ALG3通過JAK/STAT通路促進(jìn)三陰性乳腺癌增殖、侵襲和遷移

邢現(xiàn)菲,李瑞華,韓亞娟,張競競,邵渝歡,馬賽菲,劉亞萌,韓正全*

(1蚌埠醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院腫瘤內(nèi)科,蚌埠 233000;2蚌埠醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院消化內(nèi)科;3蚌埠醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院耳鼻咽喉頭頸外科;*通訊作者,E-mail:dochyj@163.com)

乳腺癌是女性中最常見的癌癥,它是世界上婦女死亡的第二大常見原因[1]。近年來,雖然手術(shù)和術(shù)后化療在乳腺癌治療方面取得了顯著進(jìn)展,但是,乳腺癌的5年生存率仍然不高,特別是三陰性乳腺癌(triple negative breast cancer,TNBC)的治療效果較差,嚴(yán)重威脅患者生存。糖基化是在包括乳腺癌、卵巢癌和內(nèi)膜癌在內(nèi)的不同類型癌癥中觀察到的一種關(guān)鍵修飾,其促進(jìn)了乳腺癌細(xì)胞的黏附、增殖和轉(zhuǎn)移[2]。糖基轉(zhuǎn)移酶在癌細(xì)胞中的差異表達(dá)是腫瘤糖基化異常的主要原因之一,而ALG家族代表了一類關(guān)鍵的糖基轉(zhuǎn)移酶[3,4]。α-1,3-甘露糖基轉(zhuǎn)移酶(alpha-1,3-mannosyltransferase,ALG3)是ALG家族的一員,位于染色體3q27.1區(qū)域[5],是一種完整的ER膜蛋白,具有多個(gè)跨膜區(qū)域。研究表明,ALG3與腫瘤的發(fā)生發(fā)展相關(guān),如口腔鱗狀細(xì)胞癌[6]、非小細(xì)胞肺癌[7]、膀胱癌[8]等,但在乳腺癌方面的研究報(bào)道較少,因此,本研究將通過RNA干擾技術(shù)下調(diào)/過表達(dá)乳腺癌細(xì)胞中ALG3的表達(dá)量,觀察ALG3對乳腺癌增殖、侵襲和遷移等生物學(xué)行為的影響,并探究其可能的分子機(jī)制,旨在為乳腺癌患者的預(yù)后和治療提供理論基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

正常人乳腺細(xì)胞HBL-100和乳腺癌細(xì)胞SKBr3、MCF-7、MDA-MB-231均購自武漢普諾賽生物科技有限公司。BALB/c裸鼠購自上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限責(zé)任公司,動(dòng)物實(shí)驗(yàn)過程符合蚌埠醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)。DMEM培養(yǎng)基、RPMI-1640培養(yǎng)基、胰蛋白酶、青鏈霉素雙抗、PBS緩沖溶液購自武漢普諾賽生物科技有限公司,胎牛血清(FBS)、Materigel膠購自浙江天杭生物科技股份有限公司,si-NC、siRNA、mimic-NC、mimic均購自上海生工生物工程股份有限公司,轉(zhuǎn)染試劑Lip 2000由Thermo Fisher Scientific(美國)公司購買,一抗(GAPDH、ALG3、JAK2/p-JAK2、STAT3/p-STAT3、Bcl-2、MMP2、Cyclin D1)購于武漢三鷹生物技術(shù)有限公司,辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔二抗、ECL顯影液購于Abbkine(美國)科技有限公司,JAK/STAT抑制劑WP1066、Transwell小室、BCA蛋白濃度測量試劑盒、脫脂奶粉均購自碧云天生物技術(shù)有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)及轉(zhuǎn)染 HBL-100、MDA-MB-231、MCF-7在含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基中培養(yǎng),SKBr3在含10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基中培養(yǎng),在37 ℃和5% CO2飽和濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。轉(zhuǎn)染對象為處于對數(shù)生長期的細(xì)胞,要求轉(zhuǎn)染時(shí)細(xì)胞密度達(dá)到50%～60%,在下調(diào)ALG3時(shí),分別轉(zhuǎn)染si-NC、ALG3-S1、ALG3-S2、ALG3-S3,選擇敲減效率最明顯的序列構(gòu)建ALG3-KD組;在上調(diào)ALG3時(shí),分別轉(zhuǎn)染mimic-NC、ALG3-mimic驗(yàn)證轉(zhuǎn)染效率,選擇ALG3-mimic構(gòu)建ALG3-OE組。轉(zhuǎn)染步驟嚴(yán)格按照轉(zhuǎn)染試劑說明書進(jìn)行,在后續(xù)實(shí)驗(yàn)中將進(jìn)行如下分組:control組(Lip2000)、NC-KD組(Lip2000+si-NC)、ALG3-KD組(Lip2000+ALG3-siRNA)和NC-OE組(Lip2000+mimic-NC)、ALG3-OE組(Lip2000+ALG3-mimic)以及ALG3-OE+WP1066組(使用通路抑制劑WP1066培養(yǎng)ALG3-OE組細(xì)胞)。本研究中使用的ALG3特異性序列見表1。

表1 引物序列

1.2.2 CCK-8和集落克隆實(shí)驗(yàn)檢測增殖能力 CCK-8實(shí)驗(yàn):將轉(zhuǎn)染后處于對數(shù)生長期的control組、NC-KD組和ALG3-KD組MDA-MB-231細(xì)胞重新消化離心,計(jì)數(shù)后接種于96孔板中,調(diào)整每孔細(xì)胞懸液為100 μl,細(xì)胞密度為3 000個(gè)/孔,每組設(shè)置5個(gè)復(fù)孔,放入37 ℃細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi),分別于24,48,72,96 h時(shí),每孔加入CCK-8溶液10 μl,37 ℃細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)孵育1 h后,在酶標(biāo)儀上選擇460 nm波長測定吸光度。本實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

集落克隆實(shí)驗(yàn):將轉(zhuǎn)染后處于對數(shù)生長期的1.2.1各組MDA-MB-231細(xì)胞重新消化離心,以500個(gè)/孔種植于6孔板,每3 d換一次液,顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)的同時(shí)觀察克隆數(shù)目,待6孔板中大多數(shù)單個(gè)細(xì)胞克隆數(shù)大于50個(gè)時(shí),棄上清,PBS緩沖溶液洗滌一次;加入1 ml 4%多聚甲醛至每個(gè)孔內(nèi),4 ℃冰箱固定細(xì)胞20 min,PBS洗滌細(xì)胞一次;每孔加入結(jié)晶紫1 ml,進(jìn)行染色15～20 min,PBS洗滌細(xì)胞若干次,倒扣晾干,拍照計(jì)數(shù)。本實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.3 裸鼠移植瘤模型的構(gòu)建 收集轉(zhuǎn)染后處于對數(shù)生長期的NC-KD組和ALG3-KD組MDA-MB-231細(xì)胞,用DMEM培養(yǎng)基制成細(xì)胞懸液,以5×106個(gè)/只的密度注射到裸鼠上肢腋下,將裸鼠分為NC-KD組(注射NC-KD組MDA-MB-231細(xì)胞)和ALG3-KD組(注射ALG3-KD組MDA-MB-231細(xì)胞),每組6只。每4 d用游標(biāo)卡尺測量腫瘤大小,瘤體體積=π/6×L×W×W=3.14/6×L×W×W(L代表長徑,W代表短徑)。26 d后,將裸鼠斷椎處死,用彎頭鑷和眼科剪將皮下腫瘤鈍性分離,稱重。

1.2.4 細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)檢測遷移能力 將轉(zhuǎn)染后處于對數(shù)生長期的control組、NC-KD組和ALG3-KD組MDA-MB-231細(xì)胞重新消化離心,以5×105個(gè)/孔的密度種植于6孔板,待細(xì)胞貼壁后換成無血清DMEM培養(yǎng)基,培養(yǎng)過夜。無菌10 μl槍頭垂直于細(xì)胞面劃痕,洗滌后使用無血清DMEM培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)。分別于0,24,48 h將6孔板置于倒置顯微鏡下拍照,每組隨機(jī)選擇3個(gè)劃痕視野拍照,并做好標(biāo)記,計(jì)算遷移率。本實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.5 Transwell實(shí)驗(yàn)檢測侵襲和遷移能力 遷移實(shí)驗(yàn):將轉(zhuǎn)染后處于對數(shù)生長期的1.2.1各組MDA-MB-231細(xì)胞重新消化離心,用無血清培養(yǎng)基重懸并計(jì)數(shù),以1.5×104/孔分別種植于Transwell小室,每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔,加入無血清DMEM培養(yǎng)基定量至100 μl,小室置于24孔板,下室孔內(nèi)加入600 μl含10%胎牛血清的培養(yǎng)基。培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)24 h,取出Transwell小室,棉簽輕輕擦拭小室膜上表面多余的細(xì)胞,4%多聚甲醛固定15～20 min,結(jié)晶紫溶液浸泡染色15～20 min,PBS漂洗掉多余的染料,晾干后于倒置顯微鏡下拍照,觀察小室膜下表面細(xì)胞數(shù)量。本實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

侵襲實(shí)驗(yàn):4 ℃環(huán)境下將Materigel基質(zhì)膠與基礎(chǔ)培養(yǎng)基按1∶8的比例稀釋,每孔加入60 μl的Materigel基質(zhì)膠均勻覆蓋Transwell小室底部,置于培養(yǎng)箱孵育30 min?；|(zhì)膠凝固后,將轉(zhuǎn)染后處于對數(shù)生長期的1.2.1各組MDA-MB-231細(xì)胞重新消化離心,用無血清培養(yǎng)基重懸并計(jì)數(shù),將各組細(xì)胞以1.5×104/孔的密度種植于小室上室,其余步驟與遷移實(shí)驗(yàn)相同,培養(yǎng)48 h后多聚甲醛固定,結(jié)晶紫染色,晾干后于倒置顯微鏡下拍照,檢測細(xì)胞數(shù)量。本實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.6 Western blot檢測ALG3、JAK/STAT信號通路相關(guān)蛋白表達(dá) 分別將1.2.1各組細(xì)胞裂解后提取蛋白,使用BCA法測定蛋白濃度,于SDS-PAGE上取等量蛋白樣品進(jìn)行電泳,PVDF膜轉(zhuǎn)膜,5%脫脂牛奶封閉2 h,一抗(GAPDH、ALG3、JAK2/p-JAK2、STAT3/p-STAT3、Bax、MMP2、Cyclin D1)按1∶1 000稀釋,4 ℃條件下孵育過夜。TBST溶液洗5次,每次5 min,二抗按1∶10 000稀釋,室溫下孵育2 h,TBST溶液洗5次,每次5 min,ECL顯影液曝光顯影,Image J分析實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 ALG3在乳腺癌細(xì)胞中高表達(dá)

Western blot實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,與正常乳腺上皮細(xì)胞HBL-100相比,乳腺癌細(xì)胞SKBr3、MCF-7、MDA-MB-231中的ALG3的表達(dá)量明顯增加,其中MDA-MB-231和MCF-7細(xì)胞的差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),而SKBr3細(xì)胞的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05,見圖1)。由于MDA-MB-231細(xì)胞中ALG3表達(dá)升高最顯著,因此,選擇MDA-MB-231細(xì)胞作為后續(xù)研究對象。

圖1 ALG3在正常人乳腺上皮細(xì)胞和各種乳腺癌細(xì)胞中的表達(dá)(n=3)

2.2 ALG3敲減/過表達(dá)序列的篩選及驗(yàn)證

Western blot結(jié)果顯示,與control組和NC-KD組比較,ALG3-S3組ALG3敲減效果最好,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01);與control組和NC-OE組比較,ALG3-mimic組ALG3表達(dá)顯著增加(P<0.01,見圖2)。故選擇ALG3-S3和ALG3-mimic用于后續(xù)敲減/過表達(dá)。

與control組和各自對應(yīng)的NC組比較,*P<0.05,**P<0.01

2.3 下調(diào)ALG3抑制MDA-MB-231細(xì)胞的增殖能力

集落克隆和CCK-8實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,與control組和NC-KD組比較,ALG3-KD組細(xì)胞的增殖率降低,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05,見圖3A)。

與control組和NC-KD組對比,*P<0.05

裸鼠成瘤實(shí)驗(yàn)表明,與NC-KD組比較,ALG3-KD組裸鼠腫瘤的體積和質(zhì)量明顯較慢,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05,見圖3B)。

2.4 下調(diào)ALG3抑制MDA-MB-231細(xì)胞侵襲和遷移能力

劃痕實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,與control組和NC-KD組比較,ALG3-KD組劃痕愈合顯著延遲,遷移能力明顯減弱,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05,見圖4A);Transwell實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,與control組和NC-KD組比較,ALG3-KD組24 h時(shí)乳腺癌細(xì)胞的遷移能力降低,ALG3-KD組48 h時(shí)跨膜細(xì)胞數(shù)減少,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05,見圖4B)。

A.劃痕實(shí)驗(yàn)檢測遷移能力變化(×4)B.Transwell檢測侵襲和遷移能力變化(結(jié)晶紫染色,×10)

2.5 下調(diào)ALG3可以抑制MDA-MB-231細(xì)胞中JAK/STAT通路蛋白表達(dá)

Western blot結(jié)果顯示,與control組和NC-KD組比較,ALG3-KD組JAK2/p-JAK2、STAT3/p-STAT3、MMP2、Cyclin D1的表達(dá)均受到抑制,相反,Bax在ALG3-KD組中的表達(dá)升高,而且磷酸化水平也有所降低,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05,見圖5)。

圖5 下調(diào)ALG3對MDA-MB-231細(xì)胞中JAK/STAT通路蛋白的影響(n=3)

2.6 WP1066可以抑制ALG3過表達(dá)MDA-MB-231細(xì)胞的JAK/STAT信號通路

Western blot結(jié)果顯示,加入通路抑制劑WP1066后,與NC-OE組和ALG3-OE組比較,ALG3-OE+WP1066組JAK/STAT通路相關(guān)蛋白JAK2/p-JAK2、STAT3/p-STAT3及其磷酸化水平受到抑制,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05,見圖6)。

與NC-OE和ALG3-OE組對比,*P<0.05

2.7 抑制JAK/STAT通路后可降低ALG3過表達(dá)MDA-MB-231細(xì)胞的增殖、侵襲和遷移

集落克隆實(shí)驗(yàn)表明,與NC-OE組和ALG3-OE組比較,ALG3-OE+WP1066組細(xì)胞的增殖能力被抑制(P<0.05,見圖7A);Transwell實(shí)驗(yàn)表明,與NC-OE組和ALG3-OE組比較,ALG3-OE+WP1066組24 h時(shí)乳腺癌細(xì)胞的遷移能力降低,ALG3-OE+WP1066組48 h時(shí)跨膜細(xì)胞數(shù)減少(P<0.05,見圖7B)。

A.集落克隆檢測抑制JAK/STAT通路后增殖能力變化 B.Transwell檢測抑制JAK/STAT通路后侵襲、遷移能力變化(結(jié)晶紫染色,×10)

3 討論

近年來,乳腺癌基因研究一直是熱點(diǎn)問題,雖然目前已經(jīng)有不少分子標(biāo)志物應(yīng)用于其臨床診斷及治療,但仍需發(fā)現(xiàn)更多的基因治療靶點(diǎn)。糖基化是蛋白質(zhì)普遍存在的翻譯后修飾[9,10],當(dāng)正常上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)化為癌細(xì)胞時(shí),表面糖基化變得異常[11],已有相關(guān)的糖基化蛋白作為臨床上腫瘤標(biāo)志物,如肝細(xì)胞癌的甲胎蛋白(AFP)[12]、結(jié)腸癌的癌胚抗原(CEA)[13]和前列腺癌的前列腺特異性抗原(PSA)[14]。糖基化是由多種糖基轉(zhuǎn)移酶通過復(fù)雜的生物合成途徑產(chǎn)生的,ALG3屬于糖基轉(zhuǎn)移酶家族中的一員,其突變可導(dǎo)致糖基化蛋白糖基化不足和糖蛋白功能障礙[15,16],ALG3有助于腫瘤細(xì)胞中的高甘露糖型N-聚糖,已經(jīng)描述了幾種高甘露糖型N-連接聚糖的異常表達(dá)與癌癥進(jìn)展有關(guān)[17],在乳腺癌患者血清中也已經(jīng)檢測到豐富的高甘露糖聚糖[18]。研究表明,下調(diào)ALG3可抑制MCF-7細(xì)胞在體外和體內(nèi)的生長[19],而其在三陰性乳腺癌中的功能作用尚不明確。

首先,本研究采用Western blot檢測正常人乳腺上皮細(xì)胞和不同乳腺癌細(xì)胞中ALG3蛋白的表達(dá)水平,結(jié)果發(fā)現(xiàn),多種乳腺癌細(xì)胞中ALG3蛋白的表達(dá)水平高于正常人乳腺上皮細(xì)胞,且MDA-MB-231細(xì)胞中的表達(dá)水平最高。為進(jìn)一步說明ALG3對MDA-MB-231細(xì)胞相關(guān)生物學(xué)行為的影響,通過RNA干擾技術(shù)和轉(zhuǎn)染敲減MDA-MB-231細(xì)胞中ALG3蛋白的表達(dá),觀察下調(diào)ALG3蛋白對MDA-MB-231細(xì)胞增殖、侵襲和遷移的影響,結(jié)果表明,ALG3-KD組MDA-MB-231細(xì)胞增殖、侵襲和遷移能力相較于對照組均受到了明顯抑制。Cui等[20]的研究表明,ALG3促進(jìn)卵巢癌的增殖和腹膜轉(zhuǎn)移等惡性行為,且與不良預(yù)后相關(guān)。Zhao等[21]的研究表明,ALG3在肝細(xì)胞癌中過度表達(dá),沉默其表達(dá)可以抑制增殖、侵襲遷移能力。同理,Li等[22]的研究證實(shí)了ALG3在膀胱癌中也呈現(xiàn)高表達(dá)狀態(tài),下調(diào)ALG3的表達(dá)可以抑制膀胱癌的發(fā)生發(fā)展。本研究的結(jié)果與上述文獻(xiàn)報(bào)道的結(jié)果一致。

據(jù)報(bào)道,ALG3可能通過CDK-周期蛋白途徑促進(jìn)口腔鱗狀細(xì)胞癌的侵襲性行為[6],還可以通過FTX/miR-342軸促進(jìn)急性髓系白血病的耐藥發(fā)展[4]。本研究通過Western blot檢測腫瘤增殖、侵襲和凋亡相關(guān)基因變化,發(fā)現(xiàn)ALG3可以調(diào)節(jié)Bcl-2、MMP2、Cyclin D1的表達(dá),而這些基因蛋白都是與JAK/STAT通路相關(guān)的下游蛋白,提示ALG3促進(jìn)MDA-MB-231細(xì)胞的惡性行為可能與該通路相關(guān)。酪氨酸蛋白激酶/信號傳導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄激活因子(Janus kinase-signal transducers and activators of transcription,JAK/STAT)是從膜表面?zhèn)鬟f外部信號激活靶基因轉(zhuǎn)錄的主要信號級聯(lián)途徑之一,其信號異常有助于腫瘤的增殖和轉(zhuǎn)移[23],當(dāng)有配體與細(xì)胞表面受體結(jié)合時(shí),JAKs會通過磷酸化STATs從而形成二聚體進(jìn)入細(xì)胞核內(nèi)與DNA結(jié)合,調(diào)節(jié)目標(biāo)基因的轉(zhuǎn)錄[24]。STATs磷酸化導(dǎo)致穩(wěn)定的二聚體的形成,這些二聚體在細(xì)胞核中易位,并與基因啟動(dòng)子區(qū)域的特定回文序列結(jié)合,啟動(dòng)轉(zhuǎn)錄反應(yīng),從而調(diào)節(jié)細(xì)胞的增殖、分化和凋亡[25,26]。研究表明,JAK/STAT信號通路對于乳腺癌細(xì)胞的增殖及凋亡具有重要作用,抑制該信號通路可抑制癌細(xì)胞的發(fā)生及發(fā)展[27],因此,對于開發(fā)乳腺癌的新的治療方法,JAK/STAT通路應(yīng)該是一個(gè)潛在的靶點(diǎn)。在本研究中,為了確定ALG3介導(dǎo)的影響MDA-MB-231細(xì)胞增殖、轉(zhuǎn)移和凋亡的機(jī)制,通過Western blot檢測下調(diào)ALG3表達(dá)后JAK/STAT信號通路相關(guān)蛋白,表現(xiàn)為增殖、轉(zhuǎn)移相關(guān)蛋白(MMP2、Cyclin D1)表達(dá)受到抑制,凋亡相關(guān)蛋白(Bcl-2)表達(dá)水平升高,且磷酸化水平降低,提示下調(diào)ALG3可以抑制JAK/STAT信號通路下游蛋白的表達(dá)和磷酸化。此外,使用WP1066阻斷JAK/STAT通路后,ALG3-OE+WP1066組MDA-MB-231細(xì)胞增殖、侵襲和遷移水平受到不同程度的影響,表明抑制JAK/STAT通路可以降低ALG3對MDA-MB-231細(xì)胞的增殖、侵襲和遷移能力。由此推測,ALG3可能通過激活JAK/STAT通路下游蛋白(JAK2/pJAK2、STAT3/pSTAT3、Bcl-2、MMP2、Cyclin D1)及其磷酸化,從而促進(jìn)MDA-MB-231細(xì)胞的增殖、侵襲和遷移。

綜上所述,ALG3可能通過激活JAK/STAT信號通路促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞增殖、侵襲和遷移,可能成為乳腺癌分子診斷及治療靶點(diǎn),但具體通過何種方式影響JAK/STAT通路仍需進(jìn)一步研究。然而,本研究仍有一定的局限性,僅從細(xì)胞層面進(jìn)行驗(yàn)證,后續(xù)還可以在生信、組織和體內(nèi)實(shí)驗(yàn)上進(jìn)行更深層次的研究,給本研究提供更充分的理論依據(jù)。