水產(chǎn)品中丁香酚類化合物檢測

◎陳曉青

（普識（廈門）檢測認證有限公司，福建 廈門 361100）

1 丁香酚類化合物概述

丁香酚（G0H12O2）是一種植物化學物質(zhì)，存在于丁香、肉豆蔻油、肉桂、羅勒和月桂葉中。有研究表明，低濃度條件下，丁香酚類化合物具有抗菌和抗氧化雙重活性，但在高濃度條件下，卻表現(xiàn)出毒副作用[1]。如高濃度丁香酚顯示出對小鼠具有致癌和致突變作用。此外，部分研究顯示丁香酚類化合物具有肝毒性、促炎癥、皮膚刺激性等危害，但其發(fā)揮功能活性和產(chǎn)生健康危害間的劑量界限仍較為模糊[2]。因此，人們對丁香酚類化合物的功能活性、毒副作用的研究越來越多，其檢測方法也趨于多樣化。世界衛(wèi)生組織食品添加劑聯(lián)合專家委員會（JECFA）已確定可接受的人均丁香酚日攝入量為2.5 mg·kg-1（JECPA 2006）。日本規(guī)定水產(chǎn)品可采用丁香酚類化合物作為麻醉劑，最大殘留限量為50.0 μg·kg-1。然而，目前我國尚未出臺政策規(guī)定其添加限制和檢測方法。因此，建立丁香酚類化合物的標準檢測方法具有重要的意義。本文基于2019年我國市場監(jiān)管總局發(fā)布的《水產(chǎn)品及水中丁香酚類化合物的測定》（BJS 201908）公告，在查閱相關(guān)文獻的基礎(chǔ)上，對目前丁香酚類化合物的檢測方法進行綜合闡述，以期為丁香酚類化合物的檢測及風險控制提供理論指導(dǎo)。

2 丁香酚類化合物檢測方法

2.1 氣相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法（GC-MS/MS）

該方法為《水產(chǎn)品及水中丁香酚類化合物的測定》（BJS 201908）中規(guī)定的檢測方法，首先配制標準工作液：以1 mg·mL-1的丁香酚類物質(zhì)標準液作為母液，吸取該母液100 mL，乙腈定容至10 mL，得到濃度為10 μg·mL-1的標準物質(zhì)中間液，利用中間液依次稀釋至1 000 ng·mL-1、500 ng·mL-1、200 ng·mL-1、100 ng·mL-1和40 ng·mL-1，即為標準工作液。水產(chǎn)品在檢測前，需進行粉碎、乙腈提取、DMSO輔助氮吹的方法使樣品中的丁香酚類化合物得到濃縮，其中氮吹所用溫度為40 ℃。所得濃縮樣品過0.45 μm濾器待測。氣相色譜柱為DB-1701（30.0 m×0.25 mm×0.25 μm），升溫程序為初始溫度100 ℃保持1 min，之后6 ℃/min 升溫至200 ℃,然后25 ℃·min-1升溫至260 ℃，保持5 min；進樣口溫度設(shè)為230 ℃，以氦氣為載氣。質(zhì)譜中電離方式為電子轟擊電離源，離子源溫度230 ℃。GC-MS/MS可用于水及水產(chǎn)品，如淡水蝦、淡水魚、海水蝦、海水魚中的丁香酚類化合物（丁香酚、甲基丁香酚、異丁香酚、順式-甲基異丁香酚、乙酸丁香酚酯、乙酰基異丁香酚）的檢測。該方法在水取樣量2 g或水產(chǎn)品取樣量5 g，均定容至1 mL時，各丁香酚類化合物的檢出限為0.01 mg·kg-1，定量限為0.02 mg·kg-1[3]。本法限制性在于氣相色譜法氣化時的高溫會影響丁香酚類化合物的穩(wěn)定性。

2.2 液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法（HPLC-MS/MS）

為克服GC-MS/MS中進樣口高溫對檢測樣品的影響，學者們嘗試通過不需高溫的HPLC-MS/MS進行丁香酚類化合物的檢測。標準工作液準備步驟與GCMS/MS相同，但所得最終濃度為500 ng·mL-1、200 ng·mL-1、100 ng·mL-1、50 ng·mL-1和20 ng·mL-1。樣品中丁香酚類物質(zhì)提取除GC-MS/MS中所述步驟外，該方法利用了OasisμPRiME HLB固相萃取柱對樣品進行凈化處理。在對樣品的濃縮過程中，與GC-MS/MS所述方法不同，該法經(jīng)嘗試不同濃縮條件后確定不加DMSO，在35 ℃條件下進行氮吹，此條件下加標樣品回收率較高。液相色譜柱采用Phenomenex Kinetex C18 柱（100 mm×3.0 mm，2.6 mm），以水（流動相A）和甲醇（流動相B）作為流動相進行梯度洗脫：0~1 min時，50%B；1~5 min時，50%~70%B；5~6 min時，70%B；6~8 min時，70%~95%B；8~11 min時，95%B；10~13 min時，50%B。流動相流速為0.3 mL/min，柱溫控制在40 ℃，進樣體積1μL。在該液相條件下，6種丁香酚類物質(zhì)可得到有效分離。質(zhì)譜條件采用電噴霧離子源，離子源溫度設(shè)為550 ℃，霧化器流量60 L·min-1。采用以上方法對養(yǎng)殖水、蝦和鯽魚中的丁香酚類化合物進行了不同水平的加標回收試驗。結(jié)果顯示，丁香酚類化合物加標回收率均在72.6%~109.2%，相對標準偏差小于15%，檢出限與定量限與GC-MS/MS相同，其準確度及精密度均可滿足相關(guān)分析測試要求[4]。

2.3 固相微萃取-高效液相色譜檢測法

由于水產(chǎn)品中丁香酚類化合物含量低且干擾物復(fù)雜，直接對樣品進行檢測較難實現(xiàn)。為避免水產(chǎn)品中基質(zhì)干擾，有必要在檢測前對目標化合物進行純化分離和富集。學者們嘗試通過不同方法對樣品中的丁香酚類化合物進行萃取、濃縮后再進行檢測。因萃取過程即對丁香酚類化合物進行了分類純化，故后續(xù)檢測只需采用HPLC即可進行，不再需要質(zhì)譜檢測。有學者通過合成氟化共價有機聚合物（F-COP），再通過黏合法將F-COP涂層均勻的分布于石英棒表面，得到F-COP-SPME石英棒。在樣品經(jīng)過GC-MS/MS中的處理過程后，將3 mL溶液置于4 mL樣品瓶中，插入F-COP-SPME石英棒，室溫下萃取30 min后，采用乙腈聯(lián)合超聲方法對石英棒中的丁香酚類化合物進行解吸，所得解吸液過0.45μm濾器后采用HPLC-UV于280 nm處進行定量分析。該方法不需質(zhì)譜檢測，對實驗設(shè)備要求低，但只能進行丁香酚、乙酸丁香酚酯和甲基丁香酚3種物質(zhì)的檢測[5]。

2.4 化學發(fā)光酶免疫分析法（CLEIA）

無論是GC-MS/MS或HPLC-MS/MS，儀器檢測分析方法均需要昂貴設(shè)備及專業(yè)人員，且檢測效率較低。開發(fā)便捷、高通量的檢測方法，則更適用于大批量樣品的篩查和風險評估。免疫分析法因其靈敏度高、操作簡便及可進行高通量篩選等優(yōu)點被用于多種化合物的檢測分析。學者將合成的丁香酚半抗原Eul-4-Tbl通過活潑酯法與BSA相聯(lián)為Eul-4-Tbl-BSA作為免疫抗原，與OVA相聯(lián)為Eul-4-Tbl-OVA形成包被抗原。采用免疫抗原Eul-4-Tbl-BSA對新西蘭白兔進行免疫，經(jīng)多次免疫后得到兔源多抗血清，硫酸銨沉淀得到Eul多克隆抗體。檢測時，只需將待測物和Eul多克隆抗體加入被包被抗原Eul-4-Tbl-OVA包被過的96孔板中于37 ℃反應(yīng)，再加入化學發(fā)光液ECL檢測發(fā)光強度即可對樣品中丁香酚類化合物進行定量檢測。該法加標回收率76.6%~108%，檢出限為0.11μg·L-1，可用于水產(chǎn)品中丁香酚類化合物的檢測且受其他物質(zhì)的干擾較小[6]。

2.5 超聲輔助深共晶液-液微萃取分析法（UA-DESLLME）

UA-DES-LLME分析法所需時間短、效率高且綠色環(huán)保。近年來，在多種化合物檢測中得到了迅速發(fā)展。有學者通過優(yōu)化相關(guān)條件，將此方法用于丁香酚類化合物的檢測中。以百里酚作為氫鍵受體（HBA），以乙酰丙酸為氫鍵供體（HBD），將HBA與HBD以1∶2的比例混勻后加熱1 h即得到萃取效率較高的深共晶溶液（DES）。將400 μL DES與樣品混合后，pH=3條件下，超聲3 min，5 000 rpm離心10 min，取上清100 μL加入一定體積的甲醇中，0.45μm濾器過濾后通過氣相色譜檢測樣品中丁香酚、異丁香酚和甲基異丁香醇含量。經(jīng)過與其他檢測方法，如GC-MS/MS、HPLC-MS/MS比較，UA-DES-LLME具有相似的回收率、線性范圍和RSD，可應(yīng)用于實際樣品的檢測，被證明是分析水產(chǎn)品中丁香酚、異丁香酚和甲基異丁香醇更經(jīng)濟綠色的方法[7]。

3 結(jié)語

目前，我國尚未對丁香類化合物在水產(chǎn)品中的限量值做政策規(guī)定。文獻顯示，我國農(nóng)貿(mào)市場中丁香酚類化合物檢出率已超10%，鑒于目前丁香酚類化合物對人體健康的危害，亟需對該類物質(zhì)使用時添加量限定值及檢測方法出臺相應(yīng)政策規(guī)定。