黃芪甲苷對(duì)小膠質(zhì)細(xì)胞NLRP3/Caspase-1通路相關(guān)蛋白表達(dá)的影響

楊治倫， 陳小江， 陳飛飛， 原茜倩， 馬全瑞， 秦 毅

（寧夏醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院人體解剖與組織胚胎學(xué)系，銀川 750004）

小膠質(zhì)細(xì)胞作為中樞神經(jīng)系統(tǒng)（central nervous system，CNS）中固有的免疫效應(yīng)細(xì)胞，其在許多神經(jīng)疾病中可介導(dǎo)產(chǎn)生神經(jīng)炎癥[1]，造成二次損傷[2]，這一過程往往伴隨著細(xì)胞焦亡的發(fā)生[3]，其通過介導(dǎo)胞膜穿孔來加劇神經(jīng)炎性反應(yīng)[4-5]。因此，尋找可以有效抑制細(xì)胞焦亡的藥物具有重要的臨床意義。研究[6]表明，黃芪提取物黃芪甲苷（astragaloside IV，AS-IV）可以有效抑制缺血性腦損傷大鼠模型中與焦亡發(fā)生相關(guān)的NOD樣受體熱蛋白結(jié)構(gòu)域相關(guān)蛋白3（NOD-like receptor thermal protein domain associated protein 3，NLRP3）、含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶1（cysteinyl aspartate specific proteinase 1，Caspase-1）、胞膜穿孔蛋白D（gasdermin D，GSDMD）、白細(xì)胞介素（interleukin，IL）-1β 產(chǎn)生。但是，AS-IV 對(duì)于小膠質(zhì)細(xì)胞是否有相似的抑制作用尚未可知。為了進(jìn)一步探究其是否存在抑制作用，本研究以AS-IV 干預(yù)小膠質(zhì)細(xì)胞系（BV2），探討不同濃度AS-IV 對(duì)凝血酶激活的小膠質(zhì)細(xì)胞表達(dá)焦亡相關(guān)因子的影響，并對(duì)相關(guān)機(jī)制進(jìn)行分析，以期為AS-IV 應(yīng)用于臨床治療神經(jīng)炎性反應(yīng)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 主要試劑

小鼠小膠質(zhì)細(xì)胞BV2 細(xì)胞系購(gòu)于廣州賽庫(kù)生物技術(shù)有限公司；AS-IV 標(biāo)準(zhǔn)品（20 mg，純度≥98%）購(gòu)于北京索萊寶科技有限公司；凝血酶（T4648-1KU）購(gòu)于美國(guó)Sigma 公司；ECL 化學(xué)發(fā)光底物試劑盒購(gòu)于江蘇凱基生物技術(shù)有限公司；凋亡相關(guān)斑點(diǎn)樣蛋白（apoptosis-associated specklike protein containing CARD，ASC）、Caspase-1、GSDMD 多克隆抗體、Cy3 熒光Rabbit 二抗、HRP標(biāo)記Mouse 二抗、HRP 標(biāo)記Rabbit 二抗均購(gòu)于武漢愛博泰克生物科技有限公司；NLRP3 多克隆抗體購(gòu)于北京博奧森生物技術(shù)有限公司；β-actin單克隆抗體購(gòu)于英國(guó)Abcam 公司；北美胎牛血清（fetal bovine serum，F(xiàn)BS）購(gòu)于美國(guó)Gibco 公司；小鼠IL-1β 及IL-18 ELISA 試劑盒均購(gòu)于上海酶聯(lián)生物科技有限公司。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)

將BV2 細(xì)胞培養(yǎng)在DMEM 高葡萄糖全培養(yǎng)基［含有10%熱滅活FBS、1%青鏈霉素混合液（100×），青霉素10 kU·mL-1，鏈霉素10 mg·mL-1］中，并置于37 °C、5%CO2培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)，每24 h 按照1∶3 比例傳一代。凝血酶藥物濃度參照Ye 等[7]測(cè)定的藥物實(shí)驗(yàn)濃度，選定適宜的凝血酶濃度范圍，加藥觀察BV2 細(xì)胞狀態(tài)，最終確定以20 U·mL-1凝血酶作為制備模型濃度；AS-IV 藥物濃度參照Yu 等[8]作用BV2 細(xì)胞的藥物實(shí)驗(yàn)濃度，并利用CCK-8 法檢測(cè)藥物濃度范圍內(nèi)的細(xì)胞活力，最終確定以1、5、10 μmol·L-1作為AS-IV 干預(yù)濃度。

觀察所培養(yǎng)細(xì)胞的狀態(tài)，待其穩(wěn)定后，將BV2 細(xì)胞隨機(jī)分為5 組：Control 組（正常對(duì)照組）、凝血酶組（20 U·mL-1）、1 μmol·L-1AS-IV 組（20 U·mL-1凝血酶+1 μmol·L-1AS-IV）、5 μmol·L-1AS-IV 組（20 U·mL-1凝血酶+5 μmol·L-1AS-IV）、10 μmol·L-1AS-IV 組（20 U·mL-1凝 血 酶+10 μmol·L-1AS-IV）。其中AS-IV 組的AS-IV 與凝血酶同時(shí)加入培養(yǎng)液中，培養(yǎng)24 h。

1.3 免疫印跡檢測(cè)BV2 細(xì)胞ASC、NLRP3、Caspase-1、gasdermin D-N 端（GSDMD-N）的表達(dá)

將BV2 細(xì)胞按照1.2 所述分組后，在25 cm2培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)24 h 后，消化并離心，取出細(xì)胞沉淀，加入裂解液裂解細(xì)胞以獲得胞內(nèi)蛋白，低溫離心（12 000 r·min-1，4 °C，10 min）后吸出上清，利用BCA 法測(cè)得總蛋白濃度，加入適量上樣緩沖液后95 ℃加熱10 min 使其變性，電泳、轉(zhuǎn)膜后，5%牛奶4 °C 封閉過夜，加入ASC、NLRP3、Caspase-1、GSDMD-N、β-actin（稀釋比例均為1∶1 000）抗體4 °C 過夜，回收一抗，用TBST 溶液洗滌5 次，加入HRP 二抗（1∶4 000）搖床孵育1 h后滴加ECL 發(fā)光液行化學(xué)發(fā)光顯色，以β-actin為內(nèi)參蛋白。利用Image J 軟件進(jìn)行灰度值分析，目的蛋白相對(duì)表達(dá)量=目的蛋白灰度值/β-actin灰度值。

1.4 免疫熒光染色檢測(cè)BV2 細(xì)胞ASC、NLRP3、Caspase-1、GSDMD-N 的表達(dá)

將BV2 細(xì)胞以1×105個(gè)/孔接種至已含有玻片的24 孔板中進(jìn)行細(xì)胞爬片并培養(yǎng)24 h，再按照1.2 所述分組加藥培養(yǎng)24 h，對(duì)細(xì)胞進(jìn)行固定（4%多聚甲醛，15 min），以0.25% 曲拉通X-100的PBS 溶液通透20 min，PBS 浸洗3 次，以封閉用正常羊血清室溫封閉30 min；分別滴加ASC、NLRP3、Caspase-1、GSDMD-N 抗體（1∶200），4 °C孵育過夜，PBS 浸洗5 次；加入Cy3 紅色熒光標(biāo)記二抗（1∶300），37 °C 避光孵育1 h，PBS 浸洗5次；最后用抗熒光淬滅封片劑封片。在熒光顯微鏡下（×100）隨機(jī)選取每組3 個(gè)視野攝片，并用Image J 軟件進(jìn)行區(qū)域平均熒光強(qiáng)度測(cè)定，最終結(jié)果與Control 組相比，獲得相對(duì)熒光強(qiáng)度比值。

1.5 ELISA 法測(cè)定細(xì)胞培養(yǎng)液中IL-1β 及IL-18 的含量

將BV2 細(xì)胞按1×105個(gè)/孔密度接種至24孔板培養(yǎng)24 h，隨后按照1.2 所述分組加藥培養(yǎng)24 h，培養(yǎng)完成后，將不同組細(xì)胞培養(yǎng)液取出，以1 000×g離心15 min。將含有抗體的酶標(biāo)板分別設(shè)置空白孔、標(biāo)準(zhǔn)孔及待測(cè)樣品孔。隨后按試劑盒說明書進(jìn)行操作，直至加完終止液后，在20 min 內(nèi)測(cè)量波長(zhǎng)在450 nm 處的OD 值，并以標(biāo)準(zhǔn)曲線求得各待測(cè)樣品孔內(nèi)的實(shí)際濃度。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用OriginPro 2021 軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析及繪圖。計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)。P≤0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 免疫印跡法檢測(cè)AS-IV 對(duì)BV2 細(xì)胞焦亡相關(guān)因子表達(dá)的影響

免疫印跡檢測(cè)顯示，凝血酶組ASC、NLRP3、Caspase-1、GSDMD-N 與Control 組相比，各蛋白表達(dá)水平均升高（P均＜0.05）；與凝血酶組相比，1、5、10 μmol·L-1AS-IV 組中ASC、NLRP3、Caspase-1、GSDMD-N 各蛋白表達(dá)水平均有不同程度下降（P均＜0.05）；與1 μmol·L-1AS-IV 組比較，5、10 μmol·L-1AS-IV 組ASC、NLRP3 表達(dá)均降低（P均＜0.05），而5、10 μmol·L-1AS-IV 兩組間差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P均＞0.05）；此外，Caspase-1、GSDMD-N 在1、5、10 μmol·L-1AS-IV 實(shí)驗(yàn)組間差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P均＞0.05），見圖1。

圖1 免疫印跡法檢測(cè)AS-IV 對(duì)BV2 細(xì)胞焦亡相關(guān)因子表達(dá)的影響（n=3）

2.2 免疫熒光染色法檢測(cè)AS-IV 對(duì)BV2 細(xì)胞焦亡相關(guān)因子表達(dá)的影響

免疫熒光染色顯示，Control 組ASC、NLRP3、Caspase-1、GSDMD-N 的熒光Cy3 紅色熒光染料著色細(xì)胞少，熒光強(qiáng)度低；與Control 組相比，凝血酶組ASC、NLRP3、Caspase-1、GSDMD-N 的著色細(xì)胞明顯增多，熒光強(qiáng)度增高（P均＜0.05）；與凝血酶組比較，1、5、10 μmol·L-1AS-IV 組ASC、NLRP3、Caspase-1、GSDMD-N 的著色細(xì)胞均減少，熒光強(qiáng)度均降低（P均＜0.05）；其中，ASC、NLRP3、GSDMD-N 在5、10 μmol·L-1AS-IV 組中的熒光強(qiáng)度較1 μmol·L-1AS-IV 組均降低（P均＜0.05），而5、10 μmol·L-1AS-IV 兩組間差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P均＞0.05）；此外，Caspase-1 在1、5、10 μmol·L-1AS-IV 組中差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P均＞0.05），見圖2。

圖2 免疫熒光染色法檢測(cè)AS-IV 對(duì)BV2 細(xì)胞焦亡相關(guān)因子表達(dá)的影響

2.3 ELISA 法檢測(cè)AS-IV 對(duì)BV2 細(xì)胞培養(yǎng)液中IL-1β 與IL-18 含量的影響

ELISA 結(jié)果顯示，與Control 組比較，凝血酶組的培養(yǎng)液中IL-1β、IL-18 的含量均上升（P均＜0.05）；1、5、10 μmol·L-1AS-IV 組培養(yǎng)液中IL-1β、IL-18 含量均低于凝血酶組（P均＜0.05），其中，5、10 μmol·L-1AS-IV 組的培養(yǎng)液中IL-1β、IL-18 含量均低于1 μmol·L-1AS-IV 組（P均＜0.05），而5、10 μmol·L-1AS-IV 組比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P均＞0.05），見圖3。

圖3 ELISA 檢測(cè)AS-IV 對(duì)BV2 細(xì)胞培養(yǎng)液中IL-1β與IL-18 含量的影響（n=5）

3 討論

由于目前對(duì)神經(jīng)炎癥所產(chǎn)生的不良后果尚無(wú)有效的方式或藥物進(jìn)行治療[9]，故如何有效減少神經(jīng)退行性疾病所伴隨的神經(jīng)炎性反應(yīng)受到越來越多學(xué)者的關(guān)注。作為CNS 中炎性因子的主要釋放來源，小膠質(zhì)細(xì)胞在過去的研究中被證實(shí)可調(diào)控神經(jīng)炎性反應(yīng)的強(qiáng)弱[2]。因此，很多研究試圖通過干預(yù)小膠質(zhì)細(xì)胞的反應(yīng)，從源頭減少炎性因子的分泌。在小膠質(zhì)細(xì)胞產(chǎn)生炎性反應(yīng)并釋放炎性因子的過程中，需要借助多條炎性信號(hào)通路來實(shí)現(xiàn)，其中細(xì)胞焦亡通路是近年來新發(fā)現(xiàn)的一條炎性反應(yīng)通路[10]。該通路由核轉(zhuǎn)錄因子-κB調(diào)控促使ASC、NLRP3、pro-Caspase-1 組成的三聚體（NLRP3 炎性小體）切割產(chǎn)生Caspase-1，隨后Caspase-1 切割GSDMD 致使胞膜穿孔[5]，使細(xì)胞將內(nèi)容物釋放到周圍環(huán)境中產(chǎn)生強(qiáng)烈的炎性反應(yīng)。因此，若能有效抑制小膠質(zhì)細(xì)胞發(fā)生細(xì)胞焦亡，便可以減少其所導(dǎo)致的神經(jīng)炎性反應(yīng)，為臨床治療神經(jīng)炎癥提供新思路。

黃芪在以往的炎性模型研究中表現(xiàn)出較強(qiáng)的抗炎能力，如高糖誘導(dǎo)的血管內(nèi)皮炎性模型[11]，寡聚Aβ 誘導(dǎo)的阿爾茨海默病模型[12]等。利用AS-IV 干預(yù)由脂多糖（LPS）激活的小膠質(zhì)細(xì)胞，結(jié)果顯示，AS-IV 可以減少小膠質(zhì)細(xì)胞分泌炎性因子，并促使其由M1 型向M2 型轉(zhuǎn)化[8]。另外，鄭心甜等[13]在腦缺血大鼠模型上也驗(yàn)證了這一結(jié)果。上述研究表明，AS-IV 可以抑制小膠質(zhì)細(xì)胞產(chǎn)生的炎性反應(yīng)，但其對(duì)于焦亡通路是否起到了抑制作用尚未可知。為此，本研究利用凝血酶來激活小膠質(zhì)細(xì)胞并使用AS-IV 進(jìn)行干預(yù)，觀察其焦亡通路相關(guān)因子的表達(dá)是否有所下降，來驗(yàn)證AS-IV 對(duì)小膠質(zhì)細(xì)胞發(fā)生焦亡是否有抑制作用，以期將來對(duì)AS-IV 的抗炎機(jī)制做進(jìn)一步闡釋。

本研究免疫印跡結(jié)果顯示，與Control 組比較，凝血酶組傳導(dǎo)焦亡信號(hào)的主要蛋白因子（ASC、NLRP3、Caspase-1）的表達(dá)量升高，與Ye 等[7]所測(cè)結(jié)果相似，這說明凝血酶可以刺激小膠質(zhì)細(xì)胞產(chǎn)生焦亡相關(guān)因子。但處在焦亡通路下游的GSDMD 蛋白是近年來新發(fā)現(xiàn)的蛋白[5]，目前在凝血酶模型中未見對(duì)此類蛋白的測(cè)定。通常，此蛋白被剪切后的N 端（GSDMD-N）充當(dāng)著細(xì)胞焦亡執(zhí)行者的角色，這是直接導(dǎo)致焦亡發(fā)生的蛋白，因此測(cè)定其表達(dá)量的變化，便可以證明細(xì)胞焦亡的發(fā)生。本研究測(cè)定GSDMD-N 在凝血酶模型中也有同樣的上升趨勢(shì)，說明凝血酶模型中小膠質(zhì)細(xì)胞會(huì)發(fā)生由GSDMD-N 介導(dǎo)的胞膜穿孔。在經(jīng)過AS-IV 干預(yù)后，小膠質(zhì)細(xì)胞體內(nèi)焦亡相關(guān)因子（ASC、NLRP3、Caspase-1、GSDMD-N）的表達(dá)量與凝血酶組相比均有下降，并且相較于1 μmol·L-1AS-IV組，5、10 μmol·L-1AS-IV 組中ASC、NLRP3 的下降程度更加明顯。與免疫印跡結(jié)果相似的是，在免疫熒光結(jié)果中，凝血酶組的小膠質(zhì)細(xì)胞著色較多、熒光強(qiáng)度高，并且熒光強(qiáng)度較高的細(xì)胞有明顯的聚集性，推測(cè)當(dāng)小膠質(zhì)細(xì)胞發(fā)生焦亡后，其釋放的炎性因子會(huì)刺激周圍未發(fā)生焦亡的細(xì)胞活化，促使其相互聚集，繼而進(jìn)一步產(chǎn)生級(jí)聯(lián)放大反應(yīng)。而使用AS-IV 干預(yù)后，熒光強(qiáng)度降低，著色細(xì)胞減少，原本在凝血酶組中的聚集現(xiàn)象也明顯減少，并且5、10 μmol·L-1AS-IV 組中的ASC、NLRP3、GSDMD-N 熒光強(qiáng)度較1 μmol·L-1AS-IV組更低，說明5、10 μmol·L-1AS-IV 可有效抑制小膠質(zhì)細(xì)胞中焦亡相關(guān)因子的上升，推測(cè)這類蛋白表達(dá)量的總體下降可能與AS-IV 調(diào)控核轉(zhuǎn)錄因子-κB 的表達(dá)有關(guān)。以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果說明，AS-IV可有效抑制小膠質(zhì)細(xì)胞發(fā)生細(xì)胞焦亡及與焦亡相關(guān)的炎性反應(yīng)，并且較高濃度的AS-IV 可以起到更強(qiáng)的抗焦亡作用。此外，在細(xì)胞焦亡通路的下游，Caspase-1 除誘導(dǎo)GSDMD 蛋白發(fā)生切割致使胞膜穿孔外，其另一個(gè)主要作用是剪切pro-IL-1β 與pro-IL-18 形成IL-1β 與IL-18 并釋放到胞外[14]。IL-1β 與IL-18 作為關(guān)鍵的促炎因子，參與多種炎性反應(yīng)的發(fā)生。對(duì)此，本研究利用ASIV 干預(yù)凝血酶活化的小膠質(zhì)細(xì)胞后，測(cè)定其培養(yǎng)液中IL-1β 與IL-18 分泌量的變化發(fā)現(xiàn)，其分泌量均低于凝血酶組，并且與1 μmol·L-1AS-IV組比較，5、10 μmol·L-1AS-IV 組培養(yǎng)液中IL-1β與IL-18 的含量更低。說明AS-IV 在抑制小膠質(zhì)細(xì)胞發(fā)生焦亡的過程中，可有效地減少其向培養(yǎng)液中分泌炎性因子，特別是Caspase-1 的減少會(huì)使被剪切后產(chǎn)生的IL-1β 與IL-18 更少，因此其分泌量下降。

綜上所述，AS-IV 能夠有效抑制凝血酶激活的小膠質(zhì)細(xì)胞表達(dá)焦亡相關(guān)蛋白，同時(shí)也降低其下游相關(guān)炎性因子的分泌，表明AS-IV 抑制活化的小膠質(zhì)細(xì)胞發(fā)生焦亡可能是其抑制小膠質(zhì)細(xì)胞炎性反應(yīng)的機(jī)制之一。