芹菜素調(diào)節(jié)OPG/RANKL/RANK信號通路對創(chuàng)傷性骨折大鼠骨折愈合的影響*

陳 月,苗存良,安志輝,杜蒙蒙,劉國峰,賈天陽,李 盼

邯鄲市中心醫(yī)院手足顯微外科,河北邯鄲 056001

創(chuàng)傷性骨折是指機(jī)體受到暴力或處于疲勞狀態(tài)下,導(dǎo)致骨骼或者骨小梁出現(xiàn)部分或者完全中斷,給患者的心理和生活帶來了極大的痛苦[1-2]。因此,尋求較好的治療方案成為當(dāng)今研究的重點(diǎn)。有研究指出,多模式康復(fù)治療,內(nèi)外兼治,可外治創(chuàng)傷腫脹,內(nèi)調(diào)氣血[3]。其中骨一方、六藤湯等中草藥用于臨床治療,起到活血化瘀、清熱解毒等作用,可有效防止血栓形成,但是這些藥物無法從根本上治愈創(chuàng)傷性骨折,只能減輕患者疼痛。芹菜素作為一種天然類黃酮化合物,具有抗炎、抗病毒、抗氧化、擴(kuò)張血管等多種藥理作用,且芹菜素具有無誘變性和低毒性的特點(diǎn),常被應(yīng)用于各項研究[4]。目前已知骨保護(hù)素(OPG)/核因子κB受體活化因子配體(RANKL)/核因子κB受體活化因子(RANK)是骨調(diào)節(jié)和破骨細(xì)胞分化、成熟過程中的重要信號通路[5]。但是芹菜素對創(chuàng)傷性骨折大鼠OPG/RANKL/RANK信號通路的影響研究較少。因此,本研究構(gòu)建創(chuàng)傷性骨折大鼠骨折模型,使用芹菜素干預(yù)該模型,旨在從OPG/RANKL/RANK信號通路揭示芹菜素對創(chuàng)傷性骨折大鼠骨折愈合的影響,為創(chuàng)傷性骨折患者的治療提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1材料 清潔級雄性SD大鼠60只,7～8周齡,體重240～270 g,購自河北賽業(yè)生物科技有限公司,許可證號:SCXK(冀)2020-0031。飼養(yǎng)條件:溫度24 ℃,濕度50%,自由進(jìn)食進(jìn)水。本研究經(jīng)本院倫理委員會批準(zhǔn)。

1.2儀器與試劑 醫(yī)用克氏針(型號ZAZJ-I)購自上海紫靄醫(yī)療器械有限公司,計算機(jī)斷層掃描儀(型號Eplus-166 PET)購自杭州高能醫(yī)療設(shè)備有限公司,顯微鏡(型號SMZ745)、實時熒光定量PCR(qPCR)儀(型號eQ162CP)均購自上海普赫生物科技有限公司,酶標(biāo)儀(型號HBS-ScanX)購自南京德鐵實驗設(shè)備有限公司,凝膠成像系統(tǒng)(型號BOT-850)購自北京中儀博騰科技有限公司。芹菜素(批號SA831-60),原料藥,純度≥98.5%,購自陜西新陽禾生物科技有限公司;傷科接骨片(批號20210317)購自大連美羅中藥廠有限公司;番紅O-固綠染色試劑盒、骨鈣素(BGP)、堿性磷酸酶(ALP)、誘導(dǎo)型一氧化氮合酶(iNOS)、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、白細(xì)胞介素(IL)-6酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)試劑盒,PCR擴(kuò)增試劑盒,BCA蛋白測定試劑盒均購自美國AbMole公司;TRIzol試劑,兔源OPG、RANKL、RANK單克隆抗體均購自美國SantaCruz公司;羊抗鼠二抗(批號LG3892)購自北京雷根生物技術(shù)有限公司。

1.3方法

1.3.1創(chuàng)傷性骨折大鼠模型的構(gòu)建及分組給藥 結(jié)合文獻(xiàn)[6]中的方法,采用閉合式股骨干骨折術(shù),構(gòu)建創(chuàng)傷性骨折大鼠模型。首先將大鼠以戊巴比妥鈉麻醉,局部去毛、消毒。用1.0 mm醫(yī)用克氏針從左股骨髁間窩處垂直穿入,直至髓腔;然后稍增大入針點(diǎn),改換另一方向?qū)⒖耸厢槻迦胨枨?之后拔出克氏針,在股骨中段以一拇指為支點(diǎn),輕而緩慢的折骨,當(dāng)感覺到骨折時即可停止用力,避免骨折移位;最后將克氏針從最初穿針點(diǎn)穿入,直至骨折遠(yuǎn)端,剪掉克氏針體外多余部分,針尾埋于皮下,用碘附進(jìn)行局部消毒后,將大鼠放入籠中飼養(yǎng)。按照隨機(jī)數(shù)字表法將建模成功的大鼠分為模型組,芹菜素低(10 mg/kg)、中(20 mg/kg)、高(40 mg/kg)劑量組[7]和陽性對照組(傷科接骨片,0.33 g/kg)[8],每組10只。另隨機(jī)選取10只健康大鼠作為對照組(不進(jìn)行任何處理)。芹菜素低、中、高劑量組分別給予芹菜素10、20、40 mg/kg灌胃給藥(濃度分別為1、2、4 mg/mL的芹菜素溶液,灌胃體積10 mL/kg);陽性對照組給予大鼠0.33 g/kg的傷科接骨片灌胃(0.033 g/mL傷科接骨片混懸液,灌胃體積10 mL/kg);模型組和對照組大鼠給予等體積生理鹽水灌胃;每天給藥1次,連續(xù)給藥30 d。

1.3.2取材及骨小梁密度、厚度檢測 給藥結(jié)束后,采用戊巴比妥鈉對大鼠麻醉,腹主動脈取血3 mL,分離血清,儲存于-70 ℃冰箱中,用于后續(xù)ELISA檢測。大鼠實施安樂死,去毛、消毒,分離骨折周圍軟骨組織,快速置于4%的多聚甲醛中固定24 h,制備石蠟切片,用于后續(xù)番紅O-固綠染色觀察軟骨組織病理學(xué)變化。同時取出大鼠骨折的股骨組織,用計算機(jī)斷層掃描儀計算大鼠骨小梁密度和厚度,之后儲存于-70 ℃冰箱中,用于后續(xù)檢測。

1.3.3番紅O-固綠染色觀察軟骨組織病理學(xué)變化 取1.3.2中石蠟切片,在二甲苯中固定30 min;隨后用濃度為100%、95%、85%、75%的乙醇溶液中分別脫水6 min;蒸餾水沖洗后,用鐵蘇木素液染色10 min;隨后置于1%的醋酸溶液中快速沖洗,入固綠染液中浸染,蒸餾水沖洗;入番紅O染液中浸染,蒸餾水沖洗;最后用不同濃度的乙醇脫水,加二甲苯透明處理,用中性樹脂封片;顯微鏡下觀察拍照。

1.3.4ELISA檢測大鼠血清中BGP、ALP、iNOS、TNF-α和IL-6水平 取出1.3.2中儲存的血清,按照ELISA試劑盒說明書操作,首先將所有試劑充分混勻,按照比例稀釋標(biāo)準(zhǔn)品,離心后取上清液,之后置入酶標(biāo)孔中,用封板膠紙封住反應(yīng)孔,室溫孵育,依次加入工作液、顯色底物,每個樣品做3個復(fù)孔,同時設(shè)立平行對照孔,利用酶標(biāo)儀檢測450 nm處的吸光度,繪制相應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)曲線,依次測定各組大鼠血清中BGP、ALP、iNOS、TNF-α、IL-6水平。

1.3.5qPCR檢測大鼠股骨組織OPG、RANKL、RANK mRNA水平 取上述1.3.2中適量備用股骨組織,研磨勻漿后用TRIzol試劑分離總RNA,反轉(zhuǎn)錄成cDNA后進(jìn)行qPCR反應(yīng)。引物由天津海普斯基因科技有限公司合成,序列見表1。設(shè)置溫度程序如下:93 ℃ 1 min,95 ℃ 19 s、60 ℃ 21 s、72 ℃ 13 s進(jìn)行41個循環(huán)。以GAPDH為內(nèi)部參照,采用2-ΔΔCt方法檢測股骨組織OPG、RANKL、RANK mRNA水平。

表1 引物序列

1.3.6蛋白質(zhì)印跡法檢測大鼠股骨組織OPG、RANKL、RANK蛋白水平 取上述1.3.2中適量備用股骨組織,研磨后加入細(xì)胞裂解液裂解,用BCA法對蛋白進(jìn)行定量,將蛋白樣品置于凝膠電泳上進(jìn)行分離、轉(zhuǎn)膜,5%脫脂奶粉封閉1.5 h,加入兔源OPG(1∶550)、RANKL(1∶750)、RANK(1∶500)、β-actin(1∶700)一抗,4 ℃孵育過夜。加入羊抗兔二抗(1∶1 150)常溫孵育1.5 h,經(jīng)TBST清洗。ECL顯色試劑顯影后置于凝膠成像儀掃描觀察,用Image J軟件分析蛋白條帶灰度值,計算得到大鼠股骨組織OPG、RANKL、RANK蛋白水平。

2 結(jié) 果

2.1芹菜素對創(chuàng)傷性骨折大鼠骨小梁密度和厚度的影響 與對照組比較,模型組大鼠骨小梁密度和厚度降低(P<0.05);與模型組比較,芹菜素低、中、高劑量組大鼠骨小梁密度和厚度依次升高(P<0.05);芹菜素高劑量組和陽性對照組大鼠骨小梁密度和厚度差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。見表2。

表2 芹菜素對創(chuàng)傷性骨折大鼠骨小梁密度和厚度的影響

2.2芹菜素對創(chuàng)傷性骨折大鼠骨折周圍軟骨組織病理學(xué)變化的影響 番紅O-固綠染色后,深紅色部位為軟骨組織,對照組大鼠軟骨組織無變化,結(jié)構(gòu)完整;與對照組比較,模型組大鼠軟骨組織出現(xiàn)嚴(yán)重?fù)p傷;經(jīng)芹菜素低、中、高劑量干預(yù)后,大鼠軟骨組織損傷出現(xiàn)不同程度地好轉(zhuǎn);其中芹菜素高劑量組效果最佳,且與陽性對照組比較,效果差異不明顯。見圖1。

注:A、B、C、D、E、F分別為對照組,模型組,芹菜素低、中、高劑量組,陽性對照組大鼠軟骨組織病理圖。

2.3芹菜素對創(chuàng)傷性骨折大鼠血清BGP、ALP水平的影響 與對照組比較,模型組大鼠血清BGP、ALP水平降低(P<0.05);與模型組比較,芹菜素低、中、高劑量組大鼠血清BGP、ALP水平依次升高(P<0.05);芹菜素高劑量組和陽性對照組大鼠血清BGP、ALP水平差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。見表3。

表3 芹菜素對創(chuàng)傷性骨折大鼠血清BGP、ALP水平的影響

2.4芹菜素對創(chuàng)傷性骨折大鼠血清炎癥因子水平的影響 與對照組比較,模型組大鼠血清iNOS、TNF-α和IL-6水平升高(P<0.05);與模型組比較,芹菜素低、中、高劑量組大鼠血清iNOS、TNF-α和IL-6水平依次降低(P<0.05);芹菜素高劑量組和陽性對照組大鼠血清iNOS、TNF-α和IL-6水平差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。見表4。

表4 芹菜素對創(chuàng)傷性骨折大鼠血清炎癥因子水平的影響

2.5芹菜素對創(chuàng)傷性骨折大鼠股骨組織OPG、RANKL、RANK mRNA水平的影響 與對照組比較,模型組大鼠股骨組織OPG mRNA水平降低(P<0.05),RANKL、RANK mRNA水平升高(P<0.05);與模型組比較,芹菜素低、中、高劑量組大鼠股骨組織OPG mRNA水平依次升高(P<0.05),RANKL、RANK mRNA水平依次降低(P<0.05);芹菜素高劑量組和陽性對照組大鼠股骨組織OPG、RANKL、RANK mRNA水平差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。見表5。

表5 芹菜素對創(chuàng)傷性骨折大鼠股骨組織OPG、RANKL、RANK mRNA水平的影響

2.6芹菜素對創(chuàng)傷性骨折大鼠股骨組織OPG、RANKL、RANK蛋白水平的影響 與對照組比較,模型組大鼠股骨組織OPG蛋白水平降低(P<0.05),RANKL、RANK蛋白水平升高(P<0.05);與模型組比較,芹菜素低、中、高劑量組大鼠股骨組織OPG蛋白水平依次升高(P<0.05),RANKL、RANK蛋白水平依次降低(P<0.05);芹菜素高劑量組和陽性對照組大鼠股骨組織OPG、RANKL、RANK蛋白水平差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。見表6、圖2。

注:A為對照組;B為模型組;C為芹菜素低劑量組;D為芹菜素中劑量組;E為芹菜素高劑量組;F為陽性對照組。

表6 芹菜素對創(chuàng)傷性骨折大鼠股骨組織OPG、RANKL、RANK蛋白水平的影響

3 討 論

創(chuàng)傷性骨折是指骨的連續(xù)性和完整性發(fā)生中斷,造成創(chuàng)傷性骨折的原因往往是一些無法預(yù)估的突發(fā)事件。一旦人體發(fā)生骨折后,不及時治療或者治療方法不當(dāng),會引發(fā)骨折移位、肢體畸形、關(guān)節(jié)炎或者骨頭壞死等嚴(yán)重后果,給患者造成更大的心理和經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān),所以骨折后的骨愈合成為人們關(guān)注的焦點(diǎn)。骨愈合過程主要包括炎癥、間充質(zhì)細(xì)胞凝結(jié)、軟骨形成、血管生成和成骨,是一種獨(dú)特的再生過程[9-10]。本研究采用閉合式股骨干骨折術(shù)構(gòu)建創(chuàng)傷性骨折大鼠模型,發(fā)現(xiàn)模型組大鼠骨小梁密度和厚度均降低,軟骨組織損傷嚴(yán)重,血清TNF-α、iNOS、IL-6水平升高,表示創(chuàng)傷性骨折大鼠模型構(gòu)建成功,并已產(chǎn)生炎癥反應(yīng),可進(jìn)行下一步研究。

骨形成可以促進(jìn)骨折損傷處的修補(bǔ),加快骨愈合。骨形成的標(biāo)志是ALP活性和BGP水平。血清中ALP和BGP水平越高,機(jī)體內(nèi)成骨活動越強(qiáng),骨折愈合速度越快[11]。本研究中模型組大鼠血清ALP、BGP水平低于對照組,提示創(chuàng)傷性骨折大鼠的骨愈合緩慢。張震等[6]研究表明,在骨折愈合過程中,細(xì)胞因子參與調(diào)節(jié)炎癥、軟骨形成和骨重塑過程,其中iNOS、TNF-α和IL-6是造成骨關(guān)節(jié)炎的主要促炎細(xì)胞因子[12-14]。芹菜素具有抗炎、抗病毒、抗氧化、擴(kuò)張血管等多種藥理作用和生物學(xué)特性,隨著對其藥理作用的深入研究,芹菜素在很多疾病治療中發(fā)揮良好的作用。黃斌等[15]研究發(fā)現(xiàn),芹菜素可以減小肥胖大鼠氧化應(yīng)激損傷,減輕炎癥反應(yīng)。高衛(wèi)良等[16]研究證明,芹菜素可能通過抑制炎癥反應(yīng)、細(xì)胞凋亡而起到保護(hù)髓核細(xì)胞的作用。本研究發(fā)現(xiàn),經(jīng)傷科接骨片和不同濃度的芹菜素處理后,創(chuàng)傷性骨折大鼠軟骨組織損傷得到有效緩解,血清iNOS、TNF-α、IL-6水平降低,骨小梁密度、厚度、ALP、BGP水平升高。這表明芹菜素在一定程度上可以促進(jìn)創(chuàng)傷性大鼠骨折愈合,減輕炎癥反應(yīng)。

OPG和RANKL作為腫瘤壞死因子受體超家族成員,OPG可以抑制破骨細(xì)胞的分化、成熟,升高骨密度;而RANKL可以活化破骨細(xì)胞,促進(jìn)破骨細(xì)胞的分化、成熟。RANK是RANKL的唯一受體,一旦與RANKL結(jié)合便可以增強(qiáng)破骨細(xì)胞功能[17]。OPG/RANKL/RANK信號通路在骨生物學(xué)中被廣泛提及。張峻瑋等[18]研究發(fā)現(xiàn),骨碎補(bǔ)可以通過激活OPG/RANKL/RANK信號通路,抑制破骨細(xì)胞分化、成熟,從而預(yù)防骨質(zhì)疏松。ZHAO等[19]研究發(fā)現(xiàn)低劑量的阿司匹林可以升高ALP水平,促進(jìn)鈣吸收,可能與上調(diào)OPG及抑制RANKL/RANK軸有關(guān),為新的抗骨質(zhì)疏松藥物的開發(fā)提供了線索。研究發(fā)現(xiàn)通過激活OPG/RANKL/RANK信號通路,改善局部缺血缺氧環(huán)境,可預(yù)防股骨頭壞死[20]。本研究結(jié)果表明,與對照組比較,模型組大鼠股骨組織OPG mRNA和蛋白水平降低,RANKL、RANK mRNA和蛋白水平升高;經(jīng)傷科接骨片及不同濃度的芹菜素處理后,大鼠股骨組織OPG mRNA和蛋白水平升高,RANKL、RANK mRNA和蛋白水平降低。表明芹菜素可能通過上調(diào)OPG表達(dá),抑制RANKL、RANK表達(dá),減輕炎癥反應(yīng),促進(jìn)骨愈合。

綜上所述,芹菜素可以減輕創(chuàng)傷性骨折大鼠炎癥反應(yīng),促進(jìn)骨折愈合,其機(jī)制可能與上調(diào)OPG表達(dá),抑制RANKL/RANK信號通路有關(guān),本研究為芹菜素治療創(chuàng)傷性骨折提供了有力證據(jù)。但芹菜素是否通過其他通路間接參與創(chuàng)傷性骨折的愈合,有待進(jìn)一步實驗驗證。