核桃過敏原成分PCR 方法的建立

吳玉雙，楊 倩，黃淑迪，陳 艷，姬 華

（1. 石河子大學(xué)食品學(xué)院，新疆石河子 832000；2. 國家食品安全風(fēng)險評估中心中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院創(chuàng)新單位（2019RU014 號），北京 100021）

在過去的20 年里，過敏反應(yīng)和過敏反應(yīng)的發(fā)生率在不同的國家都有所增加。在全世界范圍內(nèi)，有高達(dá)6%的兒童和2%的成年人是過敏患者，并且這個數(shù)據(jù)呈現(xiàn)出明顯的上升趨勢[1-3]。近年來，食品過敏成為影響食品安全的重要影響因素之一[4-6]。過敏患者通常是無法治愈的，對過敏患者的唯一“治療”是從飲食中完全去除引發(fā)過敏的成分，因此過敏患者十分依賴加工食品的成分標(biāo)簽。所以，為了盡可能地避免過敏患者因誤食而導(dǎo)致的過敏反應(yīng)，我國與其他各國均采用將食品成分進(jìn)行標(biāo)示的方法[7]。核桃和其他堅果是最常引起嚴(yán)重過敏反應(yīng)的食物，人們通常認(rèn)為食用核桃是一種健康的飲食習(xí)慣，但是對核桃的過敏會導(dǎo)致嚴(yán)重危害甚至死亡。全球約有4.9%的人對核桃過敏[8]，15%的兒童是核桃過敏體質(zhì)[9]。核桃過敏會引發(fā)機(jī)體產(chǎn)生一系列的過敏癥狀并對皮膚、呼吸道、消化道等造成傷害[10]，過敏反應(yīng)不僅影響患者的身體健康，而且降低了他們的生活質(zhì)量。然而，核桃在食品加工過程中被廣泛使用，患者想要完全避免誤食核桃過敏原是極其困難的，超過80%的受訪者認(rèn)為應(yīng)強(qiáng)調(diào)成分列表中的可能過敏原，并描述過敏原含量[11]。由此可見，與之相關(guān)的核桃過敏原的檢測方法是具有重大意義的，核桃過敏原的檢測主要有酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA） 及聚合酶鏈反應(yīng)（PCR） 2 種方法。Yano T 等人[12]利用傳統(tǒng)PCR 的方法檢測核桃過敏原，發(fā)現(xiàn)mat K 基因是是其基因組中特異性最強(qiáng)的基因。Linacero R 等人[13]在過敏原編碼序列上設(shè)計新型引物，利用熒光定量PCR 方法檢測食品中的核桃過敏原，檢測限為2.5 pg 核桃DNA，與ELISA 分析比較，該方法在核桃的痕量檢測中顯示出更高的靈敏度和可靠性。PCR 法在復(fù)雜食品中過敏原的定量分析及物種鑒定方面，具有其他方法無法比擬的優(yōu)點(diǎn)，這使PCR 方法在動植物源性食物過敏原檢測方面，存在極大的優(yōu)勢，適合國際法規(guī)所要求的食品中痕量過敏原的檢測原則[14]。

在所有核桃過敏原中研究最多的是英國核桃中的Juglans Jug r 1，一種2 S 白蛋白種子儲存蛋白，是引起過敏反應(yīng)最主要的一種過敏原，可溶于水和低濃度鹽溶液[14]。Jug r 1 還是一種前體蛋白，可在生化反應(yīng)中分裂為一個大亞基和一個小亞基S。通過對核桃DNA 的擴(kuò)增，根據(jù)Jug r 1 設(shè)計出的3 對新型引物，旨在建立靈敏度高、特異性強(qiáng)的核桃PCR 檢測方法。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 食品材料

黃豆、青豆、蠶豆、綠豆、紅豆、巴旦木、榛子、夏威夷果、扁杏仁、開心果、葵花籽、碧根果、腰果、核桃、松子、鷹嘴豆、黑豆、花生，均購自石河子農(nóng)貿(mào)市場。

1.1.2 設(shè)備

均質(zhì)機(jī)；DNA 提取盒；分析天平，上海民橋精密科學(xué)儀器有限公司產(chǎn)品；數(shù)顯恒溫水浴鍋；漩渦振蕩器；凝膠成像系統(tǒng)，美國Bio-Rad 公司產(chǎn)品；小型臺式高速離心機(jī)；PCR 儀，Techne 公司產(chǎn)品；電泳儀，北京市六一儀器廠產(chǎn)品；微量核酸定量儀。

1.1.3 試劑

巰基乙醇、氯仿、500 bp ladder DNA marker，光明試劑廠提供；天根植物基因組DNA 提取試劑盒，天根公司提供；高鹽甘露醇瓊脂，青島高科技工業(yè)園海博生物技術(shù)有限公司提供；2×premix Taq，北京博大恒泰生物技術(shù)有限公司提供；瓊脂糖，北京索萊寶科技有限公司提供；50 mmol/L 乙二胺四乙酸二鈉鹽EDTA；100 mmol/L Tris-HCl。

1.2 方法

1.2.1 DNA 提取

提取樣品DNA 需使用天根公司生產(chǎn)的天根植物DNA 提取盒，依據(jù)以下步驟依次操作：試驗最開始先將27 μL 無水乙醇與13 μL 緩沖液GD 混合，60 μL無水乙醇與15 μL 漂洗液PW 混合，將二者混合均勻。將混合好的緩沖液GP1 65 ℃水浴加熱，加熱完畢，再加入0.1%的巰基乙醇，后取700 μL 的混合溶液于離心管中，繼續(xù)水浴加熱。取核桃仁100 mg，在液氮的降溫下充分地碾磨，將研磨好的核桃粉末樣品馬上轉(zhuǎn)移到裝有緩沖液GP1 的離心管中，并迅速上下顛倒振蕩混勻后，再于65 ℃下水浴，時間為20 min，加熱過程中需要多次顛倒振蕩離心管，使之充分混勻?；靹蚝笤偌尤?00 μL 氯仿，充分混勻，離心（轉(zhuǎn)速12 000 r/min，時間10 min），將離心所得上清液收集到離心管中，再加入700 μL 緩沖液GP2，振蕩混勻?；靹蚝笠频绞占艿奈街鵆B3 中，離心（轉(zhuǎn)速12 000 r/min，時間30 s），離心結(jié)束后倒掉廢液。向吸附柱CB3 中加入500 μL 緩沖液GD，離心（轉(zhuǎn)速12 000 r/min，時間30 s），倒掉吸附管的液體，再將吸附柱CB3 放入無菌收集管中。向吸附柱CB3 中加入600 μL 漂洗液PW，離心（轉(zhuǎn)速12 000 r/min，時間30 s），倒掉吸附管的液體，將吸附柱CB3 重新放入無菌收集管中，重復(fù)以上步驟2 次。將吸附柱CB3 置于室溫下放置數(shù)分鐘，丟掉收集管，以徹底晾干吸附材料中殘余的漂洗液。將吸附柱CB3 放入無菌離心管中，向吸附膜的中間部位滴加100 μL 洗脫緩沖液TE，盡量使洗脫液全部滴在吸附膜上，室溫下放置5 min，離心（轉(zhuǎn)速12 000 r/min，時間2 min），離心后將上清液收集到離心管中。為提高DNA 的收集率，將收集到的液體重新移入到上述吸附柱CB3 中，吸附柱套入新的離心管中，離心（轉(zhuǎn)速12 000 r/min，時間2 min），離心后將上清液收集到離心管中[15]。用同樣的方法提取紅豆、黃豆、蠶豆、青豆、榛子、花生、綠豆、巴旦木、夏威夷果、扁杏仁、開心果、葵花籽、鷹嘴豆、碧根果、腰果、松子、黑豆的DNA。由于紅豆、黃豆、綠豆、黑豆質(zhì)地較硬，提取前用無菌水浸泡1 h，便于研磨。

1.2.2 引物的設(shè)計

陽性參考：根據(jù)不同物種具有各自特異的基因，從Genbank 數(shù)據(jù)庫下載核桃的Jug r 1 的基因，利用Primer Premier 6 軟件設(shè)計出3 組引物，設(shè)計并利用NCBI 網(wǎng)站初步監(jiān)測引物的特異性。查找文獻(xiàn)，利用2 對引物WAL-F/R（GATCTATATTGTTGGAAAATGTAGC/GGTTAGAATCATTAGTGGAAATCAG）[16]，Jur Primer-F/R（TTCAACGTGACCATCTCCCC/ACACGAGGATGTGCTTGCTA）[17]做陽性參考。

引物的設(shè)計：設(shè)計出3 對引物，Jur 1 Primer-F/R（CTGGAAGATAACTGGTGACTA/ATTAGCAAGACGAGGCATT） 158 bp；Jur 2 Primer-F/R（GACAACCAGCGGCAGCATT/GCACCATCTCCTCCATTTCCTC）145 bp；Jur 3 Primer-F/R（GGGTGAGGAAATGGAGGAGAT/GGATGTGC TTGCTAGTTGCTA） 199 bp。

1.2.3 各引物PCR 擴(kuò)增條件優(yōu)化

以核桃DNA 為模板，以1.5%的瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳，以確定3 對引物的各自最佳退火溫度。

1.2.4 各引物PCR 反應(yīng)體系優(yōu)化

WAL：Taq DNA 聚合酶12.5 μL、上下游引物各0.5 μL、DNA 模板1 μL，添加滅菌蒸餾水10.5 μL；Jur Primer：Taq DNA 聚合酶22 μL、上下游引物各1 μL、DNA 模板2 μL，添加滅菌蒸餾水74 μL；Jur 1 Primer：Taq DNA 聚合酶25 μL、上下游引物各1 μL、DNA 模板2 μL，添加滅菌蒸餾水20 μL；Jur 2 Primer：Taq DNA 聚合酶23 μL、上下游引物各1 μL、DNA 模板2 μL，添加滅菌蒸餾水20 μL；Jur 3 Primer：Taq DNA 聚合酶23 μL、上下游引物各1 μL、DNA 模板2 μL，添加滅菌蒸餾水20 μL。

PCR 擴(kuò)增的反應(yīng)條件見表1[18]。

表1 PCR 擴(kuò)增的反應(yīng)條件

1.2.5 特異性試驗

用市面上常見的干果豆類：黃豆、青豆、蠶豆、綠豆、紅豆、巴旦木、榛子、夏威夷果、扁杏仁、開心果、葵花籽、碧根果、腰果、核桃、松子、鷹嘴豆、黑豆、花生檢測引物的特異性。

1.2.6 靈敏度試驗

分別取10 g 的核桃、花生加入不同研缽，快速研磨成粉末狀。制出含有0.01%，0.10%核桃成分的花生粉樣品[15]。將稀釋后的樣品的DNA 進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，并進(jìn)行電泳。

2 結(jié)果與分析

2.1 樣品DNA 提取效率

為避免利用天根植物DNA 提取盒提取的DNA出現(xiàn)假陰性，需經(jīng)過檢測以確定是否適合后續(xù)的PCR 檢測。

樣品DNA 的提取效率見表2。

表2 樣品DNA 的提取效率

2.2 各引物PCR 擴(kuò)增條件的確定

WAL 引物的最佳退火溫度為64 ℃，Jur 引物的最佳退火溫度為54 ℃，引物Jur 1 Primer，Jur 2 Primer，Jur 3 Primer 的最佳退火溫度需要設(shè)置溫度梯度確定[19]。

Jur 1 Primer 引物PCR 退火溫度的確認(rèn)見圖1，Jur 2 Primer 引物PCR 退火溫度的確認(rèn)見圖2，Jur 3 Primer 引物PCR 退火溫度的確認(rèn)見圖3。

圖1 Jur 1 Primer 引物PCR 退火溫度的確認(rèn)

圖2 Jur 2 Primer 引物PCR 退火溫度的確認(rèn)

圖3 Jur 3 Primer 引物PCR 退火溫度的確認(rèn)

由圖1 ~圖3 可知，最佳退火溫度為：Jur 1 引物50.7 ℃，Jur 2 引物（64.0 ℃；Jur 3 引物64.0 ℃。

Jur 1 引物的Tm值為50 ℃，設(shè)置退火溫度50~60 ℃，8 個梯度分別為A：60.0 ℃，B：59.2 ℃，C：58.0 ℃，D：56.1 ℃，E：53.8 ℃，F(xiàn)：51.9 ℃，G：50.7 ℃，H：50.0 ℃，如圖1 所示。在圖1 中，Jur 1 引物在50.7 ℃時，擴(kuò)增出158 bp 大小的片段，且條帶清晰沒有拖帶，故Jur 1 引物的最佳退火溫度為50.7 ℃。

Jur 2 和Jur 3 引物的Tm值均為55 ℃，故均設(shè)置退火溫度50~64 ℃，形成8 個梯度，分別為A：64.0 ℃，B：62.9 ℃，C：61.2 ℃，D：58.5 ℃，E：55.3 ℃，F(xiàn)：52.7 ℃，G：51.0 ℃，H：50.0 ℃，如圖2 和圖3 所示。在圖2 中，Jur 2 引物在64.0 ℃時，擴(kuò)增出145 bp大小的片段，且條帶清晰沒有拖帶，故Jur 2 引物的最佳退火溫度為64.0 ℃。在圖3 中，Jur 3 引物在64.0 ℃時，擴(kuò)增出199 bp 大小的條帶，且條帶清晰沒有拖帶，故Jur 3 引物的最佳退火溫度為64.0 ℃。

2.3 引物的特異性檢測

Jur 1 Primer 引物對常見富含蛋白質(zhì)植物DNA 擴(kuò)增的結(jié)果見圖4，Jur 2 Primer 引物對常見富含蛋白質(zhì)植物DNA 擴(kuò)增的結(jié)果見圖5，Jur 3 Primer 引物對常見富含蛋白質(zhì)植物DNA 擴(kuò)增的結(jié)果見圖6。

圖4 Jur 1 Primer 引物對常見富含蛋白質(zhì)植物DNA 擴(kuò)增的結(jié)果

圖5 Jur 2 Primer 引物對常見富含蛋白質(zhì)植物DNA 擴(kuò)增的結(jié)果

圖6 Jur 3 Primer 引物對常見富含蛋白質(zhì)植物DNA 擴(kuò)增的結(jié)果

由圖4 ~圖6 可知，3 對引物的特異性良好。在圖4 中，Jur 1 引物只擴(kuò)增出158 bp 大小的核桃DNA片段；同樣的，在圖5 和圖6 中，Jur 2 引物和Jur 3引物也分別只擴(kuò)增出145 bp 和199 bp 大小的核桃DNA 片段。結(jié)果表明，對引物是核桃基因組DNA 的特異性引物，且特異性良好。

2.4 PCR 靈敏度的檢測

Jur 1 Primer 引物靈敏度檢測結(jié)果見圖7，Jur 2 Primer 引物靈敏度檢測結(jié)果見圖8，Jur 3 Primer 引物靈敏度檢測結(jié)果見圖9。

圖7 Jur 1 Primer 引物靈敏度檢測結(jié)果

圖8 Jur 2 Primer 引物靈敏度檢測結(jié)果

圖9 Jur 3 Primer 引物靈敏度檢測結(jié)果

在圖7 中，Jur 1 引物只在100%核桃基因組、10%核桃+ 90%花生基因組以及0.1%核桃+ 99.9%花生基因組中擴(kuò)增出158 bp 大小的DNA 片段，故Jur 1引物的核桃檢測最低限為0.1%；同樣的，在圖8 中，Jur 2 引物只在100%核桃基因組、10%核桃+ 90%花生基因組以及0.1%核桃+ 99.9%花生基因組中擴(kuò)增出145 bp 大小的DNA 片段，故Jur 2 引物的核桃檢測最低限為0.1%；而在圖9 中，Jur 3 引物在0.01%核桃+ 99.99%花生基因組中擴(kuò)增出199 bp 大小的DNA 片段，故Jur 3 引物的核桃檢測最低限為0.03%。3 對引物相比而言，Jur 3 的靈敏度更高，適合于精密檢測。

3 結(jié)論

核桃過敏原的檢測主要有ELISA、普通PCR 和熒光PCR 等3 種方法，但是與其他2 種方法相比，普通PCR 方法所用的儀器簡單、操作方便、成本低，能夠滿足一般實(shí)驗室的要求，除此之外還有結(jié)果準(zhǔn)確、靈敏度高等優(yōu)點(diǎn)。試驗采用普通PCR 法，將核桃DNA 濃度進(jìn)行梯度稀釋，利用設(shè)計的3 對引物進(jìn)行靈敏度試驗，結(jié)果表明該方法靈敏度高，3 對引物的最低檢測限可達(dá)0.01%（質(zhì)量分?jǐn)?shù)）；試驗選擇18 種常見的干果豆類，利用設(shè)計的3 對引物進(jìn)行特異性試驗，結(jié)果表明設(shè)計的3 對引物特異性強(qiáng)；最后，試驗所設(shè)計的引物來源于核桃的特有過敏原基因Jur 1，可提高試驗的準(zhǔn)確度，有效避免試驗的假陽性。以上數(shù)據(jù)均表明該試驗建立的PCR 方法適用于食品中核桃成分的分析。

PCR 檢測過程中，影響PCR 檢測效果的因素有很多，其中DNA 的提取效率也是影響PCR 擴(kuò)增效果的重要因素之一。此外，核桃中含有蛋白質(zhì)、單寧、多糖、酚類及色素等次生代謝物質(zhì)會影響Taq DNA聚合酶的活性，進(jìn)而影響PCR 擴(kuò)增的效果。以前曾用的多種核酸提取方法提取核桃的DNA，如SDS法、高鹽低PH 法、CTAB 法和簡易CTAB 法等，然而還是不能有效除去干擾物質(zhì)，導(dǎo)致影響試驗結(jié)果的準(zhǔn)確性。為了保證試驗的準(zhǔn)確性和可靠性，采用試劑盒法提取核桃額DNA，避免的上述缺陷。但是試驗所使用的PCR，又需要花費(fèi)大量的時間，因此還需去探索更快速、靈敏、準(zhǔn)確的方法，如熒光定量PCR、質(zhì)譜法和表面等離子共振生物生物傳感器等[19-20]。