腎陰虛證和腎陽虛證血漿蛋白質(zhì)表達(dá)譜的比較研究

畢建璐 魏敏 孫曉敏 聶曉莉 趙曉山 羅仁

摘要：目的 本研究通過對腎陰虛證和腎陽虛證共同的血漿蛋白差異表達(dá)進(jìn)行研究，挖掘腎虛證的本質(zhì)。方法 對腎陰虛證、腎陽虛證和健康正常人進(jìn)行蛋白芯片表達(dá)譜的比較研究。結(jié)果 選取典型腎陰虛證5例、腎陽虛證5例、正常健康人6例進(jìn)行蛋白芯片檢測，與正常健康人對比，獲得2組間共同表達(dá)上調(diào)的差異蛋白BMP-5。結(jié)論 腎陰虛、腎陽虛證之間存在著共同的差異蛋白，這可能是2者均有腎虛的表現(xiàn)有關(guān)，這為探討腎虛證的發(fā)生機(jī)制，特別是在蛋白水平的改變提供了依據(jù)。

關(guān)鍵詞：腎陰虛證；腎陽虛證；蛋白組學(xué)；免疫紊亂

中圖分類號：R692 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：B 文章編號：1007-2349（2023）04-0031-03

腎是人的先天根本，腎藏精，精化氣，即為腎氣，腎氣有陰陽，故腎虛最先表現(xiàn)為腎氣虛，腎氣虧虛日久，則轉(zhuǎn)化為腎陰虛或腎陽虛，由此可見，腎陰虛與腎陽虛有著共同的物質(zhì)基礎(chǔ)，那么這些共同物質(zhì)基礎(chǔ)是否有共同的基因、蛋白的改變？本課題組^［1-4］前期對腎陰虛證、腎陽虛證進(jìn)行了基因芯片的研究，發(fā)現(xiàn)腎陰虛證、腎陽虛證之間存在多個差異表達(dá)基因，但由于其中差異表達(dá)基因過多，每個差異表達(dá)基因又與多個信號通路、蛋白表達(dá)相關(guān)，非常復(fù)雜，不能深入探討腎虛證的本質(zhì)。蛋白質(zhì)是基因表達(dá)的產(chǎn)物，能夠更好地反映機(jī)體的功能特性，因此，本課題組招募腎陰虛證、腎陽虛證、正常人志愿者，對比三者的蛋白表達(dá)，挖掘腎虛證的本質(zhì)。

1 資料與方法

1.1 一般資料 在某三甲醫(yī)院招募腎陰虛證5例、腎陽虛證5例，正常健康人6例，其中男3例，年齡分別為30、32、35歲；女3例，年齡分別為年齡32、37、48歲。按1986年頒布的《中醫(yī)虛證辨證參考標(biāo)準(zhǔn)》^［5］判定陰虛證、腎陽虛證。

1.1.1 腎陰虛證的辨證標(biāo)準(zhǔn)^［5］（1）主癥：腰膝酸軟，五心煩熱。（2）次癥：眩暈耳鳴，或耳聾，口燥咽干，潮熱盜汗，或骨蒸發(fā)熱，形體消瘦，失眠健忘，齒松發(fā)脫，遺精，早泄經(jīng)少，經(jīng)閉，舌質(zhì)紅、少津，少苔或無苔，脈細(xì)數(shù)。（3）診斷：主癥具備2項(xiàng)（腰膝酸軟必備），次癥至少具備2項(xiàng)以上者即可確診。

1.1.2 腎陽虛證的辨證標(biāo)準(zhǔn)^［5］（1）主癥：腰膝酸軟，性欲減退，畏寒肢冷。（2）次癥：精神萎靡，夜尿頻多，下肢浮腫，動則氣促，發(fā)槁齒搖，舌質(zhì)淡苔白，脈沉遲，尺無力。（3）診斷：主癥具備2項(xiàng)（腰膝酸軟必備），次癥至少具備2項(xiàng)以上者即可確診。

1.1.3 排除標(biāo)準(zhǔn) （1）年齡小于18歲，或者大于65歲。（2）妊娠或哺乳期婦女。（3）有心腦血管、肝、腎、造血系統(tǒng)等嚴(yán)重疾病患者。（4）有精神性疾病的。

1.1.4 主要試劑與儀器^［6-8］人類生物素標(biāo)記法抗體芯片，美國RayBiotech，貨號：AAH-BLG-1-4）。主要儀器：超凈工作臺，低溫高速離心機(jī)（Sigma-Aldrich公司），微量移液器（Eppendoff公司）。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法^［6-8］200 μL 1×PBS（pH=8）（20ul血漿＋80 μL 1×PBS）稀釋5倍，并將稀釋液裝入透析管，4℃ 500 mL 1×PBS（pH=8）透析。更換1×PBS再次透析。芯片每個子陣加入400 μL封閉液，室溫孵育30 min。去除封閉液，加400 μL樣品，室溫孵育2 h或4 ℃過夜。去除溶液，芯片放入30 mL離心管，加30 mL 1×洗滌液I，震蕩10 min，去除洗滌液。重復(fù)2次。30 mL 1×洗滌液II洗滌芯片。30 mL蒸餾水洗滌，存于-20℃或-80℃。熒光掃描儀，Cy3通道檢測。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 用SAM軟件分析，比較腎陰虛證組、腎陽虛證組與正常對照組的蛋白表達(dá)。篩選條件：︱Score（d）︱控制在2倍以上，代表該蛋白可能屬于差異表達(dá)（d即difference，代表差值）。

2 結(jié)果

芯片掃描分析結(jié)果：對腎陰虛證5例、腎陽虛5例、正常健康人6例進(jìn)行蛋白芯片分析，芯片對比507種靶蛋白，分析得出腎陰虛證組、腎陽虛證與正常健康人之間有明顯差異的上調(diào)蛋白BMP-5（見圖1）。檢索公共數(shù)據(jù)庫后，獲得此差異蛋白的基本信息（見表1）。

3 討論

中醫(yī)認(rèn)為，腎氣的盛衰是機(jī)體生、長、壯、老、已的基石，是人體陰陽的根本。腎氣與人的生長、發(fā)育、生殖，骨骼的生長密切相關(guān)。腎氣虧虛則會出現(xiàn)腰膝酸軟、五心煩熱或畏寒肢冷、五更泄瀉、五遲五軟等，腎氣虧虛日久，則會出現(xiàn)腎陰虛或腎陽虛的表現(xiàn)，也就是說，兩者是存在共同的基礎(chǔ)——腎氣虛。本課題組應(yīng)用蛋白芯片技術(shù)，與正常健康人比較，發(fā)現(xiàn)腎陽虛證與腎陰虛證共同的差異表達(dá)蛋白骨形態(tài)發(fā)生蛋白5（BMP5），主要涉及細(xì)胞凋亡、骨的合成等方面。中醫(yī)認(rèn)為，腎藏精，主人體的生長、發(fā)育和生殖，在體合骨，生髓。BMP5也與骨合成相關(guān)，與中醫(yī)基礎(chǔ)理論符合。

腎主骨，生髓：骨形態(tài)發(fā)生蛋白5（bone morphogenetic proteins-5，BMP-5），又名成骨蛋白，屬于轉(zhuǎn)化生長因子β超家族。目前已知的BMPs數(shù)量已經(jīng)達(dá)到30余種。根據(jù)氨基酸序列的高度同源性，BMP5、BMP6和BMP7組成了BMPs的一個亞家族，其中hBMP5和hBMP6共同定位于人6號染色體上。在胚胎發(fā)育過程中，其與肢體關(guān)節(jié)的形成有關(guān)，是骨、軟骨組織修復(fù)的必要成分之一^［9］。馬真勝等^［10］應(yīng)用骨形態(tài)發(fā)生蛋白-5（BMP-5）cDNA探針來檢測骨折愈合過程中外骨痂內(nèi) BMP-5 基因表達(dá)的定位與分布。實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示^［11］，創(chuàng)傷可刺激BMP-5的基因表達(dá)，其表達(dá)局限于骨折周圍的骨痂區(qū)。其表達(dá)可以使骨折的血腫具有成骨能力，是骨折愈合中骨痂形成的重要原因之一。筆者結(jié)果也表明，腎陰虛證和腎陽虛證有著共同的差異蛋白--骨形態(tài)發(fā)生蛋白-5（BMP-5），它與骨和軟骨組織修復(fù)有著重要的關(guān)系，因此，腎虛證中常見的五軟五遲、腰膝酸軟、發(fā)墮齒稿等可能與BMP-5的異常表達(dá)有著密切的聯(lián)系。

腎主生長、發(fā)育、生殖：中醫(yī)認(rèn)為，腎為先天之本，在人體生長、發(fā)育、生殖中起著重要作用。BMP-5可以在發(fā)育中的泌尿道上皮細(xì)胞中表達(dá)，在胚胎發(fā)育期輸尿管、腎、肺、小腸、眼、乳腺等幾乎胚胎分化中的關(guān)鍵均有BMPs的表達(dá)，其可反映結(jié)腸癌、乳腺癌、肺癌、膀胱癌、卵巢癌等多種癌癥的預(yù)后^［12-13］。劉偉等^［11］研究Bmp5短耳純合型小鼠的耳廓比正常小鼠耳廓短小，純合型突變畸形小鼠體形較小，胸骨、肋骨等骨骼的發(fā)育較正常小鼠存在明顯異常。Bmp5短耳小鼠模型可用于先天性小耳畸形的研究。BMP-5在胚胎發(fā)育中的作用很可能是“腎藏精”的體現(xiàn)之一。

BMPs參與了胚胎的形成和發(fā)育、細(xì)胞的分化、增殖、誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。而目前尚無BMP5與中醫(yī)腎病的關(guān)系的研究，下一步將針對BMP5進(jìn)行研究。由于本研究的樣本量偏小，今后將擴(kuò)大樣本量，尋找腎虛證的差異蛋白、基因，為探討腎虛證的發(fā)生機(jī)制，特別是在蛋白水平的改變提供了依據(jù)。

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（收稿日期：2022-04-08）