基于輔助生殖人群的染色體多態(tài)性回顧性研究*

趙冰清,高 選,劉 敏,陳 虹,李江夏

1.山東大學生殖醫(yī)學研究中心(山東大學附屬生殖醫(yī)院)/山東大學生殖內(nèi)分泌教育部重點實驗室醫(yī)學檢驗科,山東濟南 250012;2.山東大學基礎(chǔ)醫(yī)學院醫(yī)學遺傳學系/實驗畸形學教育部重點實驗室,山東濟南 250012

輔助生殖技術(shù)(ART)是采用醫(yī)療輔助方法幫助不孕不育夫婦成功妊娠的技術(shù),隨著ART的不斷發(fā)展和成熟,該技術(shù)在臨床上的應用越來越廣泛。不孕不育指的是夫妻同房一年以上未采取任何避孕措施,性生活正常但無法成功妊娠。目前約10%～15%的育齡夫婦存在不孕不育狀況[1]。導致不孕不育的原因復雜,主要包括遺傳、免疫、內(nèi)分泌、生殖器官結(jié)構(gòu)異常等因素。染色體多態(tài)性是遺傳因素之一,是指染色體異染色質(zhì)區(qū)顯帶處理后帶紋寬窄或著色強度改變的微小差異,主要包括:(1)非近端著絲粒染色體長臂異染色質(zhì)區(qū)的增減,主要是1、9、16號染色體次縊痕區(qū)長度;(2)近端著絲粒染色體(D/G組染色體)短臂上隨體和次縊痕區(qū)長度的變化;(3)9號染色體臂間倒位;(4)Y染色體多態(tài)性,包括Y染色體長臂異染色區(qū)長度的增減及臂間倒位。

本研究主要分析不孕不育夫婦的染色體多態(tài)性,比較不同染色體多態(tài)性的種類、發(fā)生率及其與患者激素水平、女性患者獲卵數(shù)[1]和男性患者精液情況的關(guān)系,從而探討染色體多態(tài)性對不孕不育夫婦的臨床影響,增強臨床對染色體多態(tài)性的重視,幫助臨床更好地為不孕不育患者做好遺傳咨詢,選擇合適的治療方案和技術(shù)。

1 資料與方法

1.1一般資料 選取2016年1月至2019年11月在山東大學附屬生殖醫(yī)院進行ART的91 908例患者(45 954對夫婦)為研究對象。納入標準:夫婦同時進行外周血染色體檢查和生殖激素檢測并獲得結(jié)果,男性進行精液檢測,女性進行取卵檢查。排除標準:臨床資料不全或未進行上述項目檢測者,夫婦染色體核型皆為多態(tài)性者。本研究經(jīng)山東大學附屬生殖醫(yī)院倫理委員會批準,并簽署知情同意書。

1.2方法

1.2.1染色體檢查 常規(guī)從患者肘正中靜脈抽取外周靜脈血1.0 mL,肝素抗凝,雙人核對后接種于裝有5 mL RPMI的1640培養(yǎng)管中,置于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中。培養(yǎng)68～72 h后加入40 μg/mL秋水仙素至終濃度為0.4 μg/mL,繼續(xù)培養(yǎng)1.5 h,采用染色體自動收獲儀制備懸液,常規(guī)滴片、烤片、胰酶消化和吉姆薩染色行G顯帶。GSL-120染色體全自動分析儀掃片后,依據(jù)相關(guān)標準進行染色體核型分析。對每個受檢者分析5個核型,計數(shù)20個分裂象,對于嵌合核型者加倍計數(shù)。

1.2.2精液檢查 男性患者禁欲2～7 d后手淫取精,30 min內(nèi)體溫保溫送檢,精液標本接收后放在37 ℃恒溫水浴箱中進行液化,利用西班牙SCA精液分析儀,參照相關(guān)標準進行精液常規(guī)分析。

1.2.3生殖激素檢查 采用羅氏cobas e601型全自動電化學發(fā)光分析儀檢測卵泡刺激素(FSH)、黃體生成素(LH)、睪酮(T)、垂體催乳素(PRL)、雌二醇(E2)、促甲狀腺激素(TSH)水平,其中原裝配套試劑與質(zhì)控品由羅氏醫(yī)療設(shè)備有限公司提供,具體步驟嚴格遵照說明書進行。

1.3統(tǒng)計學處理 采用SPSS21.0軟件進行數(shù)據(jù)處理和統(tǒng)計學分析。不呈正態(tài)分布的計量資料以M(P25,P75)表示,組間比較采用秩和檢驗;計數(shù)資料以例數(shù)和百分率表示,組間比較采用χ2檢驗。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié) 果

2.1患者染色體核型檢測結(jié)果 在91 908例患者中共檢出染色體正常核型80 938例,占88.06%;染色體畸變核型3 852例,占4.19%;染色體多態(tài)性核型7 118例,占7.74%。其中,男性染色體畸變2 392例,占男性患者總數(shù)的5.21%,女性染色體畸變1 460例,占女性患者總數(shù)的3.18%;男性染色體多態(tài)性4 018例,占男性患者總數(shù)的8.74%,女性患者染色體多態(tài)性3 100例,占女性患者總數(shù)的6.74%。男性染色體畸變和多態(tài)性檢出率皆明顯高于女性(P<0.05)。見表1。

表1 患者染色體核型檢測結(jié)果

2.2男性染色體多態(tài)性患者各項指標比較 統(tǒng)計染色體多態(tài)性患者的精液、生殖激素和獲卵數(shù)的檢測結(jié)果,篩檢后染色體多態(tài)性組有4 434例(男2 280例,女2 154例)。將夫婦雙方染色體核型皆正常者設(shè)為對照組(1 189例),根據(jù)染色體多態(tài)性的不同形態(tài),將男性染色體多態(tài)性患者進一步分為Y組(522例)、inv(9)組(223例)、D/G組(626例)、1qh+組(641例)、9/16組(268例)。與對照組比較,Y組精子濃度和精子總活力降低,FSH和LH水平升高,差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05),T和PRL在各組間比較,差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。見表2。為進一步分析不同Y染色體核型的影響,將Y組進一步分為4組:Yqh-組(152例)、Yqh+組(283例)、inv組(33例)、qs組(13例)、del(Y)組(41例)。結(jié)果發(fā)現(xiàn),Yqh+組數(shù)量最多,占Y組的54.21%,Yqh-組占29.12%。與縮減對照組比較,Yqh-組、del(Y)組精子濃度、精子總活力降低,FSH和LH水平升高,Yqh+組精子濃度、精子總活力降低,差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05),見表3。

表2 男性染色體多態(tài)性患者各項指標比較[M(P25,P75)]

表3 不同Y染色體多態(tài)性患者各項指標比較[M(P25,P75)]

2.3女性染色體多態(tài)性患者各項指標比較 根據(jù)染色體多態(tài)性的不同形態(tài),將女性染色體多態(tài)性患者進一步分為inv(9)組(275例)、D/G組(859例)、1/9/16組(1 020例)。結(jié)果顯示,inv(9)組獲卵數(shù)低于對照組,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05),FSH、LH、E2、T、PRL、TSH在各組比較,差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05),見表4。

表4 女性染色體多態(tài)性患者各項指標比較[M(P25,P75)]

3 討 論

染色體多態(tài)性主要表現(xiàn)為異染色質(zhì)區(qū)域的變異,特別是含有高度重復DNA的異染色質(zhì),其中DNA在分子水平上主要是“非編碼”的高度重復序列,為無轉(zhuǎn)錄活性的結(jié)構(gòu)基因[2]。因此染色質(zhì)多態(tài)性一直以來被認為是正常變異,沒有臨床病理意義[3]。但近年來研究表明,異染色質(zhì)在維持染色體正常結(jié)構(gòu)和功能中發(fā)揮重要作用。異染色質(zhì)在著絲粒功能中發(fā)揮重要作用,是姐妹染色單體結(jié)合和染色體分離所必需的[4]。通過染色體重排,常染色質(zhì)易位到異染色質(zhì)會誘導常染色質(zhì)異染色質(zhì)化,抑制基因表達,從而導致患者不育[5]。已有報道表明,染色體多態(tài)性在普通人群中的發(fā)生率在2%～5%,在不孕不育人群中的發(fā)生率在10%～15%[6-7]。這說明染色體多態(tài)性與不孕不育的發(fā)生有一定的關(guān)系,染色體多態(tài)性會引起一定的臨床表現(xiàn)[8-10]。本研究對進行ART的不孕不育夫婦外周血染色體核型進行回顧性分析,發(fā)現(xiàn)染色體多態(tài)性患者占7.74%,該數(shù)值低于上述報道不孕不育患者染色體多態(tài)性的發(fā)生率,這原因可能與目前臨床普遍認為染色體多態(tài)性不影響生育從而不建議患者實施ART有關(guān)。本研究還發(fā)現(xiàn)男性染色體多態(tài)性的檢出率要高于女性,這可能與男性特有的Y染色體多態(tài)性有關(guān)[11]。

Y染色體多態(tài)性主要包括Yqh+、Yqh-和Y倒位。田艷等[12]研究表明,與健康對照組比較,Yqh+組、Yqh-組精子密度和精子總活力明顯降低。李磊磊[13]研究顯示,與精子濃度正常者比較,無精子癥、少精子癥患者Y染色體多態(tài)性占比有明顯差異,且隨著精子濃度的減少,Yqh+和Yqh-占比明顯增加。馮曉琴等[14]發(fā)現(xiàn),Yqh-組的精子濃度明顯少于對照組。本研究結(jié)果顯示,Yqh+組和Yqh-組精子濃度和精子總活力都明顯低于對照組,表明Yqh+或Yqh-影響精子生成和精子活動,與上述研究結(jié)果一致。Yqh+是指Y染色體長臂異染色質(zhì)區(qū)長度增加,該區(qū)域含有與精子分化和發(fā)育相關(guān)的基因,該區(qū)域過度重復會影響減數(shù)分裂時染色體的配對聯(lián)會,從而影響精子受精能力或生成[15]。Yqh-是指Y染色體長臂異染色質(zhì)區(qū)長度減少,Y染色體異染色質(zhì)減少,導致常染色質(zhì)排列松散,或是由于DNA排列過密,造成基因功能的喪失[16]。汪小波等[17]發(fā)現(xiàn)部分Yqh-多態(tài)性在分子水平實為Y染色體微缺失,且認為未檢查到Y(jié)染色體微缺失的Yqh-可歸因于分子檢測標記的覆蓋度不足,提示臨床應對Yqh-的患者進一步行分子水平檢測。del(Y)是指Y染色體長臂部分缺失,屬于染色體結(jié)構(gòu)異常,攜帶者主要表現(xiàn)為生精功能障礙[18]。臨床上將長度小于21號染色體的Y診斷為Yqh-,而del(Y)染色體長度往往也小于21號染色體,就導致在細胞水平上難以鑒別二者。本研究發(fā)現(xiàn),與對照組比較,del(Y)組的精子濃度和精子總活力降低、FSH和LH水平升高,這與Yqh-組結(jié)果相同。該結(jié)果進一步說明分子水平檢測對鑒別del(Y)和Yqh-的重要性。

生理狀態(tài)下血清生殖激素水平受下丘腦-垂體-睪丸軸調(diào)控,睪丸具有內(nèi)分泌功能,其間質(zhì)細胞可分泌雄激素(主要是T),T的作用為啟動和維持生精。FSH作用于支持細胞,生成雄激素結(jié)合蛋白,從而維持T水平以促進精子成熟[19-20],LH主要促進睪丸間質(zhì)細胞合成和分泌T,維持精子生成[21]。已有研究表明,Y染色體微缺失會影響睪丸的生精功能,使其不能分泌足夠的抑制素去調(diào)節(jié)FSH和LH水平,從而導致二者水平升高[22]。本研究發(fā)現(xiàn)del(Y)組、Yqh-組血清FSH、LH水平高于對照組,而PRL、T水平無明顯差異,臨床應該重視Y染色體多態(tài)性對男性生殖激素水平的影響。

人類6%～8%的異染色質(zhì)分布于9號染色體上,導致9號染色體結(jié)構(gòu)的高度多態(tài)性[14]。本研究同樣發(fā)現(xiàn),女性染色體多態(tài)性患者9號染色體倒位與獲卵數(shù)有關(guān),與生殖激素分泌水平無關(guān),其他染色體多態(tài)性與獲卵數(shù)和生殖激素皆無關(guān)系。已有研究表明,9號染色體倒位可以抑制減數(shù)分裂轉(zhuǎn)錄因子和RNA聚合酶Ⅲ的功能[23],因而9號染色體倒位可導致相應區(qū)域的重排,影響相關(guān)基因的表達,從而影響母原細胞減數(shù)分裂產(chǎn)生卵子。本研究的發(fā)現(xiàn)再次提示臨床應該重視9號染色體倒位對卵子質(zhì)量的潛在遺傳效應。

綜上所述,本研究中男性染色體多態(tài)性Yqh+、Yqh-與男性不育有關(guān),女性染色體多態(tài)性9號染色體倒位對獲卵數(shù)有影響。臨床應該加大關(guān)注力度,進一步明確染色體多態(tài)性對于不孕不育患者的診療和輔助生殖的意義。