檸檬酸水解法制備大豆多肽的研究

楊培周，陸書花，李叢旭，王澤民

（1. 合肥工業(yè)大學(xué)食品與生物工程學(xué)院，安徽合肥 230601；2. 安徽紅花食品有限公司，安徽蚌埠 233799）

大豆多肽是大豆蛋白水解后得到的分子質(zhì)量在6 000 Da 以下，長度為2~20 個(gè)氨基酸的小分子蛋白片段或氨基酸鏈，具有一定的生物活性，有利于人體的消化吸收[1]。目前，已被國內(nèi)外研究證實(shí)的保健功效包括降血壓、降血糖、降膽固醇、抗腫瘤、免疫調(diào)節(jié)等[2]。雖然大豆多肽的生產(chǎn)已經(jīng)擁有很長一段歷史，但是傳統(tǒng)工業(yè)化生產(chǎn)方法仍然存在著較多急需解決的難題。

大豆種子含有多種內(nèi)源酶，其中蛋白酶（包括內(nèi)肽酶和外肽酶） 是最重要的部分。蛋白酶可以將蛋白質(zhì)水解成多肽、寡肽和游離氨基酸，從而改變蛋白質(zhì)的功能、營養(yǎng)和感官特性[3]。Chen Y M 等人[4]在大豆水提取物中鑒定出16 種內(nèi)肽酶、13 種外肽酶、24 種蛋白酶抑制劑和1 種谷氨酸脫羧酶，其中天冬氨酸內(nèi)肽酶在pH 值為2.5~3.0，溫度為35~45 ℃時(shí)活性最佳。大豆中的內(nèi)源性蛋白酶可在酸性、中性和堿性條件下發(fā)揮水解作用[5]。檸檬酸作為人體內(nèi)三羧酸循環(huán)中的主要中間代謝物，對人體健康無害，是一種安全的食品添加劑，現(xiàn)已廣泛應(yīng)用于食品、醫(yī)藥等行業(yè)[6]。尹彥洋等人[7]將檸檬酸與胃蛋白酶協(xié)同水解牛骨粉制備多肽，當(dāng)檸檬酸作用于蛋白質(zhì)時(shí)，蛋白質(zhì)因其次級鍵受到破壞而分解，在胃蛋白酶協(xié)同作用下可獲得大量低分子肽。

以大豆為研究對象，采用檸檬酸酸解大豆蛋白方法，通過調(diào)節(jié)pH 值，控制孵育溫度和時(shí)間，制備大豆多肽。除添加少量檸檬酸外，不含其他任何添加劑和酶制劑，有效降低了風(fēng)險(xiǎn)，實(shí)現(xiàn)生產(chǎn)全過程的綠色高效和低能耗，降低了生產(chǎn)成本。所制備的大豆多肽可應(yīng)用于食品等領(lǐng)域，具有良好的應(yīng)用價(jià)值。

1 材料與方法

1.1 試劑耗材和儀器設(shè)備

黃豆，產(chǎn)自北京市密云區(qū)；牛血清蛋白；TEMED；三氯乙酸；十二烷基硫酸鈉；考馬斯亮藍(lán)G-250；溴酚藍(lán)；低分子量蛋白質(zhì)Marker（14.4~97.4 kDa）和4×蛋白上樣緩沖液（含巰基還原劑），北京索萊寶科技有限公司提供；氫氧化鈉、檸檬酸、甲醇等為分析純，均購自國藥集團(tuán)。

L18-P132 型高速破壁調(diào)理機(jī)，九陽股份有限公司產(chǎn)品；凝膠成像儀，美國Bio-Rad 公司產(chǎn)品；UV-1201 型紫外分光光度計(jì)，北京瑞利公司產(chǎn)品；EPS-300 DNA 型電泳設(shè)備、PHS-25 型pH 計(jì)，上海天能科技和大普儀器有限公司產(chǎn)品；HH-4 型水浴鍋，國華電器公司產(chǎn)品；5430R 型低溫高速離心機(jī)，德國Eppendorf 公司產(chǎn)品。

1.2 大豆多肽質(zhì)量濃度和蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度的測定

大豆多肽質(zhì)量濃度測定的方法依據(jù)在波長238 nm處，蛋白質(zhì)溶液吸光度的大小與肽鍵的數(shù)量呈正比[8]。配制質(zhì)量濃度為10 mg/mL 的牛血清蛋白標(biāo)準(zhǔn)溶液，分別稀釋成質(zhì)量濃度為50~300 μg/mL 的標(biāo)準(zhǔn)溶液，以蒸餾水作為空白對照，在波長238 nm 處測定不同質(zhì)量濃度的吸光度，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，所得多肽標(biāo)準(zhǔn)擬合方程為Y=0.001 44X-0.054 8，R2=0.997。

蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作參照文獻(xiàn)[9]考馬斯亮藍(lán)法。吸取0.1 mL 0~100 μg/mL 的標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)溶液于5.0 mL 考馬斯亮藍(lán)溶液中，充分混勻后，避光靜置10 min 后于波長595 nm 處測定其吸光度。得到的蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)擬合方程為Y=0.006 2X+0.111 2，R2=0.998。

樣品中多肽質(zhì)量濃度的測定方法：取均質(zhì)樣品2 mL 于試管中添加質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10%（W/V） 的三氯乙酸溶液2 mL，充分混勻后靜置15 min 以沉淀蛋白，以轉(zhuǎn)速3 500 r/min 離心10 min，取上清液，以去離子水為空白對照，在波長238 nm 處測定樣品的吸光度，確定樣品中的多肽含量。

樣品中蛋白質(zhì)含量的測定方法：在10 mL 試管中加入0.1 mL 樣品離心后的上層清液，再加入5 mL考馬斯亮藍(lán)溶液，充分混勻后，避光靜置10 min。于波長595 nm 處測定樣品吸光度，確定樣品中蛋白質(zhì)含量。

1.3 檸檬酸浸泡對大豆蛋白水解情況的影響

為了探究打漿前檸檬酸浸泡大豆對豆?jié){中蛋白質(zhì)含量的影響[10]，每組稱取大豆各50 g，用去離子水浸泡清洗2 次，瀝干水分后以豆液質(zhì)量比為1∶5，使用質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0~15%（W/W） 的檸檬酸溶液于常溫條件下浸泡15 h。浸泡后，使用去離子水清洗3 次后以豆液質(zhì)量比1∶9 打漿3 min，使用100 目尼龍濾布進(jìn)行過濾，去除濾渣，得到生豆?jié){。以轉(zhuǎn)速13 000 r/min 離心5 min，取上層清液，用于蛋白質(zhì)含量測定和SDS-PAGE 表征蛋白水解的情況[11]。

1.4 孵育pH 值對大豆多肽含量的影響

稱取大豆50 g，清洗3~4 次后，用去離子水以豆液質(zhì)量比1∶5 于常溫條件下過夜浸泡。按步驟1.3 生豆?jié){制備的方法進(jìn)行打漿、過濾。將生豆?jié){均勻分成7 等份（每份50 mL），利用質(zhì)量分?jǐn)?shù)為5%（W/W） 的檸檬酸溶液或濃度為1 mol/L 的氫氧化鈉溶液將各組生豆?jié){pH 值分別調(diào)至3，4，5，6，7，8，9 后，置于50 ℃水浴鍋中孵育5 h。孵育結(jié)束后，以轉(zhuǎn)速13 000 r/min 離心5 min，取上層清液，測定多肽含量及SDS-PAGE分析蛋白水解情況。

1.5 孵育溫度對大豆多肽質(zhì)量濃度的影響

制備450 mL 生豆?jié){，使質(zhì)量分?jǐn)?shù)為5%（W/W）的檸檬酸溶液將pH 值調(diào)至4，均勻分成7 等份，將每組樣品分別置于30，35，40，45，50，55，60 ℃的恒溫水浴鍋中孵育5 h。孵育結(jié)束后，以轉(zhuǎn)速13 000 r/min 離心5 min，取上層清液，測定多肽質(zhì)量濃度及SDS-PAGE 分析蛋白水解情況。

1.6 孵育時(shí)間對大豆多肽質(zhì)量濃度的影響

制備300 mL 生豆?jié){，使用質(zhì)量分?jǐn)?shù)為5%（W/W）檸檬酸溶液將pH 值調(diào)至4，均勻分成6 等份，置于50 ℃水浴鍋中分別孵育3，4，5，6，7，8 h，孵育結(jié)束后，以轉(zhuǎn)速13 000 r/min 離心5 min，取上層清液，測定多肽質(zhì)量濃度及SDS-PAGE 分析蛋白水解情況。

1.7 響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)

根據(jù)單因素試驗(yàn)的結(jié)果，選擇孵育pH 值、孵育溫度、孵育時(shí)間3 個(gè)指標(biāo)進(jìn)行響應(yīng)面優(yōu)化分析（三因素三水平），并通過軟件模擬獲得二次多項(xiàng)式回歸方程，得出制備大豆多肽最佳的工藝參數(shù)，以大豆多肽含量為響應(yīng)值。

響應(yīng)面試驗(yàn)因素與水平設(shè)計(jì)見表1。

表1 響應(yīng)面試驗(yàn)因素與水平設(shè)計(jì)

1.8 SDS-PAGE 凝膠電泳

取離心后的樣品上清液30 μL 于試管中，加入10 μL 4×蛋白上樣緩沖液。于100 ℃沸水中加熱5 min，使蛋白變性。以轉(zhuǎn)速13 000 r/min離心3 min，取上清液進(jìn)行電泳。使用考馬斯亮藍(lán)染色液G-250染色，過夜脫色后拍照。

1.9 統(tǒng)計(jì)分析

試驗(yàn)數(shù)據(jù)均采用SPSS 8.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，Origin 9.0 軟件作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 檸檬酸浸泡對蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度的影響

不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)檸檬酸浸泡大豆對豆?jié){中蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度的影響見圖1。

圖1 不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)檸檬酸浸泡對豆?jié){中蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度的影響

由圖1 可知，豆?jié){中蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度隨檸檬酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)的變大先降低后增加，在檸檬酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)為5%時(shí)，蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度達(dá)到最低為49 μg/mL。當(dāng)溶液中檸檬酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)偏高時(shí)，可能破壞了大豆內(nèi)源性蛋白酶的活性或未處于其最適pH 值，無法大量水解大豆蛋白。

2.2 單因素試驗(yàn)結(jié)果

孵育pH 值對豆?jié){中多肽質(zhì)量濃度的影響見圖2。

圖2 孵育pH 值對豆?jié){中多肽質(zhì)量濃度的影響

由圖2 可知，隨著孵育pH 值的增大，多肽質(zhì)量濃度先增加后降低。孵育pH 值為4 時(shí)，豆?jié){體系中多肽的質(zhì)量濃度達(dá)到最大值為1 429 μg/mL。此外，在孵育pH 值為6 和7 時(shí)，多肽質(zhì)量濃度無明顯變化，這可能由于生豆?jié){的孵育pH 值一般在6~7，大分子蛋白未發(fā)生水解；當(dāng)孵育pH 值為8 和9 時(shí)，溶液為堿性，此時(shí)多肽質(zhì)量濃度分別為920 μg/mL 和915 μg/mL。多肽含量的降低可能是由于堿性條件下，產(chǎn)生的多肽被大豆內(nèi)源性肽酶分解為氨基酸。

孵育溫度對豆?jié){中多肽質(zhì)量濃度的影響見圖3。

圖3 孵育溫度對豆?jié){中多肽質(zhì)量濃度的影響

由圖3 可知，多肽質(zhì)量濃度隨著溫度的升高先增加后降低。50 ℃處理組中多肽質(zhì)量濃度最高為1 391 μg/mL；在30~50 ℃處理組，隨著溫度的升高，大豆內(nèi)源性酶活性逐步提高，產(chǎn)生的多肽質(zhì)量濃度變多。當(dāng)溫度大于50 ℃時(shí)，樣品中多肽質(zhì)量濃度逐漸下降，主要原因是大豆蛋白和部分小分子多肽在內(nèi)源蛋白酶和內(nèi)外肽酶的作用下進(jìn)一步水解產(chǎn)生游離氨基酸[11]。

孵育時(shí)間對多肽質(zhì)量濃度的影響見圖4。

圖4 孵育時(shí)間對多肽質(zhì)量濃度的影響

由圖4 可知，隨著孵育時(shí)間的延長，多肽質(zhì)量濃度快速增長，在孵育時(shí)間為6 h 時(shí)，達(dá)到最大值為1 261 μg/mL；孵育7 h 和8 h 后，多肽質(zhì)量濃度分別為1 259.62 μg/mL和1 260.34 μg/mL，與孵育6 h多肽質(zhì)量濃度基本保持一致，因此豆?jié){的最適孵育時(shí)間為6 h。

2.3 響應(yīng)面試驗(yàn)優(yōu)化結(jié)果

基于單因素試驗(yàn)結(jié)果，進(jìn)行響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)。

響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果見表2。

表2 響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果

由表2 可知，運(yùn)用Design Expert 10 軟件對各因素進(jìn)行回歸擬合，得到二次多元回歸方程：

響應(yīng)面方差分析見表3。

表3 響應(yīng)面方差分析

方差分析是評價(jià)回歸模型的有效方式之一。由表3 可看出，得到的模型p 值為0.000 1（<0.001 0），說明該模型差異極顯著，失擬項(xiàng)為0.421 4>0.050 0不顯著，表明外界非試驗(yàn)因素對試驗(yàn)結(jié)果沒有顯著影響。相關(guān)系數(shù)R2=0.998 9，R2Adj=0.997 5，說明模型擬合程度較好，預(yù)測得率與實(shí)際多肽得率之間有較高的擬合度，試驗(yàn)誤差較小，方法可行。根據(jù)F 值大小可判斷，3 個(gè)因素對多肽質(zhì)量濃度的影響程度依次為孵育溫度>孵育pH 值>孵育時(shí)間。

孵育pH 值和孵育溫度對多肽質(zhì)量濃度影響的響應(yīng)面和等高線圖見圖5，孵育pH 值和孵育時(shí)間對多肽質(zhì)量濃度影響的響應(yīng)面和等高線圖見圖6，孵育溫度和孵育時(shí)間對多肽質(zhì)量濃度影響的響應(yīng)面和等高線圖見圖7。

圖5 孵育pH 值和孵育溫度對多肽質(zhì)量濃度影響的響應(yīng)面和等高線圖

圖6 孵育pH 值和孵育時(shí)間對多肽質(zhì)量濃度影響的響應(yīng)面和等高線圖

圖7 孵育溫度和孵育時(shí)間對多肽質(zhì)量濃度影響的響應(yīng)面和等高線圖

圖5 的鞍面最陡，說明孵育pH 值和孵育溫度的交互作用對多肽質(zhì)量濃度的影響最大。圖6 呈現(xiàn)有一定坡度的斜面，說明孵育pH 值和孵育時(shí)間之間存在一定的相互作用。而圖7 中的鞍面較為平緩，說明孵育溫度和孵育時(shí)間之間的交互作用不顯著。

通過響應(yīng)面優(yōu)化分析得出最佳的多肽制備條件為孵育pH 值4.18，孵育溫度48.45 ℃，孵育時(shí)間6.21 h?？紤]到實(shí)際操作情況將制備工藝調(diào)整如下：孵育pH 值4.0，孵育溫度48 ℃，孵育時(shí)間6 h，調(diào)整后制備的多肽質(zhì)量濃度為1 437 μg/mL，與理論值接近。說明上述擬合模型具有可靠性。

2.4 SDS-PAGE 凝膠圖譜分析

2.4.1 不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)檸檬酸浸泡對大豆蛋白水解的影響

利用SDS-PAGE 電泳，分析不同濃度檸檬酸浸泡大豆對豆?jié){體系中蛋白質(zhì)水解的影響。

不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)檸檬酸浸泡后大豆蛋白的SDSPAGE 圖譜分析見圖8。

圖8 不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)檸檬酸浸泡后大豆蛋白的SDS-PAGE 圖譜分析

由圖8 可知，未添加檸檬酸處理的樣品組含有較復(fù)雜的蛋白條帶，質(zhì)量分?jǐn)?shù)最高的蛋白分子量主要集中在66，43，31，22 kDa 附近。當(dāng)檸檬酸浸泡質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2.5%時(shí)，分子量為97 kDa和60 kDa 左右的大分子蛋白水解效果較差，但其他大于22 kDa 的蛋白均被水解。當(dāng)質(zhì)量分?jǐn)?shù)為5.0%時(shí)，豆?jié){體系中蛋白質(zhì)幾乎完全被分解，與2.5%相比，97.4 kDa 附近的條帶消失，僅在50 kDa 和小于22.0 kDa 處有較淺的蛋白條帶。當(dāng)檸檬酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)達(dá)到7.5%時(shí)，43~90 kDa 的范圍中，出現(xiàn)與空白組對應(yīng)的蛋白條帶，說明檸檬酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)過高導(dǎo)致的大豆內(nèi)源性蛋白酶失活無法水解大豆蛋白。因此選擇5%的檸檬酸浸泡大豆使后續(xù)豆?jié){體系中大分子蛋白充分水解為多肽和氨基酸。

2.4.2 不同孵育pH 值對大豆蛋白水解的影響

利用SDS-PAGE 電泳，分析不同孵育pH 值條件下的大豆蛋白樣品。

不同孵育pH 值條件下大豆蛋白的SDS-PAGE圖譜分析見圖9。

圖9 不同孵育pH 值條件下大豆蛋白的SDS-PAGE 圖譜分析

由圖9 可知，當(dāng)豆?jié){溶液pH 值為6 和7 時(shí)，圖譜顯示蛋白均未發(fā)生水解，條帶位置和強(qiáng)度基本一致。當(dāng)豆?jié){體系為堿性；pH 值為8 和9 時(shí)，超過66.2 kDa 的部分蛋白發(fā)生少量水解，含量降低，但仍有較多的大分子蛋白未被水解。此外，在31.0 kDa和21.0 kDa 附近出現(xiàn)新的蛋白條帶（紅色箭頭）。這說明，當(dāng)溶液為堿性時(shí)，可在一定程度上使大豆蛋白水解為分子量較小的蛋白質(zhì)；當(dāng)豆?jié){體系為酸性即pH 值為3，4，5 時(shí)，從圖譜中可看出大分子蛋白均被水解。pH 值為4 和5 時(shí)，蛋白條帶基本一致（條帶2 和3），條帶2 蛋白含量較低顏色較淺；當(dāng)pH 值為3 時(shí)，66.2 kDa 的大分子蛋白未被水解（橙色箭頭），其主要原因可能是過低的pH 值使大豆內(nèi)源性蛋白酶失活，難以起到輔助檸檬酸酸解大豆蛋白的作用。因此，不同pH 值處理組中蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度及種類均發(fā)生變化，說明大豆內(nèi)源性蛋白酶最適pH 值不同導(dǎo)致不同水解大豆蛋白種類。

3 結(jié)論

研究了不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)檸檬酸浸泡大豆對豆?jié){體系中蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度的影響，采用單因素試驗(yàn)和響應(yīng)面設(shè)計(jì)試驗(yàn)，對檸檬酸酸解大豆蛋白制備多肽的條件進(jìn)行了優(yōu)化。結(jié)果表明，5%檸檬酸浸泡大豆可使豆?jié){中蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度降低至49 μg/mL，當(dāng)孵育pH 值4.0，孵育溫度48 ℃，孵育時(shí)間6 h 時(shí)，制備的多肽質(zhì)量濃度為1 437 μg/mL。通過SDS-PAGE 電泳發(fā)現(xiàn)大豆蛋白的分子量集中在43.0~97.4 kDa，不同孵育pH 值對豆?jié){中蛋白質(zhì)的質(zhì)量濃度和種類有較大的影響。經(jīng)多肽質(zhì)量濃度和圖譜分析表明經(jīng)酸性條件處理后，大豆中大部分蛋白被水解為多肽。