睪丸癌鐵死亡相關(guān)基因的生物信息學(xué)分析

郭曉英， 李 玲， 馬慧穎， 閆鳳梅， 郝 羽， 黃 靜， 宋宜嵐

（1. 寧夏醫(yī)科大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院職業(yè)衛(wèi)生與環(huán)境衛(wèi)生學(xué)系，銀川 750004；2.寧夏醫(yī)科大學(xué)環(huán)境因素與慢性病控制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，銀川 750004）

據(jù)WHO 報(bào)道，全球8%～12%的夫婦患有不育不孕癥，其中男性因素占50%以上[1]。睪丸癌是20～35 歲人群最常見的腫瘤，約占95%，不育男性睪丸癌的患病率是正常男性的1.5 倍及以上[2-3]。目前為止，睪丸癌的主要治療手段是放化療，以延長(zhǎng)患者的生存時(shí)間，但其對(duì)生育能力無治療作用且可造成永久性不育[4]。因此，了解睪丸癌發(fā)生的具體分子機(jī)制，發(fā)現(xiàn)更加有效的預(yù)防和治療方法尤為重要。

鐵死亡作為近年來新發(fā)現(xiàn)的一種獨(dú)特的細(xì)胞死亡方式[5]，越來越多地用于癌癥相關(guān)治療[6-7]。在腫瘤的發(fā)生過程中，鐵死亡具有促進(jìn)和抑制腫瘤的雙重作用，且聯(lián)合使用針對(duì)鐵死亡信號(hào)的藥物可以改善腫瘤的治療效果[8-9]。本研究從基因水平探究睪丸癌鐵死亡相關(guān)基因的差異表達(dá)模式，篩選與睪丸癌患者生存率相關(guān)的樞紐基因，以期為睪丸癌的預(yù)防、診斷和治療提供新的思路和理論依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 資料來源

從UCSC Xena 數(shù)據(jù)庫（https://xena.ucsc.edu/）下載TCGA 數(shù)據(jù)（https://portal.gdc.cancer.gov/），從GTEx 數(shù)據(jù)庫（https://genome.ucsc.edu/gtex.html）下載睪丸癌組織和正常組織表達(dá)譜數(shù)據(jù)；從美國(guó)基因芯片公共數(shù)據(jù)庫GEO（gene expression omnibus，https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/）下載基因芯片GSE8607；從鐵死亡數(shù)據(jù)庫FerrDb V2（http：//www.zhounan.org/ferrdb/current/）下載鐵死亡激動(dòng)和抑制相關(guān)基因共483 個(gè)。

1.2 方法

1.2.1 睪丸癌組織與正常組織間主成分分析（principal component analysis，PCA）和差異基因篩選 從TCGA 和GTEx 數(shù)據(jù)庫下載睪丸癌組織（n=148）和正常組織（n=165）表達(dá)譜數(shù)據(jù)，采用DESeq2 包[10]分析差異基因，差異基因篩選標(biāo)準(zhǔn)為adjustP＜0.05 且log2FC ＞2。從GEO 數(shù)據(jù)庫下載GSE8607 基因芯片數(shù)據(jù)，利用limma 包[11]對(duì)正常組織（n=3）和睪丸癌組織（n=40）的表達(dá)譜數(shù)據(jù)進(jìn)行差異表達(dá)分析，獲得差異表達(dá)基因，篩選標(biāo)準(zhǔn)為adjustP＜0.05 且log2FC ＞1。采用FactoMineR[12]和Factoextra 包[13]對(duì)樣本進(jìn)行PCA分析。

1.2.2 睪丸癌鐵死亡相關(guān)差異表達(dá)基因篩選及富集分析 將TCGA 和GTEx 數(shù)據(jù)庫聯(lián)合分析的睪丸癌差異表達(dá)基因與483 個(gè)鐵死亡背景基因取交集基因，以獲得睪丸癌鐵死亡相關(guān)差異基因，經(jīng)clusterProfilerR 包[14]進(jìn)行功能注釋分析，包括描述分子功能（molecular function，MF）、生物學(xué)過程（biological process，BP）和細(xì)胞成分（cellular component，CC）的基因本體（gene ontology，GO）分析及京都基因與基因組百科全書（Kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG）分析。

1.2.3 蛋白互相作用（protein-protein interaction，PPI）分析和核心基因篩選 使用STRING 在線數(shù)據(jù)庫和Cytoscape 軟件的cytoHubba 包進(jìn)行鐵死亡相關(guān)的前10 個(gè)核心基因的篩選以及PPI 分析；用GEPIA 數(shù)據(jù)庫對(duì)前10 個(gè)相關(guān)核心基因進(jìn)行表達(dá)量分析。

1.2.4 GSE8607 基因芯片驗(yàn)證 從GSE8607 差異分析結(jié)果中提取出TCGA 和GTEx 聯(lián)合分析的前10 個(gè)樞紐基因，對(duì)樞紐基因的表達(dá)譜通過pheatmap 包[15]繪制無監(jiān)督聚類熱圖，驗(yàn)證TCGA和GTEx 聯(lián)合分析核心基因的差異表達(dá)結(jié)果。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用R 4.1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行差異分析、PCA 分析和聚類分析以及可視化。P≤0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 差異基因篩選和PCA 分析

PCA 散點(diǎn)圖中反映PC1 和PC2 的主成分得分分別為30.3%和6.7%，累計(jì)解釋基因表達(dá)變化的37.0%，且樣本個(gè)數(shù)的點(diǎn)聚集在一起（圖1A）。通過DESeq2 包對(duì)TCGA 和GTEx 數(shù)據(jù)進(jìn)行分析獲得7 349 個(gè)差異表達(dá)基因，其中5 232 個(gè)下調(diào)基因，2 117 個(gè)上調(diào)基因。將差異表達(dá)基因與483個(gè)鐵死亡相關(guān)基因取交集獲得69 個(gè)鐵死亡差異表達(dá)基因。對(duì)GSE8607 芯片通過limma 包分析獲得2 954 個(gè)差異表達(dá)基因，其中1 536 個(gè)下調(diào)基因，1 418 個(gè)上調(diào)基因。對(duì)樣本進(jìn)行PCA 分析發(fā)現(xiàn)，PC1 和PC2 的主成分得分分別為18.6%和13.8%，累計(jì)解釋基因表達(dá)變化的32.4%（圖1B）。

圖1 睪丸癌和正常組織的PCA 分析

2.2 差異基因GO 和KEGG 富集分析

對(duì)69 個(gè)差異基因進(jìn)行GO 富集分析，結(jié)果顯示，BP 主要富集在氧化應(yīng)激、化學(xué)應(yīng)激、活性氧代謝過程等；CC 主要涉及細(xì)胞的黏著、細(xì)胞底物連接、線粒體外膜和細(xì)胞器外膜等；MF 主要富集在亞鐵離子的結(jié)合、氧化還原酶活性，作用于過氧化物的受體、雙加氧酶活性等功能（圖2A）。KEGG 通路富集結(jié)果顯示，主要富集在鐵死亡相關(guān)通路、NOD 樣受體信號(hào)通路、JAK-STAT 信號(hào)通路和胞質(zhì)樣受體信號(hào)通路（圖2B）。

圖2 鐵死亡相關(guān)睪丸癌差異基因GO 和KEGG 富集

2.3 PPI 網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建和核心基因篩選

將69 個(gè)鐵死亡差異基因?qū)隨TRING 數(shù)據(jù)庫，使用默認(rèn)參數(shù)，構(gòu)建PPI 網(wǎng)絡(luò)（置信度＞0.4）（圖3A）。將STRING 結(jié)果導(dǎo)入Cytoscape，通過cytoHubba 插件篩選出PPI 網(wǎng)絡(luò)中度值（degree）最多的前10 個(gè)基因（TP53、IL-6、CD44、KRAS、HMOX1、PRDX1、SOX2、TXN、AR和GPX4）作為樞紐基因構(gòu)建子網(wǎng)絡(luò)（圖3B）。

圖3 鐵死亡相關(guān)睪丸癌差異基因PPI 網(wǎng)絡(luò)和前10 個(gè)核心基因

2.4 核心基因表達(dá)量分析

采用GEPIA 在線數(shù)據(jù)庫分析前10 個(gè)核心基因表達(dá)量，與正常組織相比，睪丸癌患者中TP53、IL-6、CD44、KRAS、HMOX1、PRDX1、SOX2 和TXN基因高表達(dá)（P均＜0.01），AR和GPX4 基因低表達(dá)（P均＜0.01），見圖4。

圖4 前10 個(gè)鐵死亡相關(guān)睪丸癌差異基因在睪丸癌與正常組織中的表達(dá)量

2.5 GSE8607 基因芯片驗(yàn)證

從GSE8607 差異分析結(jié)果中提取出TCGA和GTEx 聯(lián)合分析的前10 個(gè)樞紐基因的表達(dá)譜數(shù)據(jù)，用pheatmap 包對(duì)樞紐基因的表達(dá)譜進(jìn)行熱圖繪制（圖5A）。結(jié)果顯示，在GSE8607 基因芯片中TP53、IL-6、CD44、KRAS、HMOX1、PRDX1、SOX2 和TXN基因在睪丸癌組織中高表達(dá)，AR和GPX4 基因低表達(dá)，與TCGA 結(jié)果一致（圖5B）。

圖5 排名前10 位鐵死亡相關(guān)睪丸癌差異基因表達(dá)熱圖

3 討論

通過對(duì)睪丸癌生物標(biāo)記物的研究，可對(duì)新的潛在的預(yù)后標(biāo)記物和治療靶標(biāo)基因等進(jìn)行探索。Zhu 等[16]通過建立睪丸癌的轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)預(yù)測(cè)模型，發(fā)現(xiàn)GRK4、PCYT2 和RGSL1 是睪丸癌的生存和治療反應(yīng)預(yù)測(cè)標(biāo)記物。有研究[17]通過生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)長(zhǎng)鏈非編碼RNA RFPL3S 可作為睪丸癌的預(yù)后預(yù)測(cè)因子以及預(yù)測(cè)睪丸癌免疫治療效果的標(biāo)記物；研究[18]顯示，在睪丸癌中MeCP2 的DNA 甲基化水平降低，與睪丸癌的預(yù)后、病理分期、分級(jí)和亞型相關(guān)。而癌癥治療中克服耐藥性是重點(diǎn)也是難點(diǎn)。在鐵死亡與癌癥耐藥性的研究中，誘導(dǎo)鐵死亡已經(jīng)被證明可以逆轉(zhuǎn)耐藥性[7]。本研究通過對(duì)睪丸癌轉(zhuǎn)錄數(shù)據(jù)的分析發(fā)現(xiàn)，在TCGA 聯(lián)合GTEx 數(shù)據(jù)庫中，睪丸癌組織和正常組織共表達(dá)的差異基因有7 349 個(gè)，其中5 232 個(gè)下調(diào)基因，2 117 個(gè)上調(diào)基因，與鐵死亡相關(guān)差異基因有69 個(gè)。這些基因主要涉及氧化應(yīng)激和線粒體功能等。在PPI 網(wǎng)絡(luò)分析中，前10 個(gè)樞紐基因中，有8 個(gè)基因在睪丸癌組織中高表達(dá)，2 個(gè)基因低表達(dá)。在GSE8607 基因芯片中，前10 個(gè)樞紐基因同樣在睪丸癌組織中表達(dá)一致，8 個(gè)高表達(dá)，2 個(gè)低表達(dá)，驗(yàn)證了TCGA 和GTEx 數(shù)據(jù)庫的分析結(jié)果。

在鐵死亡相關(guān)的睪丸癌差異基因的KEGG通路富集中，NOD 樣受體通路和JAK-STAT 信號(hào)通路被激活，兩者都是炎癥和免疫相關(guān)的關(guān)鍵通路[19-21]。JAK-STAT 通路構(gòu)成一個(gè)快速的膜到細(xì)胞核信號(hào)模塊，并誘導(dǎo)癌癥和炎癥的各種關(guān)鍵介質(zhì)的表達(dá)，且JAK-STAT 通路的失調(diào)與各種癌癥和自身免疫性疾病有關(guān)[22-23]。NOD 樣受體蛋白可介導(dǎo)對(duì)細(xì)胞損傷和應(yīng)激的初始先天免疫反應(yīng)，其與腫瘤的關(guān)系值得探究[24]。NLRs 的異常激活發(fā)生在各種癌癥中，其可改變組織微環(huán)境，從而增加機(jī)體發(fā)生腫瘤的風(fēng)險(xiǎn)，通過藥物阻斷NLRs 炎性小體的激活和合成可能是預(yù)防癌癥進(jìn)展的有效方法之一[25]。睪丸癌的生存率與睪酮水平的高低相關(guān)[26]，與高睪酮水平的大鼠相比，低睪酮水平的大鼠中NLRP3、COX2、IL-1β 以及TNF-α 表達(dá)可顯著上調(diào)[27]。因此，在睪丸癌治療中，通過干預(yù)鐵死亡來抑制NOD 樣受體信號(hào)通路和JAKSTAT 信號(hào)通路可能是一種潛在治療方式。

在對(duì)樞紐基因的篩選中，TP53 和IL-6 評(píng)分最高，說明其在睪丸癌差異基因的調(diào)控中發(fā)揮的作用最大。TP53 和IL-6 是鐵死亡的關(guān)鍵調(diào)控基因[28-29]，GEPIA 基因的表達(dá)量結(jié)果同樣顯示，TP53和IL-6 在睪丸癌組織中的表達(dá)量上升。而與正常組織相比，AR和GPX4 在睪丸癌組織中表達(dá)量下降，AR表達(dá)的激活可促進(jìn)GPX4 的表達(dá)來抑制活性氧的產(chǎn)生和升高，從而抑制鐵死亡的發(fā)生[30-32]。

因此，本研究通過對(duì)睪丸癌基因的生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)，NLRs 通路和JAK-STAT 通路可作為聯(lián)合鐵死亡治療睪丸癌的靶向調(diào)節(jié)通路，TP53、IL-6、AR 和GPX4 可作為聯(lián)合鐵死亡治療睪丸癌藥物的靶標(biāo)及預(yù)測(cè)睪丸癌患者生存率的腫瘤標(biāo)記物。因此，本研究為睪丸癌的發(fā)生、發(fā)展、治療及預(yù)后機(jī)制的研究提供了一定的思路。