黑色素瘤細胞外泌體通過Prospero同源異形盒蛋白1調控腫瘤淋巴轉移機制的研究

曹宸，楊瑩，孫秋悅，嚴志新，楊細虎

黑色素瘤（melanoma，MM）是常見的軟組織惡性腫瘤，近年來發(fā)病率不斷上升［1-2］。皮膚黑色素瘤惡性程度高，早期易發(fā)生擴散和轉移。當前治療手段仍然有限，臨床上常采用手術切除、放療、化療和一些姑息性治療等常規(guī)治療方式，但存在預后差等問題。隨著皮膚黑色素瘤的免疫治療、靶向治療［3］等方法取得顯著進展，病人的預后有了一定的改善，但腫瘤過早發(fā)生淋巴轉移及生存率低等問題依舊沒有得到有效的解決。此外，由于皮膚黑色素瘤的異質性和分子水平上的個體差異，仍有部分病人存在抗腫瘤藥物無效、腫瘤細胞耐藥以及腫瘤靶向治療費用偏高等問題［4］，因此繼續(xù)探索其他有效的治療方案在臨床上具有重要意義。

近年來，多種研究表明淋巴管再生在腫瘤的增殖和進展中起著非常重要的作用［5-6］。隨著淋巴管內皮細胞特異性標志物平足蛋白（podoplanin）、淋巴管內皮細胞透明質酸受體-1（lymphatic vessel endo?thelial hyaluronic acid receptor-1，LYVE-1）及血管內皮生長因子受體3（VEGFR-3）等蛋白的發(fā)現，淋巴管再生在腫瘤進展和轉移中的重要作用日益明朗［7-10］。研究表明淋巴管轉移是皮膚黑色素瘤的主要轉移方式［11-12］，黑色素瘤癌巢及間質中的淋巴管新生是腫瘤轉移的前提。因此，通過抑制瘤體內及腫瘤周圍的淋巴管新生，減少瘤體內和腫瘤周圍的淋巴管數量，理論上可以推遲、延緩腫瘤經淋巴管轉移，從而延長病人的生存時間?，F有證據表明，黑色素瘤細胞與其所在微環(huán)境中的其他細胞及細胞間產物相互作用，導致了淋巴管的新生及腫瘤轉移［13］，其中涉及到復雜的細胞間信號傳遞。然而，黑色素瘤如何調控淋巴管新生及其如何通過淋巴管轉移的機制仍不清楚［14-15］。

在腫瘤的進展和轉移中，誘導腫瘤旁間質生成新的淋巴管是極為重要的一步。最新的文獻報道，一種被稱作為外泌體的細胞外囊泡可通過介導細胞間信號傳遞來影響腫瘤的轉移。這些外泌體內包含的信號因子可調節(jié)受體細胞的增殖、分化、免疫功能等生理活動。這些外泌體被腫瘤細胞釋放在細胞質中，通過細胞的胞吞、胞吐和受體介導及彌散等一系列的方式作用于靶細胞發(fā)揮其重要功能。

Prox-1 是淋巴管生成的關鍵性調控因子［16］。該信號不僅參與淋巴管的再生及塑形過程，也參與調控腫瘤淋巴轉移的過程［17］。已有文獻報道Prox-1及其下游信號叉頭框C2 蛋白（FoxC2）、磷酸化蛋白激酶B（p-Akt）等參與消化道腫瘤、子宮內膜癌及宮頸癌的淋巴轉移［18-20］，但在黑色素瘤淋巴轉移中未見相關報道。因此，本研究提出黑色素瘤外泌體攜帶的Prox-1 在調控淋巴管內皮細胞增殖、遷移以及生成具有轉移腫瘤細胞功能的病理性淋巴管過程中具有重要作用。

1 資料與方法

1.1 細胞實驗材料DMEM 培養(yǎng)基、胎牛血清、胰蛋白酶（Gibco，美國）；A375 人源黑色素瘤細胞系（中國科學院上海細胞所，中國）；LECs 淋巴管內皮細胞（中國科學院上海細胞所，中國）；磷酸鹽緩沖液（Biofroxx，德國）；BCA 蛋白定量試劑盒、辣根過氧化物酶標記的山羊抗兔IgG 和HRP 標記山羊抗小鼠IgG（H+L）（碧云天生物有限公司，中國）；RQT100 羊抗鼠/兔IgG 聚合物（即用型）、GADPH 抗體、Prox-1 抗體、p-Akt 抗體、FoxC2 抗體（Abcam，美國）；外泌體試劑盒（南京森貝伽生物科技有限公司，中國）；二氧化碳細胞培養(yǎng)箱（Sanyo，日本）；多功能酶標儀（BioTek，美國）；化學發(fā)光成像儀（Tan?non，中國）。

1.2 一般資料樣本選自2015 年9 月至2021 年4月在江蘇大學附屬醫(yī)院收治的32 例原發(fā)性黑色素瘤病人。篩選條件：①病人行黑色素瘤切除手術；②腫瘤原發(fā)灶蠟塊保存完整；③病歷資料及臨床病理材料完整。共選取32 例病人，其中：男性18 例，女性14 例。年齡范圍40～90 歲。32 例病人病理學顯示：癌癥早期病人（Ⅰ期和Ⅱ期）8 例，癌癥晚期病人（Ⅲ期和Ⅳ期）24 例；有淋巴結轉移者16 例，未發(fā)生淋巴結轉移者16 例。選取2 例正常皮膚組織的臨床病理資料作為對照。本研究獲得江蘇大學附屬醫(yī)院倫理委員會批準（批號KY2022K120 5），病人及近親屬對研究方案了解并簽署知情同意書。

1.3 免疫組化試劑兔抗人Prox-1 單抗（即用型）、兔抗人LYVE-1 單抗（即用型）、RQT100 羊抗鼠/兔IgG聚合物（即用型）、DAB顯色液。

1.4 方法

1.4.1 細胞培養(yǎng)人淋巴管內皮細胞（LECs），于內皮細胞培養(yǎng)基（EGM-2；Cambrex）中培養(yǎng)。A375 黑色素瘤細胞購自中國科學院上海細胞所，于DMEM中培養(yǎng)。所有細胞均保持在37 ℃，5%二氧化碳條件下。DMEM 中添加10%FBS。所有的給藥實驗均為細胞穩(wěn)定傳代3代以上。

1.4.2 Prox-1 的慢病毒敲除根據吉凱基因慢病毒使用說明手冊，設置梯度MOI 進行預實驗。實驗結果表明本次感染采用MOI 為50。接種105個細胞于6 孔板中，分別加入以下病毒：shProx-1、GFP 50×105TUI 病毒。按上述方法感染細胞，24 h 后更換為完全培養(yǎng)基。于恒溫培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)，顯微鏡下觀察細胞密度至80%~90%時，提取蛋白或傳代至培養(yǎng)瓶中。采用免疫熒光法檢驗轉染效率。制備Prox-1修飾的MM-ex和MM-exshProx-1，將轉染慢病毒的MM 在無血清培養(yǎng)基中培養(yǎng)72 h，分離出MM-ex/MM-exshProx-1用于進一步研究。

1.4.3 外泌體鑒定

1.4.3.1透射電子顯微鏡法 通過透射電子顯微鏡（FEI Tecnai 12，飛利浦，荷蘭）分析MM-ex 的形態(tài)和大小。將10 μL 的黑色素瘤在涂有甲醛/碳的銅網格上，吸附10 min，用10 μL 的1%磷酸在25 ℃下染色5 min，并用透射電子顯微鏡檢查。透射電鏡得到了揚州大學檢測中心的技術支持。

1.4.3.2原子力顯微鏡成像 對MM-ex進行原子力顯微鏡（AFM）成像。將0.25 g MSC-ex 溶解于10μL PBS 中，沉積在云母片上。在室溫干燥后，采用多模式第八代SPM（德國布魯克）掃描樣品，并使用納米顯微鏡進行分析。

1.4.3.3納米光追蹤分析 通過納米光追蹤分析（NTA）測量MM-ex的數量和大小分布。將MM-ex在PBS中稀釋，并注射到LM10裝置的樣品室中。每個樣本記錄30 s或60 s，使用納米NTA 3.1軟件對視頻進行分析。根據總量和稀釋因子計算相對濃度。

1.4.4 細胞遷移、增殖

1.4.4.1細胞增殖 采用CCK-8 試驗評估淋巴管內皮細胞增殖。96 孔板中以每孔103個細胞的密度接種細胞，于恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過夜。吸棄培養(yǎng)基后，采取PBS（n=5）、MM-ex（50 或100 μg/孔，n=5）處理LECs 48 h。采用PBS 制備陰性對照。類似地，將MM-exshProx-1（每孔50 μg，n=5）處理36 h。加入WST-8，測定細胞增殖（450 nm）。

1.4.4.2細胞遷移 采用Transwell 實驗觀察MM-ex轉運的Prox-1 對LECs 遷移的影響。實驗分三組：PBS 組、MM-ex 組、MM-exshProx-1組（外泌體溶解在PBS中）。選取外泌體的使用劑量為50 mg/L。細胞接種培養(yǎng)方法同細胞增殖實驗。六孔或十二孔細胞培養(yǎng)板配套的8 μm 孔徑細胞培養(yǎng)池纖維連接蛋白鋪底（40 mg/L）干燥，置入六孔細胞培養(yǎng)板，接種細胞，并按分組加入不同的等容積的刺激因子，置于37 ℃，5%二氧化碳條件下培養(yǎng)16 h 后取出細胞培養(yǎng)池行Giemsa 染色：PBS 浸洗細胞培養(yǎng)池1 min×3次，甲醇固定20 min，自然干燥，用Giemsa 染液染色10 min，蒸餾水浸洗。在倒置相差顯微鏡下每個細胞培養(yǎng)池隨機選取5個高倍視野，計數膜上、下的細胞，以及遷移到膜下的細胞數除以膜上下細胞總數計算細胞的遷移率。

1.5 蛋白質印跡法檢測黑色素相關蛋白表達選取生長對數期的細胞進行處理。裂解細胞并提取細胞總蛋白質，總蛋白質（40 μg）在SDS-PAGE 凝膠上分離，使用電泳轉移系統(tǒng)（Bio-Rad，USA）轉移到硝酸纖維素濾膜上。將膜在常溫下用含有5%脫脂奶粉的TBST 封閉1.5 h。4 ℃下與抗體一起孵育過夜。二抗在常溫下孵育1 h。通過增強化學發(fā)光顯現，檢查特征蛋白表達及其下游信號通路激活情況。

1.6 免疫熒光染色實驗分三組：PBS 組、MM-ex組、MM-exshProx-1組（外泌體溶解在PBS 中）。每組各24 個培養(yǎng)孔。外泌體使用劑量為50 mg/L。細胞傳代時，換用1%BSA 的EGM-2-MV 培養(yǎng)基及上述分組不同的等容積的刺激因子，LECs 培養(yǎng)2～3 代后細胞爬片，用PBS沖洗后，用4%多聚甲醛固定10 min，PBS 漂洗3 次，分別滴加兔抗小鼠一抗Prox-1、CD9、VEGFR-3、抗體滴度為1∶500。置濕盒內4 ℃冰箱孵育過夜。PBS漂洗3次，滴加羊抗兔FITC 或PE 熒光二抗，置濕盒內37 ℃孵育30 min，PBS 漂洗3 次，蒸餾水漂洗2 次，熒光顯微鏡下檢測染色結果，用Hoechst進行細胞核襯染照相。

吸棄細胞培養(yǎng)基，PBS 洗滌兩次，4%PFA 室溫固定。PBS洗滌一次，0.1%Triton通透工作液室溫通透10 min。吸棄Triton 通透工作液，5%BSA 室溫封閉60 min。加一抗，2～8 ℃孵育過夜。PBS洗滌后，DAPI封片染核，室溫避光孵育5 min，使用熒光共聚顯微鏡觀察

1.7 免疫組化染色所取全部標本中Prox-1、LYVE-1的水平選用免疫組化法進行檢測。具體步驟如下：選用4%中性甲醛溶液（NBF）固定（25 ℃，24 h），以乙二胺四乙酸二鈉（EDTA），0.1 mol，（pH 8.0）為抗原修復液對抗原組織進行修復。修復時間為噴氣計時2 min 30 s，使用3%雙氧水滅活。Prox-1、LYVE-1一抗均采用PBS依據說明書進行稀釋，于4 ℃條件下孵育過夜。二抗選擇RQT100羊抗鼠/兔IgG聚合物（即用型），于25 ℃條件下孵育20 min，選用DAB顯色液，顯色5 min。蘇木精復染30 s，脫水，中性樹脂封片。用共聚焦激光掃描顯微鏡檢測載玻片。

1.8 免疫組化結果判定使用MLVD 計數法表示LYVE-1，計數方式為［21］：在顯微鏡下對淋巴管進行觀察，單個淋巴管為單個內皮細胞或細胞簇，呈棕黃色。在低倍鏡（40 倍鏡）視野下選擇淋巴管高密度區(qū)，然后在高倍鏡（200倍鏡）視野下隨機選擇5個視野內淋巴管進行計數，計數結果計算平均值。Prox-1主要為胞核染色。使用低倍鏡（40倍鏡）觀察全片，確定腫瘤浸潤的組織邊緣，然后選擇5個高倍鏡（400 倍鏡）視野下的細胞對其染色強度及所占百分比進行綜合評分。染色強度判分標準：細胞未著色為0 分（-）、淺黃色為1 分（+）、棕黃色為2 分（++）、棕褐色為3 分（+++）。陽性細胞所占百分比判分標準［22］：陽性細胞<1%為0 分；1%～10%為1分、10%～30%為2 分；30%～60%為3 分；>60%為4分。以細胞染色強度與陽性細胞所占百分比評分之和作為染色結果的判定，陰性或低表達：0～3 分；高表達：≥4 分。0～3 分為低表達組，≥4 分為高表達組。見圖1。

圖1 Prospero同源異形盒蛋白1（Prox-1）、淋巴管內皮細胞透明質酸受體-1（LYVE-1）在黑色瘤切除標本的皮膚組織中的表達：1A為正常皮膚組織組織中Prox-1陰性表達（IHC染色×100）；1B為LYVE-1在黑色素瘤淋巴管中陽性表達，用微淋巴管密度表示（IHC染色×400）;1C為Prox-1陰性染色（?）（IHC染色×400）；1D為Prox-1弱陽性染色（+）（IHC染色×400）；1E為Prox-1中陽性染色（++）（IHC染色×400）；1F為Prox-1強陽性染色（+++）（IHC染色×400） 圖2 逆轉錄病毒感染黑色素瘤細胞圖（免疫熒光顯色法×4） 圖5 黑色素瘤外泌體粒徑表征 圖6 黑色素瘤細胞體外培養(yǎng)對淋巴管內皮細胞淋巴管生成有劑量依賴性影響：6A為免疫熒光法觀察外泌體與LECs細胞共培養(yǎng)36 h的影響（免疫熒光染色法×100）；6B為驗證MM-ex/MM-exshProx-1對LECs遷移的影響（Transwell法×10）；6C為LECs在MM-ex/MM-exshProx-1的作用下，淋巴管標志物VEGFR-3的熒光表達（免疫熒光染色法×20） 圖9 人來源的CD9陽性MM-ex/MM-exshProx-1定位于LECs的細胞質中（免疫熒光染色法×20）

1.9 統(tǒng)計學方法本研究的數據采用SPSS 進行檢驗，P<0.05 表明數據間的差異有統(tǒng)計學意義。應用費希爾精確檢驗方法檢驗Prox-1 的表達高低與病人臨床病理特征的關系。應用MLVD 表示LYVE-1的表達水平，探究MLVD 值與病人臨床病理特征的關系，兩組樣本間比較符合正態(tài)分布且方差齊者采用兩獨立樣本t檢驗，若不符則采用秩和檢驗。三組樣本間比較先進行方差齊性檢驗，方差齊且符合正態(tài)分布采用單因素方差分析，反之則采用Krus?kal-WallisH檢驗。Prox-1 和LYVE-1 的表達的相關性采用Pearson 相關分析。檢驗標準α=0.05。

2 結果

2.1 黑色素瘤外泌體敲減Prox-1 基因如圖1 所示，我們用逆轉錄病毒感染黑色素瘤細胞（圖2）敲減Prox-1 基因，得到不含有Prox-1 基因的黑色素瘤外泌體（圖3）。采用試劑盒法提取兩種外泌體：MM-ex、MM-exshProx-1。

圖3 黑色素瘤外泌體慢病毒敲減后提取出不含Prox-1信號的外泌體

2.2 黑色素瘤外泌體表征對黑色素瘤外泌體進行表征如圖4 所示，蛋白質印跡法結果證實了外泌體標記CD9、CD63和腫瘤易感基因101（TSG 101）在MM-ex 中的表達。與黑色素瘤相比，上述蛋白在黑色素瘤外泌體中的表達明顯增高（圖4A）。透射電子顯微鏡（TEM）和原子力顯微鏡（AFM）顯示MM-ex的球體形狀（圖4B）。采用納米粒子跟蹤分析（NTA），表明所得MM-ex 的平均粒徑約為130 nm（圖5）。

圖4 黑色素瘤外泌體表征：A為外泌體標記CD9、CD63和TSG101在MM、MM-ex中的表達；B為外泌體電鏡表征

2.3 黑色素瘤外泌體對淋巴管內皮細胞淋巴管生成的影響為了探究MM-ex 是否對淋巴管生成產生直接影響，將LECs 與所得外泌體共同孵育36 h。共聚焦成像結果顯示，標記的MM-ex 在孵育12 h 后主要位于細胞質和細胞核周圍，且數量隨著時間的推移而增加（圖6）。為探討MM-ex 對淋巴管內皮細胞淋巴管生成的影響，將LECs 與不同劑量的MMex、MM-exshProx-1共同孵育24 h。結果表明，MM-ex 以劑量依賴性方式促進淋巴管內皮細胞增殖（圖7）、遷移（圖6）。MM-exshProx-1對淋巴管內皮細胞的增殖及遷移無明顯影響。LECs在MM-ex的作用下，標志物VEGFR-3 表達明顯升高，提示LECs 增生活躍（圖6），MM-exshProx-1作用的LECs 卻沒有。這些結果表明，含Prox-1 的MM-ex 可以劑量依賴性促進淋巴管內皮細胞生成淋巴管。

圖7 CCK8法驗證MM-ex/MM-exshProx-1對淋巴管內皮細胞淋巴管增殖影響：A為加入50 μg和100 μg的MM-exshprox-1與加入pbs組 對lec增殖情況的影響；B為加入50 μg的MM-ex與pbs組對lec增殖情況的影響；C為加入100 μg的MM-ex與pbs組對lec增殖情況的影響

2.4 黑色素瘤外泌體參與調控淋巴管生成的機制為從機制上探討MM-ex 促進淋巴管內皮細胞的增殖和遷移，在MM-ex 和MM-exshProx-1作用于LECs的第12、24、36 h 評估淋巴管生成基因的表達（圖8）。研究發(fā)現，經MM-ex 預處理LECs 后，FoxC2、Prox-1、p-Akt 的表達隨著時間的推移而顯著增加至12 h 后逐漸衰減。經MM-exshProx-1預處理LEC 后，FoxC2、Prox-1、p-Akt 隨著時間的表達變化量不明顯。免疫熒光染色證實人來源的CD9 陽性MM-ex、MM-exshProx-1可以定位于LECs 的細胞質中（圖9）。

圖8 作用于LECs的第12、24、36 h評估淋巴管生成基因的表達：A為黑色素瘤外泌體（MM-ex）；B為低表達Prox-1的黑色素瘤外泌體（MM-exshProx-1）

2.5 Prox-1 表達、MLVD 值與黑色素瘤臨床病理特征的關系2 例正常皮膚組織組織中Prox-1 表達為陰性。Prox-1 在黑色素瘤中主要染色部位在胞核。32 例黑色素瘤病理中，Prox-1 高表達率為62.5%，有淋巴結轉移組高表達率為87.50%，表達率顯著高于無淋巴結轉移組37.50%（P<0.05）；癌癥晚期組Prox-1 高表達率為79.17%，顯著高于癌癥早期組12.50%（P<0.05）；長徑小于5 cm 的腫瘤Prox-1 高表達率為38.46%，而長徑大于5 cm 的Prox-1 高表達率為78.94%（P<0.05）。性別和年齡因素對黑色素瘤組織中Prox-1 表達水平影響無統(tǒng)計學意義（P>0.05）。

黑色素瘤標本中的淋巴管內皮細胞經免疫組化LYVE-1 抗體染色后呈現為棕黃色，32 例黑色素瘤MLVD 均值為7.48±3.91。性別、年齡和腫瘤長徑對黑色素瘤組織中MLVD 值差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05），黑色素瘤有淋巴結轉移組和癌癥晚期組的MLVD 值分別高于無淋巴結轉移組、癌癥早期組，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。具體情況見表1。

表1 黑色素瘤組織32例中Prospero同源異形盒蛋白1（Prox-1）表達、微淋巴管密度（MLVD）值與其臨床病理特征的關系

2.6 Prox-1 表達水平與MLVD 的相關性32 例黑色素瘤組織中，Prox-1高表達組MLVD 為8.88±4.20，低表達組MLVD 為5.15±1.72（r=0.47，P=0.007）。Pearson 相關分析顯示，Prox-1 表達情況與MLVD 值呈相關性，即Prox-1 高表達組的MLVD 值高于Prox-1低表達組的MLVD值。

3 討論

黑色素瘤是臨床常見惡性腫瘤，發(fā)病率逐年上升，預后差，且治療方式有限。特別是在癌癥晚期且有腫瘤淋巴結遠處轉移的病人5 年生存率仍然低至5%~10%［23-25］。因此，腫瘤的早發(fā)現和早治療是提升病人生存率的關鍵?，F階段，監(jiān)測腫瘤淋巴結轉移仍具有一定的挑戰(zhàn)性。本研究旨在腫瘤淋巴管的形成中探索和發(fā)現腫瘤淋巴結的轉移途徑。當前，各類皮膚腫瘤的外泌體已成為學者們研究的方向，為確定外泌體對腫瘤轉移機制的影響及預后指標提供新的方向。本研究主要探究MM-ex 在腫瘤瘤體及周圍間質的刺激對生成新生淋巴管的影響，結果表明MM-ex 促進淋巴管內皮細胞增殖及遷移，促進VEGFR-3、LYVE-1 陽性淋巴管的生成。

黑色素瘤的進展與淋巴管的誘導成形密切相關。大量文獻報道及研究僅關于黑色素瘤血管生成及轉移的機制，關于淋巴管轉移轉移機制尚不明確。現階段已有研究表明Prox-1、FoxC2［26］、LYVE-1、VEGFR-3［27-29］等淋巴管生成的標志物已在黑色素瘤病人中被確立。迄今為止分析的所有標志物并未將淋巴管生成與黑色素瘤的轉移相聯系作為一個新的預后判斷指標。也有文獻報道Prox-1 調控LECs 的增殖及遷移和淋巴管的成熟，Prox-1 及其下游因子FoxC2 促進淋巴管瓣膜及淋巴管壁的形成［30］。Prox-1 已在宮頸癌、胃癌中被證實與腫瘤轉移相關。Prox-1在腫瘤細胞中作為淋巴管生成的起始因子，可使其成為監(jiān)測和治療的一個強有力的靶點。且MM-ex 由腫瘤細胞自分泌產生，表明此種細胞間遞質可在胞質中進行監(jiān)測。

本研究分析了黑色素瘤細胞分泌的MM-ex 對腫瘤淋巴管生成的影響。為了驗證這一假說，我們進行了Prox-1介導功能的缺失實驗。這些實驗證明Prox-1敲減后的外泌體顯著降低了腫瘤周圍淋巴管的生成，減少了LECs 的增殖和遷移，從而有效的減緩了腫瘤的轉移。

實驗結果表明：腫瘤細胞產生的MM-ex 中Prox-1可激活Akt信號途徑，促進腫瘤間質中淋巴管內皮細胞形成新生淋巴管，同時促進淋巴管生成因子受體VEGFR-3 的表達上調。因此腫瘤影響了正常組織淋巴管生成受體信號的表達和識別。由此支持了一種新興學說：腫瘤細胞利用內皮細胞的淋巴管生成信號系統(tǒng)（即遷移、侵襲和增殖調節(jié)信號系統(tǒng)）來支持與腫瘤細胞自身進展相關的侵襲和轉移機制［31］。

本研究發(fā)現黑色素瘤病人癌巢及癌周組織中，Prox-1、LYVE-1 表達水平明顯高于正常皮膚組織。同時，Prox-1、LYVE-1 表達水平與病人的腫瘤負荷程度、疾病的分期和病人的生存率相關。與正常皮膚相比，黑色素瘤病人標本中心灶Prox-1 有顯著差異，Ⅲ期和Ⅳ期黑色素瘤病人癌巢中心及周圍間質，Prox-1、LYVE-1 的表達明顯高于Ⅰ期和Ⅱ期黑色素瘤病人。這使得病理切片及免疫組化可更高效地監(jiān)測腫瘤的進展。

基于以上結果，可推測Prox-1 不僅是腫瘤進展和轉移的標志，在功能上也參與了黑色素瘤的轉移，由此進一步推測腫瘤分泌含有Prox-1 的外泌體在此間發(fā)揮了重要作用。為進一步驗證假說，我們對腫瘤樣本及人源的黑色素瘤A375 細胞系中分泌的含有Prox-1的外泌體進行了詳細研究。實驗證實了外泌體被腫瘤細胞釋放后被間質中相關的內皮細胞所吸收，在信號傳遞中發(fā)揮了重要作用。因此相關內皮細胞胞質間高表達的Prox-1對監(jiān)測Ⅲ期及Ⅳ期腫瘤有顯著貢獻。

因此，本研究認為Prox-1 是黑色素瘤進展的一個新的標志物，也可通過病理切片的染色判斷病人的預后。這項關于黑色素瘤外泌體Prox-1的研究具有廣闊前景，值得在更多的Ⅰ~Ⅳ期黑色素瘤病人中作出進一步的分析。此外，外泌體作為一種新興的細胞間傳遞因子并結合黑色素瘤自分泌外泌體的特性，使通過針對外泌體來治療人類黑色素瘤成為了一個新的趨勢。目前，人們正努力生成Prox-1及外泌體的新抑制劑以治療和干擾腫瘤淋巴轉移。本研究數據有力地提供和證明黑色素瘤分泌的含有Prox-1 的外泌體促進了腫瘤淋巴轉移的新途徑。并且提供了一個新的轉移監(jiān)測靶點，貢獻一個治療黑色素瘤的新策略。