金絲桃苷通過調(diào)控微RNA-125a-5p/信號傳導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄激活因子3軸減輕腦缺血/再灌注損傷

夏麗秀，尹霞，肖瑞

腦組織供血不足時，快速再灌注是治療腦缺血的一項(xiàng)有效方法，但該治療方法也被證實(shí)會進(jìn)一步引起腦缺血/再灌注（I/R）損傷，導(dǎo)致急性壞死、細(xì)胞凋亡［1-3］。目前臨床上并無預(yù)防神經(jīng)功能受損的有效治療手段，因此了解其潛在的機(jī)制并積極尋找新的治療方法十分重要。

金絲桃苷，又名槲皮素-3-O-β-D-吡喃半乳糖苷，是一種從天然紅柳木中提取的黃酮類化合物，廣泛存在于薔薇科植物中［4］。其已被證明具有抗氧化、抗炎、抗癌等保護(hù)作用［5］。此外，金絲桃苷也被證實(shí)能夠保護(hù)大腦皮層神經(jīng)元免受缺氧、缺糖導(dǎo)致的再灌注損傷［6-7］。

許多miRNAs 被證實(shí)參與了缺血性腦損傷的多個環(huán)節(jié)，并逐漸成為缺血性腦損傷治療的新靶標(biāo)［8］。有研究顯示抑制肌醇依賴性激酶1α 能夠通過miR-125/ NLR 家族Pyrin 域蛋白1（NLRP1）/胱天蛋白酶1（caspase-1）信號通路減輕缺氧缺血后神經(jīng)元焦亡，減少梗死體積，改善神經(jīng)行為結(jié)果，提高miR-125的表達(dá)可能是避免缺氧缺血腦損傷的重要靶點(diǎn)［9］。信號傳導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄激活因子3 （STAT3）編碼的蛋白質(zhì)是STAT家族的重要成員，有研究發(fā)現(xiàn)STAT3過表達(dá)能夠加重大腦中動脈閉塞（MCAO）所致的I/R 損傷，進(jìn)一步促進(jìn)大鼠的神經(jīng)功能障礙［10］。另外也有研究證實(shí)miR-124能夠通過抑制STAT3信號通路，進(jìn)而減少I/R 神經(jīng)細(xì)胞焦亡、發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用［11］。Tian 等［12］在關(guān)于皮膚鱗癌的研究中證實(shí)了miR-125b能夠通過靶向STAT3進(jìn)而發(fā)揮抗腫瘤作用。此外，miR-125也被證實(shí)能夠靶向STAT3進(jìn)而在高糖誘導(dǎo)的糖尿病視網(wǎng)膜病變中發(fā)揮保護(hù)作用［13］。盡管miR-125/STAT3作用軸已被證實(shí)在多種其他疾病中發(fā)揮作用，但是該作用軸是否影響I/R的進(jìn)展仍有待進(jìn)一步探討。

本研究于2021 年6 月至2022 年1 月開展，旨在探究金絲桃苷/miR-125a-5p/STAT3 在I/R 損傷中的作用和機(jī)制，為分子靶向技術(shù)治療I/R 損傷提供一定的理論基礎(chǔ)和數(shù)據(jù)支持。

1 材料與方法

1.1 藥品與試劑30 只SPF 級SD 大鼠（6~7 周齡）購自廣東省實(shí)驗(yàn)動物中心［實(shí)驗(yàn)動物生產(chǎn)許可證號SCXK（粵）2018-0002］；大鼠PC12 細(xì)胞購自北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院；Hyperin 購自美國Sigma；乳酸脫氫酶（LDH）和超氧化物歧化酶（SOD）測定試劑盒購自上海碧云天生物科技有限公司；雙螢光素酶分析報告系統(tǒng)購自翌圣生物；腫瘤壞死因子-α（TNF-α）酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）試劑盒、白細(xì)胞介素-6（IL-6）ELISA 試劑盒、放射免疫沉淀測定（RIPA）裂解液、二喹啉甲酸（Bicinchoninic acid，BCA）試劑盒、2，3，5-氯化三苯基四氮唑（TTC）染色試劑盒均購自北京索萊寶生物科技有限公司；轉(zhuǎn)染試劑Lipofectamine 3000、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒及熒光定量PCR 試劑購自美國Invitrogen 公司；引物由廣州銳博生物科技公司設(shè)計(jì)并合成；PowerUp? SYBR?Green Master Mix 購自美國ThermoFisher 公司。本研究符合一般動物實(shí)驗(yàn)倫理學(xué)原則。

1.2 生物信息學(xué)分析基因綜合表達(dá)數(shù)據(jù)庫（GEO）（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/）中搜尋I/R損傷相關(guān)的基因表達(dá)譜（GSE82146）。該數(shù)據(jù)集分析了Long Evans雄性大鼠在缺血處理10 min以及再灌注8 h 后錐體神經(jīng)元中差異表達(dá)的mRNAs。lim?ma包對得到的基因表達(dá)譜文件進(jìn)行差異基因篩選，校正后P值稱為adj.P.Val，其中符合|log2FC|>1 和adj.P.Val<0.05 的條件的基因被確定為顯著差異表達(dá)基因，pheatmap 包用于繪制差異基因表達(dá)熱圖。通過在線生物信息學(xué)工具DAVID6.8（https：//david.ncifcrf.gov/home.jsp）對差異表達(dá)基因進(jìn)行KEGG 功能富集分析。在DisGeNET 數(shù)據(jù)庫（https：//www.dis?genet.org/）獲取I/R 的疾病風(fēng)險基因。String 數(shù)據(jù)庫（https：//string-db.org）用于分析蛋白互作用關(guān)系（PPI）。DIANA（http：//carolina.imis.athena-innova?tion.gr/diana_tools/web/index.php）、starBase 預(yù)測網(wǎng)站（http：//starbase. sysu. edu. cn/browseNcRNA. php）、miRDB 預(yù)測網(wǎng)站（http：//mirdb.org/index.html）、Tar?getScan 預(yù)測網(wǎng)站（http：//www.targetscan.org/vert_72/）、miRWalk（http：//mirwalk.umm.uni-heidelberg.de/）檢索STAT3 的上游靶miRNAs，使用DIANA 在線基因本源（GO）注釋分析對進(jìn)行miRNAs 進(jìn)行篩選，并借助Venn 在線網(wǎng)站（http：//bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/Venn/）繪制交集miRNAs。

1.3 大鼠腦中動脈閉塞法建立I/R動物模型模型建立的方法依據(jù)參考文獻(xiàn)［11］：取30只SPF級SD大鼠（6~7 周齡），體質(zhì)量范圍在200~250 g。造模前所有大鼠進(jìn)行7 d習(xí)服，飼養(yǎng)環(huán)境保持22~24 ℃，相對濕度范圍45%~65%，12 h 光/暗循環(huán)以模擬真實(shí)晝夜變化，在習(xí)服過程中大鼠可以自由飲食和采水。將30只大鼠隨機(jī)分為四組：假手術(shù)組（n=6）、模型組（n=6）、金絲桃苷低劑量組（n=6）、金絲桃苷高劑量組（n=6）。進(jìn)行灌胃給藥，金絲桃苷低劑量組組予20 mg/kg 金絲桃苷，金絲桃苷高劑量組組予50 mg/kg 金絲桃苷，模型組予同等劑量的生理鹽水，假手術(shù)組不作任何處理。于早晚灌藥各一次，持續(xù)給藥5 d。隨后在第6 天于SPF 環(huán)境下構(gòu)建鼠腦中動脈阻塞模型。在構(gòu)建模型的當(dāng)天將各組大鼠進(jìn)行8 h禁食處理，腹腔注射2%戊巴比妥鈉（30 mg/kg）麻醉大鼠，于頸部正中開一約2 cm的切口，分離右側(cè)頸總動脈，頸內(nèi)動脈和頸外動脈采用Nagasawa 法進(jìn)行缺血2 h 后再灌注24 h 誘導(dǎo)。假手術(shù)組同樣進(jìn)行中動脈分離，但不進(jìn)行結(jié)扎阻塞和刺破動脈管壁處理?？p合傷口后各組大鼠均進(jìn)行縫合并單籠飼養(yǎng)。本研究各項(xiàng)流程符合國家衛(wèi)生研究所的實(shí)驗(yàn)室動物護(hù)理和使用指南。

1.4 大鼠神經(jīng)功能缺損評價待大鼠完全清醒后按照Masao Shmiizu-Sasamata 的方法進(jìn)行神經(jīng)行為評分。嚴(yán)重程度評分從0~14 分，其中0 分代表正常，得分越高表示損傷越嚴(yán)重。評分準(zhǔn)則見表1。

表1 大鼠神經(jīng)行為評分/分

1.5 大鼠腦組織含水量測定各組實(shí)驗(yàn)大鼠于再灌注后24 h 在深麻醉狀態(tài)下斷頭取腦。取右側(cè)大腦半球用濾紙吸干表面血液，經(jīng)電子天平精確稱質(zhì)量后，放入120 ℃恒溫干燥箱烘烤48 h至恒質(zhì)量后，再精確稱質(zhì)量，并按Elliot干濕質(zhì)量法計(jì)算腦組織含水量，以百分率表示。腦組織含水量=［（濕重-干重）/濕重］×100%。

1.6 大鼠腦組織獲取與腦梗死體積評價組織采集前，將大鼠深度麻醉后斷頭取腦組織。剝除腦膜及血管后于-20 ℃下保存?zhèn)溆谩?0 min 取出后連續(xù)切4~5 張3 mm 左右厚切片。將切片加入2%的TTC的染色液，并在避光條件下浸染30 min，隨后用4%多聚甲醛灌流，固定后取出將腦片按順序整齊排列，濾紙吸干表面水分。Image-J軟件測定全腦片和梗死組織的面積，乘以腦片厚度即得全腦和梗死組織的體積。紅色區(qū)域?yàn)檎ＤX組織，蒼白色為腦梗死區(qū)域，梗死體積百分比=梗死組織的梗死體積/全腦體積的百分比。

1.7 氧-葡萄糖剝奪/復(fù)氧（OGD/R）誘導(dǎo)PC12 細(xì)胞建立體外I/R 細(xì)胞模型并轉(zhuǎn)染大鼠PC12 細(xì)胞在含10%胎牛血清、5%胚胎干細(xì)胞、100 U/mL 青鏈霉素合劑的DMEM 培養(yǎng)基中培養(yǎng)，培養(yǎng)環(huán)境設(shè)置為37 ℃、5%二氧化碳。將細(xì)胞進(jìn)行相應(yīng)的轉(zhuǎn)染操作。將20 mg 金絲桃苷與80 μL 二甲基亞砜混勻，并以20 μL 分裝，使用時用培養(yǎng)基稀釋至10 mL，并配置成含有50 μmol 金絲桃苷的培養(yǎng)基。利用Lipo?fectamine 3000 轉(zhuǎn)染試劑分別將miR-125a-5p 抑制劑（miR-125a-5p inhibitor）、miR-125a-5p 抑制劑陰性對照（inhibitor-NC）、過表達(dá)STAT3（pc-STAT3）和陰性對照（pcDNA 3.1）質(zhì)粒轉(zhuǎn)染至對應(yīng)的PC12 細(xì)胞，轉(zhuǎn)染步驟依據(jù)試劑盒說明書進(jìn)行。轉(zhuǎn)染6 h后更換RP?MI1640 完全培養(yǎng)基。在37 ℃、5%二氧化碳的培養(yǎng)箱中繼續(xù)進(jìn)行孵育，轉(zhuǎn)染48 h 后將生長狀態(tài)良好的PC12細(xì)胞用胰酶消化后制成細(xì)胞懸液，繼續(xù)培養(yǎng)，待細(xì)胞貼壁后各組加入50 μmol 的金絲桃苷完全培養(yǎng)基預(yù)處理。含金絲桃苷的培養(yǎng)基連續(xù)培養(yǎng)細(xì)胞24 h，之后換上完全培養(yǎng)基將各組細(xì)胞轉(zhuǎn)移至缺氧的環(huán)境中，設(shè)置1%氧氣、94%氮?dú)夂?%二氧化碳，12 h 后轉(zhuǎn)移至常氧條件即5%二氧化碳、95%空氣中培養(yǎng)5 h，用神經(jīng)元培養(yǎng)液替換無糖DMEM 培養(yǎng)基恢復(fù)24 h。并設(shè)未經(jīng)OGD/R處理的神經(jīng)細(xì)胞為對照組。

1.8 雙螢光素酶報告實(shí)驗(yàn)利用在線生物靶點(diǎn)預(yù)測網(wǎng)站的預(yù)測結(jié)果合成包含miR-125a-5p 結(jié)合位點(diǎn)的STAT3 3’UTR 序列，構(gòu)建STAT3 3’UTR 野生型（WT）質(zhì)粒（STAT3-WT），并在此基礎(chǔ)上利用突變結(jié)合位點(diǎn)構(gòu)建STAT3 3’UTR 突變型（MUT）質(zhì)粒（STAT3-MUT）。將上述質(zhì)粒與miR-125a-5p mimic或mimic-NC 兩兩共轉(zhuǎn)染至PC12 細(xì)胞。轉(zhuǎn)染48 h后，裂解細(xì)胞，以12 000 r/min的速度離心1 min后收集上清液。使用雙螢光素酶報告分析系統(tǒng)檢測螢光素酶活性。相對螢光素酶活性用螢光素酶和海腎螢光素酶的比值表示。

1.9 ELISA 檢測將細(xì)胞培養(yǎng)基移至無菌離心管，在4 ℃條件下以2 500 r/min 的轉(zhuǎn)速離心10 min，然后將上清等量分裝于小EP 管并于-20 ℃下保存，避免反復(fù)凍融。根據(jù)試劑盒說明書對細(xì)胞上清液中IL-6及TNF-α的濃度進(jìn)行測定。

1.10 LDH 與SOD 活力測定收集細(xì)胞到離心管內(nèi)，離心后棄上清，按照細(xì)胞數(shù)量以（500~1 000）∶1的比例加入提取液，超聲波破碎細(xì)胞，4 ℃條件下以4 000 r/min 的轉(zhuǎn)速離心10 min，棄上清，置冰上待測，根據(jù)試劑盒說明進(jìn)行SOD 活力測定。根據(jù)細(xì)胞的大小和生長速度將適量細(xì)胞接種到96 孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，待細(xì)胞生長到合適密度后吸去培養(yǎng)液，用PBS 液洗滌一次。換新鮮無血清培養(yǎng)液，將各培養(yǎng)孔分組并做好標(biāo)記，常規(guī)培養(yǎng)，根據(jù)試劑盒說明進(jìn)行LDH活力測定。

1.11 蛋白質(zhì)印跡法檢測提取各組大鼠腦組織和細(xì)胞總蛋白，并用BCA 試劑盒進(jìn)行蛋白濃度測定，以12 000 r/min 離心15 min 后收集上清液進(jìn)行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺（SDS-PAGE）凝膠電泳，電泳分離后，將蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜上，隨后在室溫下用5%脫脂牛奶-PBS溶液封閉1.5 h。取出后用TBST 溶液洗膜，加入一抗后在4 ℃條件下孵育過夜，次日用TBST 洗膜3 次，加入二抗后在溫孵育1.5 h，TBST 再次洗膜3 次，配置ECL 化學(xué)發(fā)光液，加至膜上顯色顯影。并用Image J 軟件測量并計(jì)算目的條帶與內(nèi)參條帶的灰度值之比，每個蛋白樣品均以甘油醛-3-磷酸脫氫酶（GAPDH）作為內(nèi)參對照。

1.12 qRT-PCR按照Trizol 試劑盒說明書從腦組織和細(xì)胞中提取總RNA，以RNA 為樣本，用Super?Scrip?Ⅲ逆轉(zhuǎn)錄酶合成第一鏈基因，用SYBR Green PCR Kit 進(jìn)行實(shí)時定量PCR。以上所有實(shí)驗(yàn)步驟均按照試劑盒說明書進(jìn)行操作。分別以GAPDH 和U6對STAT3 和miR-125a-5p 進(jìn)行歸一化處理，2-ΔΔCt法對mRNA表達(dá)進(jìn)行分析。詳細(xì)序列見表2。

表2 qRT-PCR引物序列

1.13 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法SPSS 23.0軟件被用于對本文數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。對計(jì)量資料進(jìn)行正態(tài)分布和方差齊性檢驗(yàn)，若符合以±s表示，兩組間比較采用t檢驗(yàn)，多組間比較采用單因素方差分析，進(jìn)一步組內(nèi)兩兩比較采用SNK-q。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 金絲桃苷能夠改善I/R大鼠腦損傷與假手術(shù)組組相比，模型組神經(jīng)功能缺損評分及腦含水量顯著增加（均P<0.05），金絲桃苷能提高I/R 大鼠神經(jīng)功能缺損評分，減少腦含水量，且效果呈劑量依賴性增強(qiáng)（均P<0.05）。TTC 染色評估腦梗死體積發(fā)現(xiàn)，與假手術(shù)組相比，模型組腦梗死面積明顯增加，但金絲桃苷低劑量組腦梗死面積較模型組明顯縮小，金絲桃苷高劑量組腦梗死面積進(jìn)一步縮?。ň鵓<0.05）。見表3。

表3 金絲桃苷對I/R大鼠腦損傷的改善作用/± s

表3 金絲桃苷對I/R大鼠腦損傷的改善作用/± s

注：①與假手術(shù)組比較，P<0.05。②與模型組比較，P<0.05。

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2.2 金絲桃苷保護(hù)機(jī)制的生物信息學(xué)分析借助GSE82146 數(shù)據(jù)集分析I/R 中差異表達(dá)的基因，圖1A顯示了該數(shù)據(jù)集中I/R 大鼠與對照組的差異表達(dá)基因，將熱圖中顯示的上調(diào)基因進(jìn)行KEGG分析，選擇與I/R 損傷相關(guān)的rno04066：HIF-1 信號通路（圖1B），該通路中富集的基因包括：CDKN1A，STAT3，HMOX1，TIMP1。將該通路中富集的基因和Dis?GeNET 數(shù)據(jù)庫查找到的I/R 風(fēng)險基因進(jìn)行PPI 蛋白互作用分析，PPI分析結(jié)果顯示STAT3在PPI網(wǎng)絡(luò)的中心位置，且與I/R 相關(guān)風(fēng)險基因存在緊密聯(lián)系（圖1C）。qRT-PCR及蛋白質(zhì)印跡檢測結(jié)果顯示，STAT3在模型組中較假手術(shù)組表達(dá)升高，且與模型組比較，金絲桃苷低劑量組STAT3 水平下調(diào)，而金絲桃苷高劑量組較金絲桃苷低劑量組水平更低（均P<0.05）。見圖2，表4。

圖2 金絲桃苷蛋白質(zhì)印跡法檢測結(jié)果

表4 各組大鼠腦組織中STAT3的mRNA和蛋白表達(dá)檢測結(jié)果/± s

表4 各組大鼠腦組織中STAT3的mRNA和蛋白表達(dá)檢測結(jié)果/± s

注：STAT3為信號傳導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄激活因子3。①與假手術(shù)組比較，P<0.05。②與模型組比較，P<0.05。

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2.3 miR-125a-5p 被證實(shí)為STAT3 的上游靶miR?NA利用DIANA、starBase、miRDB、TargetScan、miRWalk 對STAT3 的上游miRNA 進(jìn)行預(yù)測并取交集，發(fā)現(xiàn)21個交集miRNAs（圖3），GO富集結(jié)果顯示hsa-miR-6835-3p、hsa-miR-125a-5p 均與血小板激活相關(guān)（P=0.035）。以往有研究證明，血小板活化異常與腦I/R 的發(fā)生和發(fā)展存在重要關(guān)聯(lián)［14-15］。qRTPCR結(jié)果顯示（表5），與假手術(shù)組相比，miR-125a-5p在模型組顯著下調(diào)，使用金絲桃苷后其表達(dá)水平顯著上調(diào)（均P<0.05），miR-6835-3p 表達(dá)在各組內(nèi)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。STAT3 和miR-125a-5p的特異性結(jié)合位點(diǎn)見圖4，雙螢光素酶報告實(shí)驗(yàn)顯示，相對于mimic-NC 和STAT3-WT 共轉(zhuǎn)染組（1.00±0.12），miR-125a-5p mimic 和STAT3-WT 共轉(zhuǎn)染組（0.38±0.04）的螢光素酶活性顯著降低（P<0.05）。

圖4 靶向關(guān)系預(yù)測網(wǎng)站顯示的STAT3和miR-125a-5p的結(jié)合位點(diǎn)

表5 各組大鼠腦組織中miR-125a-5p和miR-6835-3p檢測結(jié)果/± s

表5 各組大鼠腦組織中miR-125a-5p和miR-6835-3p檢測結(jié)果/± s

注：miR-125a-5p 為微RNA-125a-5p，miR-6835-3p 為微RNA-6835-3p。①與假手術(shù)組比較，P<0.05。②與模型組比較，P<0.05。

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2.4 金絲桃苷對OGD/R 誘導(dǎo)的PC12 細(xì)胞的保護(hù)作用能被miR-125a-5p抑制劑部分消解與對照組相比，OGD/R 組細(xì)胞中miR-125a-5p 的表達(dá)顯著降低，金絲桃苷組較OGD/R 組miR-125a-5p 的水平上調(diào)（均P<0.05）。另外，與對照組比較，OGD/R 組細(xì)胞中IL-6、TNF-α 水平增加，LDH 水平上升，SOD 水平下降，使用金絲桃苷處理細(xì)胞后IL-6、TNF-α、LDH 水平下降，SOD 水平上升（均P<0.05）。而金絲桃苷+miR-125a-5p inhibitor 較金絲桃苷+inhibitor NC 組，IL-6、TNF-α 的濃度、LDH 活力均顯著提高，SOD活力下降（均P<0.05）。見表6。

表6 金絲桃苷對OGD/R誘導(dǎo)的PC12細(xì)胞的保護(hù)作用被miR-125a-5p inhibitor部分逆轉(zhuǎn)/± s

表6 金絲桃苷對OGD/R誘導(dǎo)的PC12細(xì)胞的保護(hù)作用被miR-125a-5p inhibitor部分逆轉(zhuǎn)/± s

注：miR-125a-5p 為微RNA-125a-5p，IL-6 為白細(xì)胞介素-6，TNF-α 為腫瘤壞死因子-α，SOD 為超氧化物歧化酶，LDH 為乳酸脫氫酶，OGD/R為氧-葡萄糖剝奪/復(fù)氧。①與對照組比較，P<0.05。②與OGD/R組比較，P<0.05。③與金絲桃苷+inhibitor-NC組組比較，P<0.05。

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2.5 金絲桃苷對OGD/R 誘導(dǎo)的PC12 細(xì)胞的保護(hù)作用是通過miR-125a-5p/STAT3 實(shí)現(xiàn)的相對于OGD/R 組，使用金絲桃苷處理細(xì)胞后IL-6、TNF-α、LDH 水平下降，SOD 水平上升（P<0.05）。而相較于金絲桃苷+pcDNA3.1組，轉(zhuǎn)染pc-STAT3后IL-6、TNFα、LDH 水平提高，SOD 水平下降（P<0.05）。綜上結(jié)果說明金絲桃苷對OGD/R 誘導(dǎo)的PC12 細(xì)胞具有一定保護(hù)其不受炎性反應(yīng)和氧化應(yīng)激損傷的效果，而該效果能被過表達(dá)STAT3部分消解，結(jié)合實(shí)驗(yàn)“2.3”部分，本研究認(rèn)為金絲桃苷是通過上調(diào)miR-125a-5p抑制STAT3的表達(dá)發(fā)揮相應(yīng)作用的。見表7。

表7 各組細(xì)胞炎性因子、SOD和LDH水平比較/± s

表7 各組細(xì)胞炎性因子、SOD和LDH水平比較/± s

注：IL-6為白細(xì)胞介素-6，TNF-α為腫瘤壞死因子-α，SOD為超氧化物歧化酶，LDH為乳酸脫氫酶。①與OGD/R組比較，P<0.05。②與金絲桃苷+pcDNA3.1組比較，P<0.05。

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3 討論

先前研究表明，Hyperin能夠通過調(diào)節(jié)一氧化氮信號通路進(jìn)而保護(hù)大腦皮層免受缺氧缺糖導(dǎo)致的再灌注損傷［6］。此外，劉佳佳等［16］在研究中使用50 mg/kg 的金絲桃苷處理腦I/R 小鼠，證實(shí)了其對神經(jīng)保護(hù)的作用。本實(shí)驗(yàn)采用前人方法通過阻塞中動脈制備局灶性I/R，具有損傷小且時間可控的特點(diǎn)［17-18］。發(fā)現(xiàn)Hyperin 作用于大鼠腦I/R 損傷后，大鼠的神經(jīng)功能障礙有所改善，腦梗死體積顯著下降，腦水腫減輕。隨后進(jìn)行生物信息學(xué)分析后發(fā)現(xiàn)異常上調(diào)的基因在HIF-1 通路中顯著富集。有證據(jù)表明，HIF-1 通路在I/R 損傷的病理進(jìn)展密切相關(guān)：其介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)可預(yù)防I/R 損傷后神經(jīng)元的死亡［19］。該通路中富集的STAT3 基因與I/R 損傷風(fēng)險基因緊密相關(guān)。STAT3可對多種細(xì)胞因子等進(jìn)行調(diào)控從而發(fā)揮作用［20］。先前研究證明S1P 能夠激活STAT3，而抑制S1P 信號是一種治療腦缺血后血腦屏障損傷的策略［21］。下調(diào)STAT3 也被證實(shí)能夠改善I/R 損傷小鼠的神經(jīng)癥狀，縮小腦梗死范圍［22］。而miRNAs能通過與靶基因的3′-UTR端序列互補(bǔ)配對來促進(jìn)靶基因的降解或抑制其翻譯，參與細(xì)胞分化凋亡及增殖等進(jìn)程［23］。本研究進(jìn)一步尋找可能調(diào)控STAT3 的上游miRNA，結(jié)合多種生物信息學(xué)工具最終將miR-125a-5p 納入研究。miR-125a-5p 經(jīng)GO 富集分析顯示與血小板激活通路相關(guān)。在腦缺血后期，血腦屏障遭到破壞，缺氧激活血小板通路釋放相關(guān)因子［24］。且miR-125已被證明其異常高表達(dá)能夠促進(jìn)I/R 模型梗死體積減少，改善神經(jīng)行為等［9］。PC12 細(xì)胞來自大鼠腎上腺嗜鉻細(xì)胞瘤細(xì)胞系，與神經(jīng)細(xì)胞均來源于神經(jīng)脊，且與神經(jīng)細(xì)胞的結(jié)構(gòu)、功能均有相似之處，且相較于神經(jīng)元更易獲得、培養(yǎng)［25］。因此本實(shí)驗(yàn)借助前人方法［26］構(gòu)建PC12細(xì)胞的OGD/R 體外細(xì)胞模型，考察miR-125a-5p 與STAT3 在該疾病模型中的表達(dá)，并進(jìn)行體外細(xì)胞學(xué)功能實(shí)驗(yàn)。結(jié)果顯示Hyperin 能夠通過上調(diào)miR-125a-5p抑制STAT3的水平緩解炎癥因子的釋放。

此外本實(shí)驗(yàn)考察了SOD 和LDH 的活力：SOD 在機(jī)體內(nèi)作為重要的抗氧化酶，可以參與清除氧自由基從而保護(hù)細(xì)胞不受氧化應(yīng)激損傷，可作為考察體內(nèi)維持氧化還原平衡的重要因子［27］。而LDH 外滲常伴隨著較高的氧自由基，預(yù)示著胞內(nèi)鈣超載與膜脂質(zhì)的氧化損傷，從而導(dǎo)致細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)改變，嚴(yán)重?fù)p害細(xì)胞功能，并造成神經(jīng)元死亡［28］。我們發(fā)現(xiàn)Hyperin 處理OGD/R 模型細(xì)胞能夠通過促進(jìn)miR-125a-5p 的表達(dá)水平、抑制STAT3 表達(dá)，上調(diào)SOD 水平并降低LDH 的含量，從而顯著提高PC12 細(xì)胞的抗氧化應(yīng)激能力。

綜上所述，本研究從動物及細(xì)胞模型兩個層面深入研究了Hyperin 在I/R 損傷中的生物學(xué)特性和功能，揭示了Hyperin 通過調(diào)控miR-125a-5p/STAT3軸在I/R 中發(fā)揮保護(hù)作用的可能機(jī)制。而擴(kuò)大樣本數(shù)量、尋求金絲桃苷藥物的最佳治療劑量等，是本研究進(jìn)一步完善的方向。綜上，本研究為I/R 治療提供了新的見解，顯示了中藥成分結(jié)合分子靶向技術(shù)潛在的應(yīng)用價值。

（本文圖1，3見插圖7-1）