臭椿不同部位提取物抗煙草花葉病毒活性研究

吳江梅，鄒正彪，左安建，符滔，張威，閆曉慧，胡世俊

(1. 西南林業(yè)大學(xué)生物多樣性保護(hù)學(xué)院/云南省森林災(zāi)害預(yù)警與控制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，云南昆明 650224；2. 西南林業(yè)大學(xué)林學(xué)院，云南昆明 650224)

植物病毒病害對(duì)現(xiàn)代農(nóng)業(yè)造成嚴(yán)重威脅和巨大經(jīng)濟(jì)損失[1]。 煙草花葉病毒(TMV)是一種重要的植物病毒，因其廣泛的寄主和傳播方式，在世界范圍內(nèi)對(duì)農(nóng)作物造成重大損失，目前為止，很少有化學(xué)試劑能夠顯著抑制TMV 在植物體內(nèi)的復(fù)制[2-4]。 由于傳統(tǒng)化學(xué)農(nóng)藥的使用會(huì)對(duì)人體、農(nóng)作物和其他生物以及環(huán)境造成危害[5]，在綠色農(nóng)業(yè)理念下，植物源農(nóng)藥因具有高效、無(wú)污染、材料易獲取、費(fèi)用較低、不產(chǎn)生抗藥性等優(yōu)點(diǎn)而受到廣泛關(guān)注[6]。

我國(guó)植物資源豐富，植物提取物中的多種化學(xué)成分具有生物活性，并且植物不同部分所含有化學(xué)成分也不同[7-9]。 臭椿[Ailanthus altissima(Mill.)Swingle]為苦木科(Simaroubaceae)臭椿屬(Ailanthus)植物，是一種傳統(tǒng)草藥，臭椿種子、皮、葉、果實(shí)中含有苦木素、黃酮、生物堿類等多種化學(xué)成分，具有豐富的生物和藥理活性[10]。 研究發(fā)現(xiàn)臭椿根皮、種子、果實(shí)提取物對(duì)TMV 具有一定的抑制作用[11-13]。 為此，本研究對(duì)臭椿枝葉石油醚提取物(leaf extract， LE)、種子石油醚提取物(seed extract， SE)、樹(shù)皮乙醇提取物(bark ethanol extract，BE)的抗煙草花葉病毒活性進(jìn)行了測(cè)定，并對(duì)臭椿種子和枝葉石油醚提取物、樹(shù)皮乙醇提取物進(jìn)行進(jìn)一步分離和抗TMV 活性追蹤，篩選抗TMV的有效成分，為臭椿的綜合開(kāi)發(fā)利用提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 供試植物 臭椿枝葉、種子于2015 年遼寧朝陽(yáng)采集，臭椿樹(shù)皮于2022 年遼寧朝陽(yáng)采集，樹(shù)齡在10～15 年，保存在西南林業(yè)大學(xué)森林災(zāi)害預(yù)警與控制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室。

1.1.2 供試病毒 TMV(U1)普通株系，繁殖于普通煙K326 上，采用Gooding 等[14]的方法進(jìn)行提純，保存于-80℃冰箱中備用。

1.1.3 供試寄主 TMV 枯斑寄主心葉煙(Nicotiana glutinosa)，漂盤(pán)育苗，在無(wú)蟲(chóng)溫室中培育，待煙苗長(zhǎng)至4～6 片真葉時(shí)進(jìn)行活性測(cè)定。

1.1.4 儀器與試劑 8%寧南霉素水劑(NN，德強(qiáng)生物股份有限公司)；二甲基亞砜(DMSO，分析純，天津市光復(fù)精細(xì)化工研究所)；甲醇、乙醇、石油醚、乙酸乙酯、二氯甲烷(化學(xué)純，云南利妍科技有限公司)經(jīng)重蒸后使用；GF254 薄層層析硅膠板、柱層析硅膠(青島海洋化工廠)；Lichroprep RP-18 反向硅膠柱層析材料(德國(guó)默克公司)；N-1100旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(上海愛(ài)朗儀器有限公司)；DL-1萬(wàn)用電爐(天津市賽得利斯實(shí)驗(yàn)分析儀器制造廠)；ZF-6 三用紫外分析儀(上海嘉鵬科技有限公司)。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 提取與分離 (1)臭椿枝葉石油醚提取物(LE)的提取與分離:臭椿枝葉30.00 kg，風(fēng)干粉碎，甲醇加熱回流提取3 次，每次3 h，合并提取液，減壓濃縮所得浸膏溶于蒸餾水中，用石油醚提取3 次，減壓濃縮合并得到石油醚提取物(1.61 kg)，經(jīng)硅膠柱層析按V(石油醚)∶V(乙酸乙酯)以100 ∶1 ～0 ∶1 比例梯度洗脫，得到12 個(gè)餾分(LE.1～LE.12)；各餾分的洗脫比例，LE.1、LE.2為100∶1，LE.3 為50 ∶1，LE.4 為30 ∶1，LE.5 為20 ∶1，LE.6 為10∶1，LE.7 為8∶1，LE.8 為5∶1，LE.9為3 ∶1，LE.10 為2∶1，LE.11 為1∶1，LE.12 為0∶1。

(2)臭椿種子石油醚提取物(SE)的提取與分離:臭椿種子10.5 kg 風(fēng)干粉碎，采用甲醇加熱回流提取法提取，分別提取3 次，每次3 h，合并3 次提取液，用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀減壓濃縮至浸膏狀，得到甲醇提取物，用蒸餾水溶解提取物，用石油醚提取3次，合并提取液，濃縮至浸膏狀得到石油醚提取物(0.64 kg)，經(jīng)硅膠柱層析按V(石油醚)∶V(乙酸乙酯)以100∶1～1∶1 比例梯度洗脫，得到12 個(gè)餾分(SE.1 ～SE.12)；各餾分的洗脫比例，SE.1 為100∶1，SE.2 為50∶1；SE.3 為30∶1，SE.4 為20 ∶1，SE.5、SE.6 為10∶1，SE.7、SE.8 為8∶1，SE.9 為5 ∶1，SE.10 為3∶1，SE.11 為2∶1，SE.12 為1∶1。

(3) 臭椿樹(shù)皮乙醇提取物(BE)的提取與分離:臭椿樹(shù)皮1390.35 g 風(fēng)干粉碎，采用乙醇加熱回流提取法提取5 次，每次3 h，合并5 次提取液，再用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀減壓濃縮至浸膏狀，后用凍干機(jī)干燥稱重得到98.3 g 提取物。 將得到的提取物經(jīng)硅膠柱層析按V(石油醚) ∶V(乙酸乙酯)以30 ∶1～1 ∶1、V(二氯甲烷)∶V(甲醇)以100∶1 ～0∶1比例梯度洗脫，得到17 個(gè)餾分(BE.1 ～BE.17)。BE.1～BE.8 為V(石油醚)∶V(乙酸乙酯)梯度洗脫得到，各餾分的洗脫比例如下，BE.1 為30∶1，BE.2 為20 ∶1，BE.3 為10∶1，BE.4 為7∶1，BE.5 為5 ∶1，BE.6為3∶1，BE.7 為2∶1，BE.8 為1∶1；BE.9～BE.17為V(二氯甲烷)∶V(甲醇)梯度洗脫得到，各餾分洗脫比例，BE.9 為100∶1，BE.10 為50∶1，BE.11、BE.12 為30∶1，BE.13 為20 ∶1，BE.14 為10 ∶1，BE.15 為5∶1，BE.16 為3∶1，BE.17 為0∶1。

1.2.2 抑制TMV 病毒侵染活性測(cè)定 采用活體半葉枯斑法[15]測(cè)定抗煙草花葉病毒活性，左半葉用1 mg/mL 的提取物作為處理，右半葉用同樣濃度的DMSO 處理作為對(duì)照，以寧南霉素作為陽(yáng)性對(duì)照。 采用3 種施藥方式進(jìn)行測(cè)定，①先施藥:將200 μL 提取物用棉簽涂抹在葉片上，6 h 后接種病毒200 μL，測(cè)定植物提取物對(duì)TMV 初侵染的保護(hù)作用；②后施藥:接種200 μL 病毒6 h 后，將200 μL 提取物涂抹在葉片上，測(cè)定植物提取物對(duì)TMV 侵染的治療作用；③混合施藥:將200 μL 提取物與200 μL 病毒充分混勻30 min 后接種，測(cè)定植物提取物對(duì)TMV 的鈍化作用。 將煙苗放在無(wú)蟲(chóng)溫室中培養(yǎng)，待枯斑癥狀明顯時(shí)，統(tǒng)計(jì)試驗(yàn)結(jié)果，并計(jì)算抑制率。

抑制率(%)＝(對(duì)照平均枯斑數(shù)-處理平均枯斑數(shù))/對(duì)照平均枯斑數(shù)×100 。

1.2.3 抑制TMV 病毒增殖活性測(cè)定 采用離體半葉枯斑法[16]進(jìn)行測(cè)定。 全葉摩擦接種1 mg/mL TMV 200 μL，6 h 后將葉片剪下，左半葉浸入盛有1 mg/mL DMSO 溶液的培養(yǎng)皿中作為陰性對(duì)照，右半葉浸入盛有1 mg/mL 提取物溶液的培養(yǎng)皿中作為處理，以浸入寧南霉素作為陽(yáng)性對(duì)照。 室內(nèi)培養(yǎng)，待枯斑癥狀明顯時(shí)，統(tǒng)計(jì)試驗(yàn)結(jié)果，按上述公式計(jì)算抑制率。

1.3 數(shù)據(jù)處理

采用Microsoft Excel 2010 軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)，運(yùn)用SPSS 17.0 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行One-Way ANOVA 和Duncan’s post hoc test (P＜0.05)多重比較。

2 結(jié)果與分析

2.1 臭椿3 種提取物對(duì)TMV 的抑制活性

由圖1 可知，3 種提取物對(duì)TMV 的侵染均表現(xiàn)出保護(hù)、治療、鈍化、增殖抑制作用。 先施藥結(jié)果表明，SE、BE 對(duì)TMV 的初侵染都具有較強(qiáng)的保護(hù)作用，抑制率分別為63.64%、51.54%，顯著高于寧南霉素，LE 的抑制率低于寧南霉素。 后施藥結(jié)果表明，SE 對(duì)TMV 侵染的治療活性最好，抑制率為50.60%，顯著高于寧南霉素；其次為BE，與寧南霉素?zé)o顯著差異。 混合施藥結(jié)果表明，SE 對(duì)TMV 的鈍化作用最好，抑制率為60.01%，顯著高于寧南霉素，LE 和BE 均比寧南霉素低。 離體試驗(yàn)結(jié)果表明，3 個(gè)提取物的抑制率都高于寧南霉素，抑制率在43.47%～79.33%之間，LE 與寧南霉素?zé)o顯著差異，其余都顯著高于寧南霉素。

圖1 臭椿不同部位提取物對(duì)TMV 侵染的抑制作用

2.2 臭椿枝葉石油醚提取物(LE)餾分對(duì)TMV的抑制活性

由表1 可知，除了餾分LE.8，其余餾分對(duì)TMV 都具有一定的抑制作用。 先施藥結(jié)果表明，餾分LE.3、LE.5 對(duì)TMV 的初侵染具有較好的保護(hù)作用，抑制率分別為54.99%、46.22%，顯著高于陽(yáng)性對(duì)照寧南霉素，餾分LE.2、LE.4、LE.6、LE.12的抑制率與寧南霉素?zé)o顯著差異；經(jīng)分離后得到的餾分LE.2、LE.3、LE.4、LE.5、LE.6、LE.12 的保護(hù)作用都比LE 原液好。 后施藥結(jié)果表明，除了餾分LE.8、LE.10 沒(méi)有活性，其余餾分對(duì)TMV 都具有一定的治療作用，抑制率在20. 48% ～36.17%，但均低于寧南霉素；餾分LE.9 對(duì)TMV 侵染的治療作用最好，且比LE 活性好。 混合施藥結(jié)果表明，餾分LE.8 對(duì)TMV 無(wú)鈍化作用，其余餾分的抑制率介于27.30%～51.99%，鈍化作用最好的為L(zhǎng)E.11，顯著高于寧南霉素，LE.10 與寧南霉素?zé)o顯著差異；除了餾分LE.1、LE.6 外，其余餾分活性均高于LE。 增殖抑制作用結(jié)果顯示，除了餾分LE.8 對(duì)TMV 的體外增殖沒(méi)有抑制作用外，其余餾分的抑制率介于6.87%～41.66%，均低于寧南霉素和LE，抑制率最好的為L(zhǎng)E.3，與寧南霉素和LE 無(wú)顯著差異。

表1 臭椿枝葉石油醚提取物餾分對(duì)TMV 的抑制率(%)

2.3 臭椿種子石油醚提取物(SE)餾分對(duì)TMV的抑制活性

由表2 可知，SE 的12 個(gè)餾分對(duì)TMV 都具有一定的抑制作用。 先施藥結(jié)果表明，所有餾分對(duì)TMV 的初侵染都具有一定的保護(hù)作用，餾分SE.4、SE.6、SE.9 對(duì)TMV 的抑制活性最好，抑制率分別為71.96%、58.74%、67.84%，顯著高于寧南霉素，其余餾分的抑制率介于20.42%～46.52%，SE.4、SE.9 的活性高于SE 的。 后施藥結(jié)果表明，除了餾分SE.11，其余餾分對(duì)TMV 的侵染都有治療作用，餾分SE.1、SE.5 的活性較好，與SE 和寧南霉素?zé)o顯著差異，其余餾分的抑制率介于15.77%～46.09%。 混合施藥結(jié)果表明，SE.10、SE.11、SE.12 對(duì)TMV 的鈍化作用最好，抑制率分別為63.62%、72.18%、76.25%，顯著高于SE 和寧南霉素。 增殖抑制作用結(jié)果顯示，除了SE.3、SE.6，其余餾分對(duì)TMV 的體外增殖都具有一定的抑制作用，抑制率介于12.39%～43.34%，均低于SE 和寧南霉素。

表2 臭椿種子石油醚提取物餾分對(duì)TMV 的抑制率(%)

2.4 臭椿樹(shù)皮乙醇提取物(BE)餾分對(duì)TMV 的抑制活性

由表3 可知，從BE 中分離得到的17 個(gè)餾分對(duì)TMV 都具有一定的抑制作用。 先施藥結(jié)果表明，餾分BE.10 對(duì)TMV 初侵染的保護(hù)作用最好，抑制率為54.25%，顯著高于寧南霉素，與BE 無(wú)顯著差異，BE.1、BE.2、BE.12 與寧南霉素?zé)o顯著差異。 后施藥結(jié)果表明，餾分BE.5、BE.8 對(duì)TMV的治療作用最好，顯著高于BE 和寧南霉素，抑制率分別為58.67%、62.32%，其余餾分的抑制率介于16.56%～38.49%之間。 混合施藥結(jié)果表明，除了餾分BE.6、BE.15，其余餾分對(duì)TMV 都具有一定的鈍化作用，但都低于BE 和寧南霉素，抑制率介于7.42%～41.51%之間。 增殖抑制作用結(jié)果表明，BE.10 對(duì)TMV 體外增殖的抑制活性最好，達(dá)到了81.25%，與BE 無(wú)顯著差異，BE.11、BE.13 的抑制活性也較好，顯著高于寧南霉素。

3 討論與結(jié)論

煙草花葉病毒(Tobacco mosaic virus，TMV)病是由TMV 引起的一種系統(tǒng)侵染性病害，在世界各煙草種植區(qū)均有發(fā)生，每年造成的農(nóng)業(yè)經(jīng)濟(jì)損失相當(dāng)巨大，目前還未開(kāi)發(fā)出理想藥劑[17]，尋找新型抗TMV 藥物仍是目前的研發(fā)重點(diǎn)和難點(diǎn)。 植物源農(nóng)藥作為生物農(nóng)藥的重要組成部分，因其具有高效、低毒或無(wú)毒、低殘留、選擇性高、有害物質(zhì)一般很難對(duì)其產(chǎn)生抗性、易和其他農(nóng)藥相混配等優(yōu)點(diǎn)[18]，倍受全世界農(nóng)藥研究及應(yīng)用部門(mén)的廣泛重視。 自第一個(gè)植物病毒抑制物從商陸(Phytolacca acinosa)中發(fā)現(xiàn)以來(lái)[19]，植物源抗病毒活性物質(zhì)引起了研究者們的廣泛關(guān)注，已成為研究熱點(diǎn)之一。

近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)，臭椿提取物具有較高的抗TMV 活性[20]，之后一些學(xué)者開(kāi)始研究臭椿中化學(xué)成分的抗 TMV 活性， 取得了一定的成果[13，15，21-24]，但主要集中在正丁醇、乙酸乙酯提取物，對(duì)臭椿各個(gè)部位的提取物抗煙草花葉病毒活性成分研究未見(jiàn)有相關(guān)報(bào)道。 本研究在此基礎(chǔ)上對(duì)臭椿枝葉石油醚提取物、種子石油醚提取物、樹(shù)皮乙醇提取物進(jìn)行活性追蹤發(fā)現(xiàn)，這3 個(gè)部位提取物對(duì)TMV 都具有抑制作用，臭椿種子石油醚提取物、樹(shù)皮乙醇提取物對(duì)TMV 的侵染都具有較好的保護(hù)作用，顯著高于寧南霉素(44.10%)，抑制率分別為63.64%、51.54%；臭椿種子石油醚提取物對(duì)TMV 侵染的治療作用、鈍化作用最好，抑制率分別為50.60%、60.01%；臭椿樹(shù)皮乙醇提取物對(duì)TMV 的增殖抑制作用效果最好，抑制率為79.33%，表明臭椿在極性較小的石油醚提取物中也存在抗煙草花葉病毒活性顯著的活性物質(zhì)，并且不同部位提取物對(duì)TMV 的抑制作用不同。 提取物各餾分抗煙草花葉病毒活性結(jié)果表明，從保護(hù)活性來(lái)看，臭椿枝葉石油醚提取物餾分LE.3、LE.5、臭椿種子石油醚提取物餾分SE.4、SE.6、SE.9及臭椿樹(shù)皮乙醇提取物餾分BE.10 對(duì)TMV的初侵染具有較好的保護(hù)作用，顯著高于寧南霉素；從治療活性看，臭椿樹(shù)皮乙醇提取物餾分BE.5、BE.8顯著高于寧南霉素，相比臭椿枝葉和種子的石油醚提取物餾分，臭椿樹(shù)皮乙醇提取物餾分中分離出對(duì)煙草花葉病毒具有顯著治療作用的活性成分的可能性更大；從鈍化活性看，臭椿種子石油醚提取物餾分SE.10、SE.11、SE.12 顯著高于寧南霉素，表明對(duì)TMV 具有顯著鈍化作用的活性物質(zhì)主要集中在臭椿種子石油醚提取物；從增殖抑制活性看，臭椿樹(shù)皮乙醇提取物餾分BE.10、BE.11、BE.13 顯著高于寧南霉素，表明抑制TMV增殖的活性成分主要集中在臭椿樹(shù)皮乙醇提取物中。 結(jié)果顯示，臭椿枝葉石油醚提取物中含有對(duì)TMV 侵染具有顯著保護(hù)作用的活性物質(zhì)；臭椿種子石油醚提取物中含有對(duì)TMV 具有顯著保護(hù)、鈍化作用的活性物質(zhì)，臭椿樹(shù)皮乙醇提取物中含有對(duì)TMV 具有顯著保護(hù)、治療、體外增殖抑制作用的活性物質(zhì)。

植物提取物含有多種化學(xué)成分，不同部位的化學(xué)成分也不一樣[9]。 植物的抗病毒作用可能為某一單一化合物，也可能是多種化學(xué)成分綜合作用的效果。 梁紅艷等[25]在從木瓜中分離抗TMV 活性成分的過(guò)程中發(fā)現(xiàn)，隨著抗TMV 活性成分的逐步分離，組分的抗TMV 活性呈下降趨勢(shì)。 本研究發(fā)現(xiàn)，隨著對(duì)臭椿中抗TMV 活性組分的逐步分離，不同的餾分對(duì)TMV 表現(xiàn)出不同的抑制作用，餾分與原樣之間、餾分與餾分之間存在顯著差異，餾分抗TMV 的活性顯著高于或低于臭椿提取物原樣。 一方面可能是分離過(guò)程中活性成分被進(jìn)一步純化，所以對(duì)TMV 表現(xiàn)出更好的抑制作用，另一方面則是活性組分在被純化的過(guò)程中，剩余的餾分流失了抗TMV 顯著的活性成分，或者抗TMV 活性可能是多種成分協(xié)同作用的結(jié)果，所以逐步分離后抗TMV 作用呈現(xiàn)下降趨勢(shì)。

本研究以臭椿不同部位提取物為研究對(duì)象，對(duì)臭椿的枝葉、種子、樹(shù)皮提取物的抗TMV 活性組分進(jìn)行追蹤，發(fā)現(xiàn)臭椿中不同部位抗TMV 活性顯著的餾分。 今后將對(duì)這些餾分中的化學(xué)成分進(jìn)行分析和進(jìn)一步分離，為進(jìn)一步研究臭椿抗煙草花葉病毒提供理論依據(jù)，也為今后進(jìn)一步開(kāi)發(fā)綠色無(wú)公害、環(huán)境友好的植物源生物農(nóng)藥提供理論基礎(chǔ)和科學(xué)依據(jù)。