四種生物活性肽對(duì)順鉑所致小鼠腎毒性和骨髓抑制毒性的影響

趙 瑩,游普云,盛譽(yù)妍,高 璐,朱奎成,何美霞

1)鄭州大學(xué)醫(yī)藥科學(xué)研究院 鄭州 450052 2)鄭州大學(xué)醫(yī)學(xué)科學(xué)院 鄭州 450052

順鉑是腫瘤化療的主要藥物之一,但腎毒性和骨髓抑制毒性影響了其在臨床上的應(yīng)用[1]。目前對(duì)于順鉑不良反應(yīng)的處理手段十分有限,急需有效的藥物。生物活性肽是一類來源于動(dòng)植物并具有生物活性的肽類物質(zhì),其作用主要包括抗氧化、調(diào)節(jié)血壓、降低膽固醇、抑菌、抗腫瘤和提高免疫力等[2]。本研究通過制作小鼠順鉑腎損傷模型,研究白蛋白肽、小麥低聚肽、大豆肽和玉米低聚肽這4種生物活性肽對(duì)順鉑不良反應(yīng)的影響,同時(shí)探討其藥理活性與抗氧化作用的關(guān)系,旨在為生物活性肽類的開發(fā)和臨床應(yīng)用提供參考。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物、主要試劑與儀器C57BL/6雄性小鼠,SPF級(jí),6～8周齡,體重160～170 g,許可證號(hào):SCXK(豫)2017-0001,由河南省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。順鉑(江蘇豪森藥業(yè)股份有限公司),尿素氮(BUN)、血肌酐(Scr)、谷胱甘肽(GSH)、丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)、過氧化氫酶(CAT)檢測試劑盒和總蛋白定量試劑盒均購自南京建成生物工程研究所;ATP含量檢測試劑盒和超微量Na+,K+-ATP檢測試劑盒購自北京索萊寶科技有限公司。YQ-3 型電動(dòng)漩渦勻漿機(jī)(江蘇江陰周莊科研器械廠),IMark 酶標(biāo)儀(北京友華照欽醫(yī)療器械有限公司),ULTRA-TURRAX高速分散機(jī)(德國IKA公司),Pentra 80全自動(dòng)血細(xì)胞計(jì)數(shù)儀(日本HORIBA公司),透射電子顯微鏡(日本Hitachi公司),超聲波粉碎機(jī)(寧波新芝生物科技股份有限公司)。

1.2 實(shí)驗(yàn)分組及給藥將42只C57BL/6雄性小鼠采用隨機(jī)數(shù)字表法均分為6組(n=7):正常對(duì)照組、順鉑模型組、白蛋白肽組、小麥低聚肽組、大豆肽組、玉米低聚肽組。4種生物活性肽組每天先以4 mg/kg劑量腹腔注射順鉑,30 min后以600 mg/kg劑量灌胃給予活性肽,隔天1次;順鉑模型組每天以4 mg/kg劑量腹腔注射順鉑,30 min后灌胃給予等體積的蒸餾水,隔天1次;正常對(duì)照組每天腹腔注射等體積的生理鹽水。以上處理持續(xù)5 d,共注射3次。

1.3 外周血白細(xì)胞計(jì)數(shù)(WBC)和血小板計(jì)數(shù)(PLT)的檢測在各組小鼠給藥后第6天,眼內(nèi)眥靜脈取血約1 mL,加EDTA抗凝,用血細(xì)胞計(jì)數(shù)儀檢測WBC、PLT。

1.4 血清中BUN、Scr、GSH含量和CAT活性的檢測將1.3中所取靜脈血離心取血清,按照試劑盒說明操作,檢測BUN、Scr、GSH含量和CAT活性。

1.5 腎臟MDA含量和SOD活性的檢測給藥后第6天,將小鼠頸椎脫臼處死后分離左側(cè)腎臟,稱取0.1 g腎臟皮質(zhì)組織塊置于0.9 mL生理鹽水中,用勻漿機(jī)制備組織勻漿,向組織勻漿中加入1.5 mL組織裂解液,2 min后4 ℃、2 000 r/min離心15 min,取上清液,按試劑盒說明操作,檢測MDA含量和SOD活性。

1.6 腎臟線粒體中ATP含量和Na+,K+-ATP活性的檢測取1.5中離心后的沉淀物,按照試劑盒說明操作,檢測ATP含量和Na+,K+-ATP活性。

1.7 腎組織病理學(xué)觀察及腎損傷評(píng)分對(duì)小鼠腎臟冠狀位前1/2組織進(jìn)行脫水、透明、包埋、切片,行PAS染色。每個(gè)切片選擇5個(gè)區(qū)域,在顯微鏡下觀察腎小管和腎小球的形態(tài)結(jié)構(gòu)。腎小管擴(kuò)張、刷狀緣脫落、腎細(xì)胞壞死、空泡化等為腎組織損傷表現(xiàn)。根據(jù)損傷面積進(jìn)行腎損傷評(píng)分。0分:無損傷;1分:損傷面積<10%;2分:損傷面積10%～;3分:損傷面積25%～;4分:損傷面積50%～;5分:損傷面積>75%。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理采用SPSS 19.0進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。各組間所有指標(biāo)的比較均采用單因素方差分析,兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)。檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 各組小鼠外周血WBC和PLT的比較結(jié)果見表1。由表1可知,與正常對(duì)照組相比,順鉑模型組小鼠WBC、PLT降低;與順鉑模型組相比,4種生物活性肽組小鼠WBC、PLT增加。

表1 各組小鼠外周血WBC和PLT的比較(n=7)

2.2 各組小鼠血清中BUN、Scr、GSH含量和CAT活性的比較結(jié)果見表2。由表2可知,與正常對(duì)照組相比,順鉑模型組小鼠血清中BUN、Scr含量升高,GSH含量和CAT活性降低;與順鉑模型組相比,4種生物活性肽組小鼠BUN、Scr含量降低,GSH含量和CAT活性升高。

表2 各組小鼠血清中BUN、Scr、GSH含量和CAT活性的比較(n=7)

2.3 各組小鼠腎臟中MDA含量和SOD活性的比較結(jié)果見表3。由表3可知,與正常對(duì)照組相比,順鉑模型組腎臟中MDA含量升高,SOD活性下降;與順鉑模型組相比,4種生物活性肽組MDA含量均下降,SOD活性均上升。

表3 各組小鼠腎臟中MDA含量和SOD活性的比較(n=7)

2.4 各組小鼠腎臟線粒體中ATP含量和Na+,K+-ATP活性的比較與正常對(duì)照組相比,順鉑模型組小鼠線粒體/ATP含量和Na+,K+-ATP活性均降低;與順鉑模型組相比,4種生物活性肽組線粒體中ATP含量和Na+,K+-ATP活性均升高(表4)。

表4 各組小鼠腎臟線粒體中ATP含量和Na+,K+-ATP活性的比較(n=7)

2.5 各組小鼠腎組織病理學(xué)表現(xiàn)和腎損傷評(píng)分的比較結(jié)果見圖1和表5。正常對(duì)照組小鼠腎小管形態(tài)完整,排列整齊。順鉑模型組小鼠腎小管上皮細(xì)胞出現(xiàn)水腫、壞死,并向管腔內(nèi)脫落,管腔狹窄。4種生物活性肽組小鼠腎小管上皮細(xì)胞水腫現(xiàn)象均明顯減輕,結(jié)構(gòu)也較為完整。與正常對(duì)照組比較,順鉑模型組腎損傷評(píng)分升高;與順鉑模型組相比,4種生物活性肽組腎損傷評(píng)分均降低。

A:正常對(duì)照組;B:順鉑模型組;C:白蛋白肽組;D:小麥低聚肽組;E:大豆肽組;F:玉米低聚肽組

表5 各組小鼠腎損傷評(píng)分的比較(n=7)

3 討論

順鉑是臨床上應(yīng)用廣泛且療效可靠的廣譜抗腫瘤藥物,具有明顯的腎毒性和骨髓抑制毒性[3]。順鉑的腎毒性主要表現(xiàn)為腎小管上皮細(xì)胞急性壞死、變性及腎間質(zhì)水腫等,大劑量或連續(xù)用藥可導(dǎo)致腎功能衰竭甚至死亡[4];順鉑的骨髓抑制毒性主要表現(xiàn)為WBC和PLT減少[5]。本實(shí)驗(yàn)中在小鼠腹腔注射順鉑后,腎毒性和骨髓抑制毒性指標(biāo)明顯改變,表明小鼠順鉑腎毒性和骨髓抑制毒性模型復(fù)制成功。此外,研究[6]發(fā)現(xiàn)氧化應(yīng)激與順鉑的毒性有關(guān)。血清中GSH含量和CAT活性、腎組織中MDA含量和SOD活性可以反映抗氧化能力的變化。在本實(shí)驗(yàn)中,順鉑可以導(dǎo)致小鼠血清中GSH含量、CAT活性和腎組織中SOD活性降低,腎組織中MDA含量升高,進(jìn)一步說明了順鉑所致腎損傷可能與氧化應(yīng)激反應(yīng)有關(guān)。

目前臨床上針對(duì)順鉑的骨髓抑制毒性,大多采用提升WBC和PLT等藥物,但這類藥物不僅價(jià)格高,而且本身就有較多的不良反應(yīng),如肌肉骨骼系統(tǒng)毒性和消化系統(tǒng)毒性,甚至還可能造成休克和間質(zhì)性肺炎等[7]。白蛋白肽、小麥低聚肽、大豆肽和玉米低聚肽這4種生物活性肽具有抗氧化、抗炎及免疫調(diào)節(jié)等生物活性[8],可通過清除ROS、降低MDA含量和增強(qiáng)抗氧化酶的活性[9-10]等途徑,減輕氧化應(yīng)激損傷。此外,它們還有安全性高、易于吸收、來源廣泛以及價(jià)格低廉等優(yōu)點(diǎn)[11]。在本研究中,給予這4種生物活性肽后,模型小鼠外周血WBC、PLT提升,血清中BUN、Scr含量降低,血清中GSH含量、CAT活性以及腎組織中SOD活性和腎線粒體中ATP含量、Na+,K+-ATP活性升高,腎組織中MDA含量下降,表明這4種生物活性肽均對(duì)順鉑導(dǎo)致的骨髓抑制有明顯的緩解作用,而且可以提高小鼠的腎功能,改善腎小管損傷和腎臟線粒體損傷。

結(jié)合實(shí)驗(yàn)結(jié)果可以推測,這4種生物活性肽緩解順鉑所致腎損傷和骨髓抑制毒性可能與以下機(jī)制有關(guān)。①自由基清除作用:肽鏈上的組氨酸殘基可作為氫的受體直接清除自由基,還能與Fe3+螯合減少活性氧自由基的生成[12];芳香族氨基酸如酪氨酸和苯丙氨酸往往通過向缺電子自由基提供質(zhì)子來清除單線態(tài)氧,主要是氧自由基和超氧陰離子自由基[13];此外,還可能通過氧化應(yīng)激通路促進(jìn)組織中SOD活性的提高,加速ROS的清除,有效降低體內(nèi)的氧化水平[14]。②抗脂質(zhì)過氧化作用:肽末端含有疏水性氨基酸,能提供疏水環(huán)境,增強(qiáng)肽與不飽和脂肪酸的作用,從而有效促進(jìn)膜脂過氧化[8]。自由基被清除也可減弱生物膜的過氧化反應(yīng)[15],進(jìn)而減輕順鉑所致的腎損傷。③改善線粒體功能:氧化應(yīng)激產(chǎn)生過多的氧自由基,可引發(fā)堿基配對(duì)錯(cuò)誤和鏈斷裂等線粒體損傷,以及線粒體膜脂質(zhì)過氧化導(dǎo)致的線粒體功能障礙[11]。4種生物活性肽可使小鼠腎臟線粒體中ATP含量和Na+,K+-ATP活性升高,維持其正常的膜通透性和膜電位。④增強(qiáng)機(jī)體免疫功能:4種生物活性肽緩解骨髓抑制毒性的作用機(jī)制可能與增加T淋巴細(xì)胞數(shù)量有關(guān)[5,8],還需要進(jìn)一步深入的研究。

總之,本研究證實(shí)了白蛋白肽、小麥低聚肽、大豆肽和玉米低聚肽這4種生物活性肽均能明顯減輕順鉑所致的小鼠腎毒性和骨髓抑制毒性;同時(shí),這4種生物活性肽可改善腎臟線粒體損傷,降低腎組織氧化應(yīng)激水平。