麩炒蒼術對脾虛證大鼠結腸組織通透性的影響

謝慧臣,冉云,張云,歐陽瑜,唐浪,吳廣陽

(1.湖北民族大學 中醫(yī)藥學院,湖北 恩施 445000;2.恩施德元升中醫(yī)醫(yī)院 中醫(yī)科,湖北 恩施 445000)

麩炒法是中藥傳統(tǒng)炮制工藝,又稱麥麩炒或麩皮炒,其炮制方法是將切制或凈制后的中藥加相應比例的麥麩拌炒至藥材表面呈金黃色時取出,篩去麩皮,放涼備用。目前麩炒法的作用機理研究使人們對其影響中藥療效的機理有了一定的認識［1］。蒼術是應用麩炒法的典型常用中藥,具有健脾、燥濕、祛風、散寒、解郁、辟穢等功效。麩炒蒼術與生蒼術功效有所差異,其原因是麩炒后蒼術化學成分及含量發(fā)生了較大變化［2］。盡管蒼術臨床應用廣泛,目前對蒼術的研究主要集中在不同的炮制方法下其活性成分種類及化學成分的變化方面,而對蒼術藥理作用的實驗研究還較為欠缺,尤其缺乏細胞與分子層面的研究,且對其單體有效成分的藥理研究尚屬空白［3］。本研究以脾虛證大鼠為模型,從結腸組織通透性及CAM-MLCK信號通路入手進行實驗,以期從結腸黏膜屏障的損傷與修復過程途徑闡明蒼術麩炒后改善脾虛證候的藥理作用機制,為后續(xù)麩炒蒼術單體成分的進一步研究及臨床應用奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 研究材料

1.1.1 實驗動物

SD雄性大鼠60只,3～4月齡,體質(zhì)量為(150±20)g,購自武漢子科恒生物科技有限公司［動物生產(chǎn)許可證號:SCXK(鄂)20190116,使用許可證號:SYXK(鄂)2020-0203］。本研究已通過湖北民族大學倫理委員會審批(審批號:2019054)。常規(guī)喂養(yǎng),自由進食水。

1.1.2 藥物與試劑

中藥購自湖北省恒信醫(yī)藥有限公司。苦寒破氣方藥液配制方法:厚樸、枳實、大黃的用藥質(zhì)量比為5∶3∶4,常規(guī)煎煮2次;麩炒蒼術藥液配制方法:蒼術飲片洗凈干燥,先后加入10倍體積和8倍體積蒸餾水煎煮2次,45 min/次,濾液合并濃縮?？嗪茪夥綕饪s液生藥質(zhì)量濃度為2 g/mL,麩炒蒼術生藥質(zhì)量濃度1 g/mL,低溫保存,使用時加入蒸餾水稀釋至適當質(zhì)量濃度。復方谷氨酰胺腸溶膠囊(批號:200104)購自地奧集團成都藥業(yè)股份有限公司。

閉鎖連接蛋白-1(zonula occludens-1,ZO-1,批號:B3305)、密封蛋白-1(Claudin-1,批號:B2021)、密封蛋白-2(Claudin-2,批號:B2022)、閉合蛋白(Occludin)ELISA試劑盒(批號:B2040)購自上海信帆生物科技有限公司;磷酸化絲裂原細胞外激酶1/2(phosphorylated mitogen extracellular kinase1/2,p-MEK1/2)一抗(批號:G3125)、磷酸化細胞外信號調(diào)節(jié)蛋白激酶1/2(phosphorylated extracellular signal-regulated protein kinase1/2,p-ERK1/2)一抗(批號:G2014)、熒光二抗(批號:GB25021)、磷酸化蛋白酶抑制劑(批號:G2301)、肌球蛋白輕鏈激酶(myosin light chain kinase,MLCK,批號:G3412)、鈣調(diào)蛋白(calmodulin,CAM)兔抗鼠免疫球蛋白(IgG)多克隆抗體(批號:G2361)、免疫熒光染色試劑盒(批號:F2021)、DAB顯色劑(批號:G32415)購自武漢塞維爾生物科技有限公司;RNA提取液(批號:J312546)購自Servicebio;HyPureTMMolecular Biology Grade Water(批號:J413261)購自HyClone;Trizol(批號:J402134)、RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit(批號:J265143)引物購自Thermo。引物序列見表1。

表1 引物序列信息Table 1 Primer sequence information

1.1.3 儀器

Stepone plus GC-1500 型熒光定量PCR儀(ABI)、D3024R臺式高速冷凍型微量離心機(DragonLab)、Rt2100c酶標檢測儀(Rayto)、alphaEaseFC灰度分析軟件(Alpha Innotech)、Adobe PhotoShop圖像分析軟件(Adobe)、NanoDrop2000超微量分光光度計(Thermo)、NE600光學顯微鏡、XK-S2000D熒光顯微鏡購自西尼科光學儀器有限公司;AutoLumo A2000Plus化學發(fā)光儀購自鄭州安圖生物工程股份有限公司。

1.2 研究方法

1.2.1 動物分組、造模與給藥方法

適應性喂養(yǎng)7 d,所有大鼠隨機分為6組:正常組(CON)、脾虛證模型組(MOD)、麩炒蒼術高、中、低劑量組(BRA-H、BRA-M、BRA-L)、復方谷氨酰胺組(CG),10只/組。除CON組外,其余大鼠均以慢性束縛、苦寒破氣加饑飽失常法建立脾虛證大鼠模型［4-5］。每kg大鼠每日以生藥20 g灌服苦寒破氣方1次,束縛架捆綁束縛3 h,后喂飼料(常規(guī)量的一半,隔日1次),持續(xù)21 d。造模結束后的第2天開始灌胃治療。根據(jù)體表面積公式換算,BRA-L、BRA-M、BRA-H組每kg大鼠每日中藥灌胃量分別為5、10、20 g,CG組為9 mg復方谷氨酰胺配制成的溶液2 mL;CON和MOD組予等體積生理鹽水進行灌胃,持續(xù)14 d。

1.2.2 觀察結腸組織病理改變

治療結束后,各組大鼠禁食不禁水24 h,腹腔注射麻醉后,剖開胸腹腔,心臟采血6 mL,離心,取上清液,-80 ℃保存;切取部分結腸組織,液氮保存;再取部分使用4%多聚甲醛固定液固定,經(jīng)脫水和石蠟包埋后切片,常規(guī)HE染色,光鏡下觀察結腸組織病理學改變。另取部分使用透射電鏡觀察細胞超微病理學變化,步驟如下:戊二醛前固定→漂洗→脫水→包埋→超薄切片→鈾、鉛染色→電鏡觀察。

1.2.3 Elisa法檢測結腸黏膜組織ZO-1、Claudin-1、Claudin-2、Occludin的質(zhì)量分數(shù)

低溫下取結腸組織一塊,冰生理鹽水洗凈濾干,9倍體積生理鹽水勻漿,低溫高速離心(4 ℃ 3 500 r/min)10 min,收集細胞上清液,使用Elisa法檢測結腸黏膜組織ZO-1、Claudin-1、Claudin-2、Occludin的質(zhì)量分數(shù)。

1.2.4 免疫熒光法檢測結腸黏膜組織細胞p-MEK1/2、p-ERK1的蛋白分布及表達

取冷凍結腸組織一塊,切片(厚度約200 μm),37 ℃烘烤過夜,脫蠟,檸檬酸緩沖液修復,PBS緩沖液沖洗2次,加一抗(Vp-MEK1/2∶VPBS=1∶200;Vp-ERK1∶VPBS=1∶200)孵育過夜;PBS緩沖液沖洗2次,二抗(Vp-MEK1/2∶VPBS=1∶400;Vp-ERK1∶VPBS=1∶400)孵育30 min;PBS緩沖液沖洗2次,加染液染色,CO2孵箱孵育30 min;PBS緩沖液沖洗3次,封片,熒光標記后使用熒光顯微鏡連續(xù)攝取圖片采集圖像,Adobe PhotoShop圖像分析系統(tǒng)測定并分析熒光強度。

1.2.5 免疫組化法檢測結腸組織細胞MLCK、CAM的蛋白表達

取結腸組織一塊,4%多聚甲醛溶液固定,包埋,按照免疫組織化學SABC法步驟操作,切片放入3%H2O2溶液10 min,蒸餾水沖洗3次,PBS緩沖液行微波修復,滴加5%BSA封閉液,37 ℃反應30 min,滴加MLCK、CAM一抗(VMLCK∶VPBS=1∶200;VCAM∶VPBS=1∶200),4 ℃反應過夜,PBS緩沖液沖洗3次,滴加二抗(Vp-MEK1/2∶VPBS=1∶400;Vp-ERK1∶VPBS=1∶400),37 ℃反應30 min,PBS緩沖液沖洗3次,滴加SABC,PBS沖洗3次,DAB顯色,蘇木素復染后蒸餾水洗滌,37 ℃恒溫過夜,封片。使用光學顯微鏡觀察各組大鼠結腸組織細胞MLCK、CAM蛋白表達。運用Image-ProPlus軟件采集圖像并定量分析免疫組化結果,以平均光密度值表達,MLCK、CAM陽性染色為棕色或棕黃色。

1.2.6 實時熒光定量PCR檢測結腸組織細胞的MLCK、CAMmRNA表達

取勻漿管,加入1 mL Trizol Reagent,置冰上預冷;取100 mg結腸組織,加入勻漿管中,勻漿儀充分研磨,離心取上清;加入250 μL三氯甲烷,充分混勻靜置,取上清;加入異丙醇混勻,離心,吸除上清;乙醇洗滌沉淀,離心,吸除上清;加水溶解RNA,孵育5 min;Nanodrop 2 000檢測RNA濃度及純度,抽提總RNA。取10 μL RNA溶液,加入1 μL oligo(dT)18,4 μL 5× Reaction Buffer,2 μL 10 mmol/L dNTP Mix,1 μL RiboLock RNAase抑制劑(20 U/μL)和1 μL RevertAi M-MuLV 逆轉錄酶(200 U/μL),進行反轉錄。取0.2 mL PCR管,配制如下反應體系:2× qPCR Mix 12.5μL,7.5 μmol/L基因引物2.0 μL,反轉錄產(chǎn)物2.5 μL,ddH2O 8.0 μL,定量PCR。預變性95 ℃,10 min,循環(huán)95 ℃,15 s→60 ℃,60 s(40次),熔解曲線60 ℃→95 ℃,每15 s升溫0.3 ℃,進行PCR擴增。對結果進行如下處理:采用ΔΔCT法,即2-K計算目的基因的相對表達量,K=［CT(待測樣本,目的基因)-CT(待測樣本,內(nèi)標基因)］-［CT(對照樣本,目的基因)-CT(對照樣本,內(nèi)標基因)］。

1.3 統(tǒng)計學分析

2 結果

2.1 脾虛證大鼠模型構建情況

造模期間每天觀察各組大鼠精神狀態(tài)、毛發(fā)色澤、修飾行為及大便性狀等的變化。結果發(fā)現(xiàn),CON組大鼠精神狀態(tài)良好,行為活躍,反應靈敏,毛發(fā)光澤,大便質(zhì)地正常。造模大鼠第1周開始逐漸出現(xiàn)活動減少、扎堆懶動、大便漸稀等表現(xiàn),第2～3周活動進一步減少,倦怠蜷臥等表現(xiàn)日益明顯,毛色逐漸泛黃、黯淡稀疏無光,食量進一步下降,體質(zhì)量明顯減輕,唇色逐漸變淡,大便稀溏不成形且肛周污穢,提示脾虛證大鼠模型構建成功。

2.2 麩炒蒼術對脾虛證大鼠結腸組織病理學的影響

光鏡觀察各組大鼠結腸組織HE染色后的微觀結構變化。CON組結腸黏膜上皮及固有層基本完整;MOD組結腸黏膜上皮水腫、變性、糜爛、壞死,固有膜結構破壞、崩解,毛細血管充血明顯,潰瘍形成;各治療組結腸黏膜上皮結構不同程度修復,水腫減輕,毛細血管充血不同程度下降,炎性細胞分布范圍不同程度縮小,其中BRA-H組修復效果最為明顯(圖1)。

透射電鏡觀察各組大鼠結腸組織細胞超微結構改變。CON組結腸壁細胞呈橢圓形,胞膜及胞核正常,胞內(nèi)線粒體形態(tài)多數(shù)正常;MOD組結腸上皮細胞壞死腫脹,細胞間隙增寬,胞質(zhì)空泡樣變,胞內(nèi)線粒體數(shù)量明顯下降且結構異常,連接復合體消失,線粒體固縮伴空泡化,嵴斷裂,分泌小管不完整;各治療組結腸組織細胞超微結構不同程度改善,其中BRA-H組修復效果最為明顯,與CON組比較無明顯差別(圖2)。

圖1 麩炒蒼術對脾虛證大鼠結腸組織病理學的影響(HE染色,×200)

圖2 麩炒蒼術對脾虛證大鼠結腸組織細胞超微病理學的影響(×8 000)

2.3 麩炒蒼術對脾虛證大鼠結腸黏膜組織ZO-1、Claudin-1、Claudin-2、Occludin的影響

與CON組比較,MOD組結腸黏膜組織ZO-1、Claudin-1、Occludin的質(zhì)量分數(shù)顯著降低,Claudin-2的質(zhì)量分數(shù)顯著升高 (P<0.01);與MOD組比較,BRA-L、BRA-M、BRA-H及CG組ZO-1、Claudin-1、Occludin的質(zhì)量分數(shù)顯著升高,Claudin-2的質(zhì)量分數(shù)顯著降低(P<0.05,P<0.01);與CG組比較,BRA-H組ZO-1、Claudin-1、Occludin的質(zhì)量分數(shù)顯著升高,Claudin-2的質(zhì)量分數(shù)顯著降低(P<0.05,P<0.01);與BRA-L組比較,BRA-H組ZO-1、Claudin-1、Occludin的質(zhì)量分數(shù)顯著升高,Claudin-2的質(zhì)量分數(shù)顯著降低,且呈量效對應關系(P<0.05,P<0.01,表2)。

表2 麩炒蒼術對脾虛證大鼠結腸黏膜組織ZO-1、Claudin-1、Claudin-2、Occludin質(zhì)量分數(shù)的影響Table 2 Effects of bran-fried Rhizoma Atractylodis on mass fraction of ZO-1,Claudin-1,Claudin-2,and Occludin in colon mucosa of rats with spleen deficiency syndrome

2.4 麩炒蒼術對脾虛證大鼠結腸黏膜組織p-MEK1/2、p-ERK1蛋白分布及表達的影響

與CON組比較,MOD組結腸黏膜組織p-MEK1/2、p-ERK1蛋白分布及表達的熒光強度顯著增強 (P<0.01);與MOD組比較,BRA-L、BRA-M、BRA-H及CG組p-MEK1/2、p-ERK1蛋白分布及表達的熒光強度顯著降低(P<0.05,P<0.01);與CG組比較,BRA-M、BRA-H組p-MEK1/2、p-ERK1熒光強度顯著降低 (P<0.05,P<0.01);與BRA-L組比較,BRA-M、BRA-H組p-MEK1/2、p-ERK1熒光強度顯著降低,且呈量效對應關系(P<0.05,P<0.01,圖3)。

2.5 麩炒蒼術對脾虛證大鼠結腸組織細胞中MLCK、CAM蛋白表達的影響

與CON組比較,MOD組結腸組織MLCK蛋白表達水平顯著升高,CAM蛋白表達顯著降低 (P<0.01);與MOD組比較,BRA-L、BRA-M、BRA-H及CG組MLCK蛋白表達水平顯著降低,CAM蛋白表達水平顯著升高(P<0.05,P<0.01);與CG組比較,BRA-M、BRA-H組MLCK蛋白表達水平顯著降低,CAM蛋白表達水平顯著升高(P<0.05,P<0.01);與BRA-L組比較,BRA-M、BRA-H組MLCK蛋白表達水平顯著降低,CAM蛋白表達水平顯著升高,且呈量效對應關系(P<0.05,P<0.01,圖4)。

A:各組大鼠結腸黏膜組織p-MEK1/2蛋白熒光染色結果(×400);B:各組大鼠結腸黏膜組織p-ERK1蛋白熒光染色結果(×400);C:各組大鼠結腸黏膜組織p-MEK1/2蛋白熒光強度水平各組大鼠結腸黏膜組織p-ERK1蛋白熒光強度水平與CON組比較,P<0.01;2)與MOD組比較,P<0.05;3)與MOD組比較,P<0.01

2.6 麩炒蒼術對脾虛證大鼠結腸組織中MLCK、CAM mRNA表達的影響

與CON組比較,MOD組結腸組織中MLCKmRNA表達顯著升高,CAMmRNA表達顯著降低(P<0.05,P<0.01);與MOD組比較,BRA-L、BRA-M、BRA-H及CG組MLCKmRNA表達顯著降低,CAMmRNA表達顯著升高(P<0.05,P<0.01);與CG組比較,BRA-H組MLCKmRNA表達顯著降低,CAMmRNA表達顯著升高(P<0.05,P<0.01);與BRA-L組比較,BRA-M、BRA-H組MLCKmRNA表達顯著降低,CAMmRNA表達顯著升高,且呈量效對應關系(P<0.05,P<0.01,表3)。

A:各組大鼠結腸組織CAM免疫組化染色結果(×400);B:各組大鼠結腸組織MLCK免疫組化染色結果(×400);C:各組大鼠結腸組織CAM蛋白平均光密度值各組大鼠結腸組織MLCK蛋白平均光密度值與CON組比較,P<0.01;2)與MOD組比較,P<0.05;3)與MOD組比較,P<0.01

表3 麩炒蒼術對脾虛證大鼠結腸組織中MLCK、CAM mRNA表達的影響Table 3 The effects of bran-fried Rhizoma Atractylodis on MLCK and CAM mRNA expression in colon tissue of rats with spleen deficiency syndrome

3 討論

脾虛證為臨床常見中醫(yī)證候,常表現(xiàn)出全身性病理狀態(tài),其動物模型制備一直備受關注,目前一般認為多因素復合造模方法更接近臨床實際情況［6］。中醫(yī)認為,苦寒傷中、情志失調(diào)和飲食失節(jié)易致脾虛［7］。本研究采用慢性束縛、苦寒破氣加饑飽失常復合造模方法構建脾虛證大鼠模型。結果發(fā)現(xiàn),脾虛證模型大鼠結腸病理情況明顯異常,光鏡下黏膜上皮水腫、變性、糜爛、壞死;透射電鏡下上皮細胞壞死腫脹、細胞間隙增寬,與正常大鼠比較差異明顯,說明了上述脾虛證造模方法的科學性。

蒼術為菊科植物北或茅蒼術的干燥根莖,味甘、苦,性溫,歸脾、腎、肝經(jīng),具燥濕健脾、祛風散寒、明目之功效。從炮制作用看,生品辛溫苦燥,麩炒可緩和燥性使其氣變芳香,增加健脾燥濕作用［8］。研究表明,蒼術具有健胃的作用,其丙酮提取物、β-桉葉醇和茅蒼術醇對豚鼠回腸卡巴膽堿收縮呈明顯的對抗作用［9］。此外,蒼術的正丁醇萃取物對醋酸型、酒精型、幽門結扎型及吲哚美辛型胃潰瘍均有明顯的抑制作用,其作用機理可能與增多胃內(nèi)PGE2含量,促進DNA、RNA及蛋白質(zhì)的合成和改善潰瘍病灶血循環(huán)相關［10］。亦有研究表明,麩炒蒼術增效的機理可能與蒼術麩炒后對腸道菌群和機體代謝的調(diào)節(jié)作用增強及白術內(nèi)酯Ⅰ含量增加有關［11］。本研究結果顯示,光鏡下,各治療組結腸黏膜上皮被破壞的結構有不同程度修復,透射電鏡下,各治療組結腸組織細胞超微結構不同程度改善,其中尤以麩炒蒼術高劑量組改善最為顯著,表明麩炒蒼術可較好地修復脾虛證大鼠受損的腸黏膜。

腸黏膜屏障由機械、化學、免疫、生物等屏障構成,其中腸黏膜上皮細胞間的緊密連接蛋白是腸黏膜機械屏障的主要結構,其組成包括Occludin、Claudins、JAM-A等跨膜蛋白和MAGI1、ZO-1等支架蛋白［12-13］。Claudins作為主要骨架蛋白支撐緊密連接形成致密的復合體,保持腸黏膜防御屏障的完整性［14-15］。Claudin-1屬于閉鎖蛋白,可防止腸黏膜液體流失及大分子彌散,保持腸上皮穩(wěn)態(tài)［16］。Occludin也屬于跨膜閉合骨架蛋白,對腸黏膜緊密連接有一定影響［17］。ZO-1是緊密連接的支架蛋白,具有橋梁蛋白的作用,與Occludin、Claudin-1結合,可使后兩者與腸黏膜細胞的骨架緊密結合［18］。Claudin-2在漏孔上皮中高表達,是一種孔道形成蛋白,可通過調(diào)節(jié)內(nèi)皮及上皮細胞的通透機制達到調(diào)節(jié)腸屏障功能的作用［19］。本研究發(fā)現(xiàn),脾虛證模型大鼠結腸組織中Claudin-1、ZO-1、Occludin表達水平明顯下降,Claudin-2表達水平明顯升高;麩炒蒼術干預后,ZO-1、Claudin-1、Occludin表達水平上調(diào),同時Claudin-2表達水平下降,其中尤以麩炒蒼術高劑量組變化最為明顯,表明麩炒蒼術可通過上調(diào)結腸緊密連接相關蛋白,下調(diào)Claudin-2的表達水平,雙相有機調(diào)節(jié)腸道間緊密連接相關蛋白,降低結腸細胞通透性,修復受損腸黏膜。

MEK是分裂原活化抑制劑,其主要作用是抑制MAP激酶［20］。ERK為蛋白激酶,是將信號從表面受體傳導至細胞核的關鍵,磷酸化激活的ERKl/2由胞質(zhì)轉位到核內(nèi),進而介導NF-κB、Ap-1、c-fos等的轉錄活化,參與細胞增殖、分化、細胞形態(tài)維持、細胞骨架構建、細胞凋亡和細胞惡變等多種生物學反應［21］。CAM-MLCK通路對平滑肌細胞收縮具有調(diào)節(jié)作用,可調(diào)節(jié)結腸平滑肌的信號傳導,許多細胞內(nèi)生理過程都有CAM的參與［22］。MLCK是一種蛋白激酶,與腸黏膜屏障的損傷和修復均有密切關系,研究已表明下調(diào)MLCK磷酸化可修復受損的腸黏膜［23］。MEK/ERK信號級聯(lián)通路對MLCK的磷酸化具有調(diào)控作用,可通過激活MLCK,收縮內(nèi)皮細胞,增大細胞間隙促進受損腸黏膜的修復［24］。本研究發(fā)現(xiàn),與正常組比較,脾虛證模型大鼠結腸組織CAM蛋白和基因表達下降,MEK/ERK/MLCK信號通路被激活;p-MEK1/2、p-ERK1蛋白分布及表達、MLCK蛋白和基因表達明顯升高。研究結果提示,麩炒蒼術可通過上調(diào)CAM蛋白和基因表達,降低內(nèi)臟高敏感性,抑制腸道平滑肌細胞收縮,調(diào)節(jié)正常胃腸激素分泌,促進胃腸平滑肌蠕動,并調(diào)控相關胃腸激素及抑炎或促炎因子分泌。此外,麩炒蒼術還可抑制MEK/ERK/MLCK信號通路活化并進一步提升細胞修復能力,增強腸上皮細胞屏障,降低脾虛證大鼠結腸黏膜炎癥水平,保護結腸上皮,改善脾虛證模型大鼠結腸組織細胞的病理狀態(tài),進而調(diào)控相關胃腸激素及抑炎或促炎因子分泌。

作者貢獻聲明

謝慧臣:提出研究思路和框架,設計實驗,統(tǒng)計分析數(shù)據(jù),實施動物實驗,撰寫及修改論文;冉云:提出研究思路和框架,設計實驗,統(tǒng)計分析數(shù)據(jù);張云、歐陽瑜:提供研究方向與論文修改建議;唐浪、吳廣陽:參與動物實驗。

利益沖突聲明

本研究未受到企業(yè)、公司等第三方資助,不存在潛在利益沖突。