(jié)果產(chǎn)生誤差。羥苯磺酸鈣是臨床用于治療和預防糖尿病并發(fā)癥的常用藥物[2],關(guān)于羥苯磺酸鈣對Cr[3-4]和UA[5]的干擾已有報道,但其對同樣應(yīng)用了Trinder反應(yīng)原理的血清脂類[6]的干擾研究卻鮮有報道。在本實驗室檢測系統(tǒng)中,LPS項目檢測亦基于Trinder反應(yīng)原理,因此預測其也有類似的干擾效果。但目前關(guān)于羥苯磺酸鈣干擾LPS檢測的相關(guān)報道較少。

美國臨床和實驗室標準協(xié)會(CLSI)發(fā)布了EP7-A3文件[7]的臨床化學干擾實驗指南,與2005年發(fā)布的EP7-A2文件[8]相比,有不少變動[9]。因此,本研究參照EP7-A3文件,開展了羥苯磺酸鈣對血清Cr、UA、總膽固醇(TC)、TG、高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)、低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)、LPS測定的體外干擾試驗。

1 材料與方法

1.1材料 干擾藥物:羥苯磺酸鈣標準品(干粉,純度>98%)來自貴州迪大科技有限責任公司。根據(jù)文獻資料[10-11]及藥代動力學發(fā)現(xiàn),羥苯磺酸鈣作為一種常見的改善微循環(huán)的血管保護藥,健康成人單次口服500 mg后,約6 h達峰濃度(8 mg/L左右)。目前羥苯磺酸鈣的臨床常規(guī)推薦劑量為500 mg,每天3次,其血漿穩(wěn)態(tài)濃度約在15 mg/L。羥苯磺酸鈣在組織中分布廣泛,與血漿蛋白結(jié)合率為20%～25%,但不能透過血腦屏障。其主要以原形通過腎臟排泄,口服24 h后約有50%的藥物從尿中排出,其中僅有10%為代謝產(chǎn)物,靜注24 h內(nèi)約有75%隨尿排出。其藥代動力學特征符合二房室模型,β相消除半衰期為4.1 h。

1.2儀器與試劑 分析系統(tǒng):美國貝克曼庫爾特AU5800全自動生化分析儀、四川優(yōu)普系列純水設(shè)備ULPS-500DRO。儀器按照標準操作程序定期進行保養(yǎng)和校準,各項目的性能驗證指標均符合要求,對檢驗項目每天進行質(zhì)控,監(jiān)測其穩(wěn)定性。

檢測試劑:(1)Cr(肌氨酸氧化酶法,批號2508);(2)UA(尿酸氧化酶-POD法,批號AUZ9453);(3)TC(酶法,批號AUZ9011);(4)TG(GPO-POD法,批號AUZ9583);(5)HDL-C(直接法,批號AUZ9506);(6)LDL-C(直接法,批號AUZ9625);(7)LPS(色原底物法,批號2680);(8)生化多項校準品(批號1123E,有效期2024-05-01);(9)HDL-C校準品(批號1066A,有效期2023-01-01);(10)LDL-C校準品(批號1067A,有效期2022-12-01),以上均為貝克曼庫爾特公司原裝配套產(chǎn)品。室內(nèi)質(zhì)控品采用由美國伯樂公司生產(chǎn)的多項目臨床化學定值質(zhì)控血清。

1.3基礎(chǔ)血清池

1.3.1血清標本 分別收集廣西壯族自治區(qū)人民醫(yī)院健康體檢中心的體檢者Cr、UA、TC、TG、HDL-C、LDL-C的低濃度和高濃度血清標本各5份。納入標準:(1)近1個月內(nèi)無羥苯磺酸鈣用藥史的體檢者標本;(2)當天完成檢測的新鮮血清,狀態(tài)良好,無黃疸、溶血、脂血(高濃度TG標本除外);(3)各項目的檢測值接近EP7-A3文件[7]推薦的低濃度和高濃度。

1.3.2LPS標本 收集當天健康體檢中心<30歲體檢者的標本5份,混合后作為低濃度血清標本;選用3 d內(nèi)門急診患者高濃度血清標本2份。要求標本無黃疸、溶血、脂血,近期無羥苯磺酸鈣用藥史。將2個濃度的血清按照一定的比例混合,制備成濃度接近本實驗室LPS參考范圍上限(67 U/L)和上限3倍[12]的對照標本。

1.3.3平均濃度 分別將各項目基礎(chǔ)血清充分混合后作為對照組標本,每份標本連續(xù)測定20次,計算平均濃度。

1.4方法

開花后12～15天，豆莢色綠柔軟，尚未木質(zhì)化，是采收嫩莢的適宜時期。此時生長迅速、纖維少，切忌采摘過遲，造成纖維增加，莢壁粗硬，品質(zhì)變劣，不能食用。一般3～5天采收1次。開花至結(jié)莢40～50天，豆莢變褐色，基本干枯，應(yīng)及時采摘老莢。采收過遲，則豆莢自然開裂。采后攤曬脫粒，晾干貯藏。

1.4.1干擾物質(zhì)制備 按照EP7-A3文件[7]的指示,為了盡可能少地稀釋標本基質(zhì),羥苯磺酸鈣濃縮液的濃度為推薦濃度(60 mg/L)的20倍。用電子天平(上海安亭)量取120.0 mg羥苯磺酸鈣標準品,加入100 mL純水,充分溶解后得到1 200 mg/L濃縮貯存液。

1.4.2重復次數(shù)的確定 計算最大允許誤差(δ)/批內(nèi)變異系數(shù)(CV)百分率(σ)的比值,對照CLSI EP7-A3[7]文件中的《δ/σ與重測次數(shù)對應(yīng)表》,可得出每個檢測對象所需的重復測定次數(shù)。δ是基于生物學變異[13]的可接受偏差范圍,Cr、UA、TC、TG、HDL-C、LDL-C和LPS的δ分別為±3.96%、±4.87%、±4.10%、±9.57%、±5.61%、±5.46%和±11.31%;σ是通過重復測定20次對照標本計算得到的。經(jīng)計算,各項目高低2個濃度的δ/σ均>3(表1),因此,每個樣品所需的重復測定次數(shù)為3次。

表1 基礎(chǔ)血清池濃度與δ/σ

1.4.3配對差異實驗 選取0、60 mg/L分別作為羥苯磺酸鈣的最低和最高干擾濃度。取基礎(chǔ)血清1.9 mL加入羥苯磺酸鈣濃縮貯存液0.1 mL作為干擾實驗組;另取基礎(chǔ)血清1.9 mL加入純水0.1 mL作為對照組。分別測定兩組中各項目的濃度,每組重復測定3次。

1.5劑量效應(yīng)實驗

1.5.1有干擾的項目 繼續(xù)按照以下方式制備6個藥物干擾濃度:(1)最低和最高干擾濃度。干擾濃度標本制備同配對差異實驗中的干擾實驗組和對照組;(2)另外3個干擾濃度標本按照75%低濃度+25%高濃度、50%低濃度+50%高濃度、25%低濃度+75%高濃度進行混合配制;(3)因羥苯磺酸鈣單次給藥500 mg,6 h后峰濃度約為8 mg/L,故本研究增加了7.5 mg/L(87.5%低濃度+12.5%高濃度)的劑量。

1.5.2標本測定 在同一分析批內(nèi)分別檢測以上6個干擾濃度的標本,每份標本重復測定3次。為了平均系統(tǒng)漂移的影響,第1組按照干擾物濃度升序測定,第2組按降序測定,第3組按升序測定。

1.5.3實驗數(shù)據(jù)分析 通過GraphPad Prism 9.0軟件,以羥苯磺酸鈣濃度(mg/L)為X軸,以%d0bs為Y軸,繪制點對點曲線圖,短虛線表示每個分析項目的允許誤差。

2 結(jié) 果

表2 配對差異實驗結(jié)果

2.2劑量效應(yīng)實驗 通過檢查散點圖可知,本實驗沒有缺失值和離群值,且每組數(shù)據(jù)均值構(gòu)成單調(diào)遞減序列,即隨著藥物濃度的升高,干擾效應(yīng)越來越大。從劑量效應(yīng)實驗結(jié)果可以看出,低濃度羥苯磺酸鈣即可對Cr、UA、LPS(低濃度)的檢測產(chǎn)生干擾,而對TC、TG、HDL-C、LPS(高濃度)的起始干擾濃度相對較高。通過點對點分析,估算假設(shè)干擾的相對偏差為允許誤差時,羥苯磺酸鈣對各項目的最小干擾濃度分別是Cr(低濃度)0.8 mg/L,Cr(高濃度)1.4 mg/L;UA(低濃度)6.3 mg/L,UA(高濃度)8.3 mg/L;TC(低濃度)20.7 mg/L,TC(高濃度)22.5 mg/L;TG(低濃度)17.7 mg/L,TG(高濃度)34.1 mg/L;HDL-C(低濃度)16.1 mg/L,HDL-C(高濃度)32.2 mg/L;LPS(低濃度)7.8 mg/L,LPS(高濃度)24.2 mg/L。當羥苯磺酸鈣濃度為15 mg/L(血漿穩(wěn)態(tài)濃度)時,Cr、UA、LPS(低濃度)均顯示出藥物負干擾。見圖1。

注:A～F分別為Cr、UA、TC、TG、HDL-C、LPS的劑量效應(yīng)實驗折線圖。

3 討 論

影響檢驗結(jié)果的因素很多,除了飲食、運動、標本采集、檢驗方法、實驗條件、儀器及試劑外,藥物是一個非常重要的因素。隨著藥物種類和檢驗項目的增加,這個問題日益突出。藥物均具有化學結(jié)構(gòu)及生物活性,其自身可以直接對機體造成影響,引起體內(nèi)環(huán)境生理、生化的改變,或者直接對檢測方法產(chǎn)生作用,進而對檢測結(jié)果造成干擾。

本研究中的羥苯磺酸鈣早已在我國市場投入使用,其應(yīng)用廣、市場價格低,相關(guān)商品有貝多斯、昊暢、安多明、導升明等,臨床常用來治療和預防糖尿病并發(fā)癥(如糖尿病視網(wǎng)膜病變)[13]、腎病、周圍神經(jīng)病變等,還可以用于治療其他微循環(huán)障礙。羥苯磺酸鈣與其他藥物聯(lián)合應(yīng)用,可以減輕不良反應(yīng),用藥也相對安全,其改善血管的療效顯著,是一種長效使用藥物,目前關(guān)于其藥理作用及臨床應(yīng)用還在不斷拓寬。

由于服用羥苯磺酸鈣的患者經(jīng)常出現(xiàn)胱抑素C、尿素與Cr結(jié)果不相符的情況,而UA與Cr又同屬腎功能指標,所以該藥物對Cr、UA的干擾已有不少研究。但同樣采用POD指示系統(tǒng)的血脂項目受飲食影響較大,檢測結(jié)果的波動容易被忽視,且糖尿病患者經(jīng)常出現(xiàn)血脂異常等并發(fā)癥,因此藥物對脂類檢測的干擾容易誤導臨床醫(yī)師對檢測結(jié)果做出不正確的判斷。另外,本實驗室的LPS檢測是應(yīng)用色原底物法,筆者也將其加入了研究。血清LPS是一類能分解脂肪生成甘油和游離脂肪酸,具有多種催化功能的消化酶。LPS合成于胰腺的腺泡組織,具有較高的器官特異性,在胰腺炎發(fā)病早期,即可檢測到血清LPS水平的升高,且呈規(guī)律性升高,持續(xù)時間長。急性胰腺炎是一種臨床上常見、發(fā)病急、病情兇險、病死率高的急腹癥,及時抽血檢查血清LPS和淀粉酶,對疾病診斷、治療和預后有重要意義[14]。研究表明,早期檢測血清LPS能較好地區(qū)分急性和非急性胰腺炎,其血清水平和胰腺炎病情進展程度呈正相關(guān),陽性率高達92%,具有較高的靈敏度,是診斷胰腺炎病情的主要監(jiān)測指標。另外,LPS與糖類抗原199、惡性腫瘤因子的聯(lián)合檢測可提高胰腺癌患者的早期診斷價值[15]。

本研究實驗數(shù)據(jù)表明,在7個基于Trinder反應(yīng)的測定中,外源性添加羥苯磺酸鈣對血清Cr、UA、TC、TG、HDL-C、LPS項目明顯表現(xiàn)出劑量依賴性的負干擾,而對LDL-C測定則無干擾。該結(jié)果與GUO等[6]的研究一致。羥苯磺酸鈣在Cr、UA、TG和LPS的檢測中干擾效果尤為明顯,低濃度藥物即可對Cr、UA、LPS(低濃度)的檢測產(chǎn)生干擾,TC、TG、HDL-C、LPS(高濃度)的起始干擾濃度相對較高。此外,在相同的藥物干擾濃度下,同一項目的低濃度標本比高濃度標本受到的干擾效應(yīng)更大,特別是LPS項目,兩個濃度的干擾百分比相差兩倍以上。當干擾效應(yīng)的相對偏差為允許誤差時,各項目均表現(xiàn)出高濃度標本的藥物最小干擾濃度比低濃度標本更高,甚至相差一倍以上。對此,分析原因可能是因為這些干擾效應(yīng)是根據(jù)百分比偏差進行比較的,當絕對差異相差不大時,對照值基數(shù)越小,百分比偏差越大。也有可能是藥物在反應(yīng)過程中需要消耗一定量的過氧化氫(H2O2),而高濃度血清在反應(yīng)時可能產(chǎn)生更多的H2O2,從而減弱藥物的干擾。

在臨床生化檢驗項目中,Trinder反應(yīng)應(yīng)用廣泛,其原理是氧化酶催化反應(yīng)產(chǎn)生H2O2,在POD的作用下,分解出氧,將無色的還原型4-氨基安替比林與酚,偶聯(lián)氧化縮合成紅色的醌類化合物。其生成物色澤深淺在一定范圍內(nèi)與代謝物濃度呈正比。Trinder反應(yīng)第一步特異性相當強,第二步特異性較差,易發(fā)生各種干擾。羥苯磺酸鈣對Trinder反應(yīng)的干擾機制尚未明確,分析原因可能如下:(1)羥苯磺酸鈣的基本結(jié)構(gòu)是二羥基苯環(huán),它具有較強的還原性,能與色原性物質(zhì)競爭H2O2,從而使氧化過程中產(chǎn)生的H2O2被消耗,導致色素團形成減少,使檢測結(jié)果假性偏低;(2)由于POD對底物的專一性差,它可能對羥苯磺酸鈣也有氧化作用,導致羥苯磺酸鈣與色原體競爭POD,延緩或者減少了醌類基團的形成;(3)羥苯磺酸鈣可能會影響生色基團的穩(wěn)定性[16-17];(4)羥苯磺酸鈣可能與偶聯(lián)終點比色法反應(yīng)中的其他成分發(fā)生反應(yīng),減少生色基團的形成,從而產(chǎn)生負干擾。7個研究項目中,只有LDL-C的檢測沒有表現(xiàn)出干擾效應(yīng),原因可能為:(1)7個項目檢測方法中,只有LDL-C檢測有兩次產(chǎn)生H2O2的過程,即先用保護劑使低密度脂蛋白不參與酶促反應(yīng),再通過膽固醇酯酶和膽固醇氧化酶的反應(yīng),將所有非低密度脂蛋白的脂蛋白(包括高密度脂蛋白、極低密度脂蛋白、乳糜顆粒)分解,這一過程產(chǎn)生的H2O2可能與羥苯磺酸鈣反應(yīng),消除了它的干擾;(2)7個項目中只有LDL-C的試劑盒里加入了疊氮鈉(過氧化氫酶抑制劑),該物質(zhì)可能會抑制羥苯磺酸鈣的干擾;(3)不同試劑盒所使用底物體系的結(jié)構(gòu)、敏感度、濃度的差異,使檢測受到的干擾程度不同。

內(nèi)源性干擾如溶血、脂濁、黃疸等容易被檢驗工作者關(guān)注,但外源性干擾比如藥物影響較難被發(fā)現(xiàn)。藥物對檢測結(jié)果的影響不容輕視,然而目前我國的藥品說明書普遍缺乏藥物對實驗室檢測指標的干擾分析,而試劑廠商一般只對溶血、黃疸等干擾情況進行評價,缺少藥物干擾信息。因此,在實驗室工作中應(yīng)對本實驗室所用的儀器設(shè)備、試劑方法學局限性等有充足的了解;熟悉藥物的血藥濃度水平、半衰期、排泄途徑和清除率等;并且加強與臨床的溝通聯(lián)系,了解患者的用藥情況,同時注意觀察患者的病情、用藥及檢測結(jié)果變化,不斷積累經(jīng)驗。許多藥物對檢測結(jié)果的干擾常與血藥濃度呈正相關(guān),因此采血時間應(yīng)盡量避開血藥高峰期,在病情允許的情況下,可在停藥幾天后采血以排除藥物對檢測結(jié)果的影響;同時要積極開展研究工作,收集整理相關(guān)信息,不斷提高辨識和排除干擾的能力。這樣才有可能切實降低因檢測結(jié)果偏差給患者帶來的風險,對提高檢驗質(zhì)量及臨床診療工作具有重要意義。

綜上所述,在7個基于Trinder反應(yīng)原理的生化檢驗項目中,羥苯磺酸鈣對血清LDL-C檢測無干擾,對Cr、UA、TC、TG、HDL-C、LPS測定可產(chǎn)生不同程度的負干擾,且表現(xiàn)為劑量依賴性,即隨著藥物濃度的升高,干擾效應(yīng)越來越大,其中Cr和LPS表現(xiàn)尤為明顯。為了盡量避免羥苯磺酸鈣對生化檢驗項目的干擾,建議使用羥苯磺酸鈣的患者應(yīng)在臨床醫(yī)生的評估下暫時停藥3～5 d后再進行抽血檢測;如果病情不允許,建議患者在服藥前完成抽血,以盡量減少干擾程度。而作為檢驗工作者,當知道患者服用過羥苯磺酸鈣后,可以適當對患者血清進行稀釋,降低藥物濃度,從而減少藥物對實驗的干擾。如果實驗室同時有多個生化檢測系統(tǒng),可更換系統(tǒng)進行復檢。必要時可采用不受藥物干擾的液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法測定血清Cr、UA、TC、TG和HDL-C濃度。對于LPS,比濁法也可以作為一種替代方法。