酸奶、液態(tài)奶三聚氰胺基質(zhì)效應(yīng)的研究及消除

景贊，呂雪梅，劉超

樂(lè)山市食品藥品檢驗(yàn)檢測(cè)中心（樂(lè)山 614000）

三聚氰胺（melamine）俗稱密胺、蛋白精、蜜胺，是一種三嗪類含氮雜環(huán)有機(jī)化合物[1]，常用作化工原料。因其對(duì)人體有害，故不可用于食品加工或作為食品添加劑。

基質(zhì)效應(yīng)是指檢測(cè)系統(tǒng)檢測(cè)樣品中的分析物時(shí)，處于分析物周圍的所有非分析物質(zhì)對(duì)分析物參與反應(yīng)的影響。基質(zhì)效應(yīng)產(chǎn)生的原因與4個(gè)主要因素的相互作用密切相關(guān)，即儀器的設(shè)計(jì)、試劑的組成成分、測(cè)試方法的原理、質(zhì)控材料的組成及處理技術(shù)。液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)是將分離性能優(yōu)異液相色譜串聯(lián)專屬、能提供相對(duì)分子量和結(jié)構(gòu)信息的質(zhì)譜法的一種快速、靈敏、準(zhǔn)確的現(xiàn)代分離分析技術(shù)，而且被廣泛用于定量分析復(fù)雜基質(zhì)中的物質(zhì)[2-4]。串聯(lián)質(zhì)譜特異性強(qiáng)，同時(shí)數(shù)據(jù)表明質(zhì)譜的檢測(cè)需要避免基質(zhì)效應(yīng)[5-9]，否則會(huì)影響其檢測(cè)準(zhǔn)確性。

試驗(yàn)采取內(nèi)標(biāo)法[10-12]消除三聚氰胺的基質(zhì)效應(yīng)，內(nèi)標(biāo)法是一種間接或相對(duì)的校準(zhǔn)方法。在測(cè)定樣品中三聚氰胺含量時(shí)，加入三聚氰胺內(nèi)標(biāo)物質(zhì)以校準(zhǔn)和消除基質(zhì)效應(yīng)對(duì)分析結(jié)果產(chǎn)生的影響，以提高分析結(jié)果的準(zhǔn)確度。

試驗(yàn)引入單因素方差分析及基質(zhì)效應(yīng)的評(píng)價(jià)方法具體量化液質(zhì)聯(lián)用檢測(cè)酸奶、液態(tài)奶中三聚氰胺基質(zhì)效應(yīng)大小，為研究和消除因檢測(cè)過(guò)程引起的基質(zhì)效應(yīng)提供量化指標(biāo)。

1 材料與方法

1.1 儀器與設(shè)備

ME104E電子天平（梅特勒-托利多儀器有限公司）；DGU20A-API4500液質(zhì)聯(lián)用儀（美國(guó)AB SCIEX公司）；HSC-12A氮吹儀（北京佳航博創(chuàng)科技有限公司）；VM24固相萃取儀（天津艾杰爾科技有限公司）；HT190R高速臺(tái)式冷凍離心機(jī)（湖南湘儀實(shí)驗(yàn)室儀器開(kāi)發(fā)有限公司）；SHA-B水浴恒溫振蕩器（長(zhǎng)州冠軍儀器制造頭有限公司）；KQ3200E超聲波清洗機(jī)（昆山市超聲儀器有限公司）；WCX前處理小柱[60 mg/3 mL沃特世科技（上海）有限公司]、Cleanert PCX前處理小柱（60 mg/3 mL天津艾杰爾科技有限公司）、Bond Elut Plexa PCX前處理小柱（60 mg/3 mL安捷倫科技有限公司）。

1.2 材料與試劑

乙腈、甲醇（均為色譜純）；三氯乙酸（分析純）；液態(tài)奶（金典、特侖蘇、伊利純牛奶、蒙牛純牛奶、三元純牛奶、光明乳業(yè)、旺仔、新希望、圣牧、QQ星）和酸奶（安慕希、純甄、莫斯利安、君樂(lè)寶、光明乳業(yè)、德亞、冠益乳、新希望初心、簡(jiǎn)愛(ài)、人養(yǎng)一頭牛），均購(gòu)于超市；三聚氰胺標(biāo)準(zhǔn)品（99.4%，批號(hào)G976694，Dr.Ehrenstorfer GmbH）；三聚氰胺-13C3（100 μg/mL，壇墨質(zhì)檢科技股份有限公司）。

1.3 樣品處理

采用GB/T 22388——2008《原料乳與乳制品中三聚氰胺檢測(cè)方法》“4.4.1.1”提取、“4.4.2”凈化。

1.4 三聚氰胺標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液

準(zhǔn)確稱取10 mg三聚氰胺標(biāo)準(zhǔn)品至10 mL容量瓶中，用50%甲醇水溶解并定容至刻度，混勻后備用。

1.5 三聚氰胺標(biāo)準(zhǔn)及內(nèi)標(biāo)中間液

1.5.1 三聚氰胺標(biāo)準(zhǔn)中間液

準(zhǔn)確移取25 μL三聚氰胺標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液至25 mL容量瓶中，用50%甲醇水溶解并定容至刻度，混勻后備用。

1.5.2 三聚氰胺內(nèi)標(biāo)中間液

準(zhǔn)確移取250 μL三聚氰胺標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液至25 mL容量瓶中，用50%甲醇水溶解并定容至刻度，混勻后備用。

1.6 液相色譜-質(zhì)譜/質(zhì)譜條件

液相色譜及質(zhì)譜條件參照GB/T 22388——2008。

1.7 基質(zhì)效應(yīng)評(píng)價(jià)方法

運(yùn)用定量測(cè)定空白基質(zhì)提取液與純?nèi)軇┲型瑵舛确治鑫锏碾x子響應(yīng)程度，通過(guò)式（1）計(jì)算二者比值評(píng)價(jià)基質(zhì)效應(yīng)。

式中：A和B為基質(zhì)溶液和純?nèi)軇┓治鑫锏姆迕娣e。A/B＜80%，對(duì)分析物的響應(yīng)產(chǎn)生抑制作用；A/B＞120%，對(duì)分析物的響應(yīng)產(chǎn)生增強(qiáng)作用；80%＜A/B＜120%，不存在基質(zhì)效應(yīng)。

1.8 統(tǒng)計(jì)分析

所有數(shù)據(jù)采用SPSS 20.0軟件進(jìn)行單因素方差分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 取樣量對(duì)基質(zhì)效應(yīng)的影響

10種液態(tài)奶和10種酸奶每個(gè)樣品分別取樣品0.50 g和1.00 g（精確至0.01 g）按照1.3樣品處理，按照1.6測(cè)定并記錄峰面積。結(jié)果見(jiàn)表1，圖1和圖2。

圖1 取樣量對(duì)酸奶三聚氰胺ME的影響

圖2 取樣量對(duì)液態(tài)奶三聚氰胺ME的影響

表1 取樣量對(duì)三聚氰胺ME的影響

表1為取樣量對(duì)酸奶、液態(tài)奶中分析三聚氰胺ME的統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果。結(jié)合圖1和圖2可知，取樣量對(duì)分析酸奶、液態(tài)奶中三聚氰胺ME存在顯著性差異。因此取樣量是影響液態(tài)奶、酸奶中三聚氰胺ME的主要因素之一。由圖1進(jìn)一步可以得出，取樣量0.50 g和1.00 g對(duì)酸奶中三聚氰胺的ME分別為21.4%～32.5%和10.3%～23.1%。由圖2進(jìn)一步可以得出，取樣量0.50和1.00 g對(duì)液態(tài)奶中三聚氰胺的ME分別為23.6%～39.0%和14.7%～27.4%。

2.2 溶劑種類對(duì)基質(zhì)效應(yīng)的影響

10種液態(tài)奶和10種酸奶每個(gè)樣品分別取4份樣品各1.00 g（精確至0.01 g），每種液態(tài)奶和酸奶的每份樣品依次加入10 mL水、6 mL三氯乙酸（1%）和4 mL水、10 mL三氯乙酸（1%）、8 mL三氯乙酸（1%）和2 mL乙腈，每個(gè)樣品超聲提取10 min后，按照1.3處理，按照1.6測(cè)定并記錄數(shù)據(jù)。結(jié)果見(jiàn)表2，圖3和圖4。

圖3 不同溶劑對(duì)酸奶三聚氰胺ME的影響

圖4 不同溶劑對(duì)液態(tài)奶三聚氰胺ME的影響

表2 溶劑種類對(duì)ME的影響

表2為不同溶劑對(duì)酸奶、液態(tài)奶中三聚氰胺ME的統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果。結(jié)合圖3和圖4可知，溶劑種類對(duì)分析物的ME差異性除三氯乙酸與三氯乙酸-乙腈體積比4∶1之間無(wú)顯著性差異，其余均有顯著差異。因此溶劑種類是影響液態(tài)奶中三聚氰胺ME的主要因素之一。由圖3進(jìn)一步可以得出，水、乙腈-水體積比3∶2、三氯乙酸和三氯乙酸-乙腈體積比4∶1對(duì)酸奶中三聚氰胺的ME分別為25.9%～36.7%，19.0%～31.3%，6.5%～19.0%及10.0%～22.7%溶劑。由圖4進(jìn)一步可以得出，乙腈∶水=3∶2、三氯乙酸和三氯乙酸∶乙腈=4∶1對(duì)液態(tài)奶中三聚氰胺的ME分別為34.8%～46.7%、25.5%～37.6%、12.7%～25.9%及14.3%～27.3%溶劑。提取溶劑種類對(duì)分析物的ME差異性除三氯乙酸與三氯乙酸∶乙腈= 4∶1無(wú)顯著性差異。其余均有顯著差異。

2.3 溶劑用量對(duì)基質(zhì)效應(yīng)的影響

10種液態(tài)奶和10種酸奶每個(gè)樣品分別取3份樣品各1.00 g（精確至0.01 g），每份樣分別加入4 mL三氯乙酸（1%）和1 mL乙腈、8 mL三氯乙酸（1%）和2 mL乙腈、12 mL三氯乙酸（1%）和3 mL乙腈。剩余按照1.3處理，按照1.6測(cè)定并記錄數(shù)據(jù)。

表3為溶劑用量對(duì)酸奶、液態(tài)奶中三聚氰胺ME的統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果。結(jié)合圖5和圖6可知，溶劑用量對(duì)分析液態(tài)奶、酸奶中三聚氰胺ME除10 mL與15 mL無(wú)顯著性差異，其余均存在顯著性差異。因此取樣量是影響液態(tài)奶、酸奶中三聚氰胺ME的主要因素之一。由圖5進(jìn)一步可以得出，溶劑用量為5，10和15 mL對(duì)液態(tài)奶中三聚氰胺的ME分別為21.5%～34.3%，10.8%～23.7%和7.5%～20.4%。由圖6進(jìn)一步可以得出，溶劑用量為5，10和15 mL對(duì)液態(tài)奶中三聚氰胺的ME分別為28.8%～41.9%，14.2%～27.5%和11.6%～24.7%。

圖5 溶劑用量對(duì)酸奶三聚氰胺ME的影響

圖6 溶劑用量對(duì)液態(tài)奶三聚氰胺ME的影響

表3 溶劑用量對(duì)ME的影響

2.4 不同濃度三聚氰胺對(duì)基質(zhì)效應(yīng)的影響

分別取10種液態(tài)奶和10種酸奶各3份樣品1.00 g（精確至0.01 g），每種液態(tài)奶的每份樣品分別編號(hào)為1號(hào)（液態(tài)奶、酸奶名稱），2號(hào)（液態(tài)奶、酸奶名稱）和3號(hào)（液態(tài)奶、酸奶名稱）。按照1.3處理。處理后取0.1 μL三聚氰胺標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液加入1號(hào)（液態(tài)奶、酸奶名稱）搖勻；取0.5 μL三聚氰胺標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液加入2號(hào)（液態(tài)奶、酸奶名稱）搖勻；取1.0 μL三聚氰胺標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液加入3號(hào)（液態(tài)奶、酸奶名稱）搖勻。按照1.6測(cè)定并記錄數(shù)據(jù)。

表4為不同濃度三聚氰胺對(duì)酸奶、液態(tài)奶中三聚氰胺ME的統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果。結(jié)合表4，圖7和圖8可知，不同濃度三聚氰胺對(duì)分析液態(tài)奶、酸奶中三聚氰胺ME不存在顯著性差異。由圖7進(jìn)一步可以得出，10，50和100 ng/mL不同濃度三聚氰胺對(duì)酸奶中三聚氰胺的ME分別為12.5%～25.0%，14.6%～23.6%和12.2%～20.4%。由圖8進(jìn)一步可以得出，0，50和100 ng/mL不同濃度三聚氰胺1對(duì)液態(tài)奶中三聚氰胺的ME分別為14.2%～27.1%，15.5%～26.6%和15.0%～27.5%。

圖7 不同濃度三聚氰胺對(duì)酸奶三聚氰胺ME的影響

圖8 不同濃度三聚氰胺對(duì)液態(tài)奶三聚氰胺ME的影響

表4 不同濃度三聚氰胺對(duì)ME的影響

2.5 SPE小柱對(duì)基質(zhì)效應(yīng)的影響

分別取10種液態(tài)奶和10種酸奶各4份平行樣品1.00 g（精確至0.01 g），每份樣品過(guò)前處理小柱時(shí)分別為待凈化液不過(guò)柱、待凈化液過(guò)WCX前處理小柱、待凈化液過(guò)Cleanert PCX前處理小柱、待凈化液過(guò)Bond Elut Plexa PCX前處理小柱。按照1.6測(cè)定并記錄數(shù)據(jù)。

表5為SPE小柱對(duì)酸奶、液態(tài)奶中三聚氰胺ME的統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果。結(jié)合表5與圖9、圖10可知不過(guò)住與過(guò)SPE小柱之間存在顯著性差異；過(guò)SPE小柱之間不存在顯著性差異。由圖9進(jìn)一步可以得出SPE小柱類型：不過(guò)柱、WCX、Cleanert PCX和Bond Elut Plexa PCX對(duì)酸奶中三聚氰胺的ME，分別為4.3%～20.7%、10.4%～23.3%、9.9%～22.7%和9.9%～23.1%。由圖9進(jìn)一步可以得出SPE小柱類型中，不過(guò)柱、WCX、Cleanert PCX和Bond Elut Plexa PCX對(duì)液態(tài)奶中三聚氰胺的ME分別為9.3%～22.2%、14.7%～27.6%、14.3%～27.0%和14.3%～27.4%。

圖9 SPE小柱對(duì)酸奶三聚氰胺ME的影響

圖10 SPE小柱對(duì)液態(tài)奶三聚氰胺ME的影響

表5 SPE小柱對(duì)液態(tài)奶、酸奶三聚氰胺ME的影響

表6 三聚氰胺線性方程

2.6 基質(zhì)效應(yīng)的消除

繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。分別移取不同體積的三聚氰胺中間液及相同體積的三聚氰胺標(biāo)準(zhǔn)中間液至6個(gè)25 mL容量瓶中，用50%甲醇水定容至刻度，得到質(zhì)量濃度依次為10，20，40，80，160和200 ng/mL的三聚氰胺標(biāo)準(zhǔn)工作液，每毫升三聚氰胺標(biāo)準(zhǔn)工作液中含有三聚氰胺內(nèi)標(biāo)濃度為20 ng/mL。以三聚氰胺濃度為橫坐標(biāo)作圖，三聚氰胺峰面積/內(nèi)標(biāo)峰面積為縱坐標(biāo)得標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程。

稱量9份空白樣品至9個(gè)50 mL離心管中，加入20 μL內(nèi)標(biāo)中間溶液，分別加入25.0，50.0和100.0 μL三聚氰胺標(biāo)準(zhǔn)中間溶液，做三水平三平行回收試驗(yàn)，其余步驟按1.3。

將加標(biāo)三聚氰胺峰面積/內(nèi)標(biāo)峰面積代入，得到三聚氰胺線性的回歸方程y=0.634x+0.185 2，得出計(jì)算濃度，數(shù)據(jù)如表7和表8。

表7 酸奶樣品三聚氰胺回收率

表8 液態(tài)奶樣品三聚氰胺回收率

從表7與表8可知酸奶、液態(tài)奶在低、中、高3個(gè)水平均很大程度上降低基質(zhì)效應(yīng)，回收率在100%～110%之間。因此內(nèi)標(biāo)法對(duì)三聚氰胺ME的消除具有顯著效果。

3 結(jié)論

從取樣量、溶劑種類、溶劑用量、不同濃度三聚氰胺和SPE小柱這5個(gè)因素研究對(duì)液態(tài)奶、酸奶中三聚氰胺的基質(zhì)效應(yīng)。結(jié)果表明，對(duì)液態(tài)奶、酸奶三聚氰胺基質(zhì)效應(yīng)的影響相差較為明顯。可能是不同公司對(duì)液態(tài)奶、酸奶的配方不同、制作工藝不同、采用的配方及牛奶原料種類不同，因此液態(tài)奶、酸奶中三聚氰胺的基質(zhì)效應(yīng)起伏變化比較明顯。單因素方差分析表明：取樣量對(duì)分析的ME差異顯著，提取溶劑種類對(duì)分析物的ME差異性除三氯乙酸與三氯乙酸-乙腈體積比4∶1之間沒(méi)有顯著性差異，不存在基質(zhì)效應(yīng)；提取溶劑用量10 mL與15 mL之間差不存基質(zhì)效應(yīng)；不同濃度三聚氰胺不存在基質(zhì)效應(yīng)；過(guò)SPE小柱之間不存在基質(zhì)效應(yīng)；其余因素均存在明顯基質(zhì)效應(yīng)。