基于超快速VPCR熒光可視化檢測技術(shù)的小檗皮及其藏成藥中原料藥的真?zhèn)舞b別研究

李紅穎，宋文俊，李慧林，張繼晨，范 剛，陳 蓉

基于超快速VPCR熒光可視化檢測技術(shù)的小檗皮及其藏成藥中原料藥的真?zhèn)舞b別研究

李紅穎1，宋文俊2，李慧林1，張繼晨3，范 剛2*，陳 蓉2*

1. 成都中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，四川 成都 611137 2. 成都中醫(yī)藥大學(xué)民族醫(yī)藥學(xué)院，四川 成都 611137 3. 四川天府新區(qū)新經(jīng)濟(jì)發(fā)展研究中心，四川 成都 610299

建立藏藥小檗皮及藏成藥中小檗皮特異性DNA的超快速熒光可視化檢測方法，實(shí)現(xiàn)對小檗皮藥材及藏成藥中小檗皮的快速鑒別。將小檗皮及其混淆品的ITS2序列進(jìn)行比對，篩選出小檗皮藥材特異性DNA序列；針對該序列設(shè)計(jì)小檗皮特異性引物，建立小檗皮藥材以及藏成藥中小檗皮特異性DNA的超快速VPCR擴(kuò)增體系；后將該擴(kuò)增體系與SYBR Green I熒光染料相結(jié)合，實(shí)現(xiàn)對擴(kuò)增產(chǎn)物的熒光可視化檢測；同時(shí)對該體系的特異性、靈敏度以及在真實(shí)樣本中的適用性進(jìn)行考察。該體系可以在40 min內(nèi)完成對小檗皮以及藏成藥中小檗皮特異性DNA的擴(kuò)增及熒光可視化檢測；檢測限低至10 pg/μL；對16個(gè)批次的小檗皮藥材進(jìn)行分析，其中15個(gè)批次的樣本產(chǎn)生陽性信號鑒定為小檗皮，與測序結(jié)果100%一致，1個(gè)批次的樣本產(chǎn)生陰性信號，該樣本經(jīng)通用引物測序鑒定為黃柏；對3種含有小檗皮的藏成藥進(jìn)行分析，3個(gè)樣本均產(chǎn)生陽性信號。所建方法縮短了檢測時(shí)間，并且特異性良好，靈敏度高，可以對小檗皮及其藏成藥中小檗皮進(jìn)行快速、準(zhǔn)確的可視化鑒別。

小檗皮；VPCR；快速擴(kuò)增；可視化檢測；藏成藥

藏醫(yī)藥是中國傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)寶庫的重要組成部分，在藏族幾千年的發(fā)展歷史當(dāng)中一直發(fā)揮著重要的作用，由于生長環(huán)境的特殊性，藏藥通常有著特殊的療效，吸引了國內(nèi)外學(xué)者的廣泛關(guān)注。小檗皮（藏文譯音：給爾馴、吉爾哇、杰星等）始載于《四部醫(yī)典》[1]，是藏醫(yī)臨床治療“京尼薩庫”?。ㄌ悄虿。┘捌洳l(fā)癥的常用藥[2]，現(xiàn)代藥理學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，小檗皮能改善糖尿病腎病的病理變化和藥效學(xué)指標(biāo)[3-6]。小檗皮目前尚未被收入《中華人民共和國衛(wèi)生部藥品標(biāo)準(zhǔn)·藏藥分冊》標(biāo)準(zhǔn)正文，僅在標(biāo)準(zhǔn)附錄中規(guī)定其來源為小檗科植物甘肅小檗Schneid.及其同屬多種植物的干燥內(nèi)皮。此外，小檗皮還常作為原料藥在多種藏成藥中使用，如四味姜黃湯散、八味小檗皮散的處方中均使用了大劑量的小檗皮[7]。

小檗屬植物約有500余種，廣泛分布于世界各地，我國大約有200種，根據(jù)文獻(xiàn)記載和實(shí)際調(diào)查研究發(fā)現(xiàn)[8]，我國目前藥材市場、藏醫(yī)院和藏藥廠使用的小檗皮主流品種為甘肅小檗Schneid.、鮮黃小檗Maxim.、匙葉小檗Schneid.以及刺紅珠Franch.。由于蕓香科黃皮樹Schneid.的干燥樹皮黃柏與小檗皮的外形十分相似，市場上常出現(xiàn)以黃柏?fù)饺胄￠奁せ煊玫那闆r，嚴(yán)重影響了藥材的質(zhì)量和臨床療效。此外，小檗皮作為一種常用藏藥材，在多種藏成藥中使用，藏成藥通常是由幾味甚至幾十味藥材組成，化學(xué)成分十分復(fù)雜，藥材粉碎以后也不能從外觀性狀上進(jìn)行鑒別，所以藏成藥中原料藥的真?zhèn)舞b別則更加充滿挑戰(zhàn)。

DNA分子非常穩(wěn)定，不受藥材生長環(huán)境、采摘時(shí)間、產(chǎn)地等影響，可以清晰準(zhǔn)確的提供藥材或者成藥當(dāng)中原料藥的物種信息，以DNA條形碼、位點(diǎn)特異性PCR為代表的DNA分子鑒定技術(shù)已經(jīng)被廣泛地應(yīng)用于多種中藥材[9-12]以及中成藥中原料藥的真?zhèn)舞b別[13-14]；川貝母、烏梢蛇、蘄蛇、石斛等藥材的PCR鑒別法也已被《中國藥典》2020年版收載[15]。目前PCR擴(kuò)增常用的方法包括三步法和兩步法（圖1），三步法在變性、退火、延伸3個(gè)溫度點(diǎn)分別停留一定的時(shí)間來確保核酸分子的擴(kuò)增；兩步法則是將退火和延伸2個(gè)步驟合二為一，但在高低兩個(gè)溫度點(diǎn)仍舊保持15～45 s的停留時(shí)間；課題組在前期的研究中發(fā)現(xiàn)，PCR過程并不需要在固定溫度點(diǎn)的時(shí)間停留，反應(yīng)體系只需要在高低2個(gè)溫度點(diǎn)之間進(jìn)行往復(fù)升降溫，擴(kuò)增過程就能夠在動(dòng)態(tài)的升降溫過程中完成。這樣的加熱方式可以將DNA擴(kuò)增的時(shí)間從原來的1 h以上縮短至20～30 min以內(nèi)，由于體系的溫度-時(shí)間曲線圖中呈現(xiàn)多個(gè)“V”型，所以此方法被命名為“VPCR”[16-18]。SYBR Green I是一種靈敏度非常高的雙鏈DNA熒光染料，在游離狀態(tài)下，SYBR Green I發(fā)出微弱的熒光，與雙鏈DNA結(jié)合后，熒光大大增強(qiáng)，在紫外燈下呈現(xiàn)肉眼可見的綠色熒光。所以本研究將VPCR擴(kuò)增與SYBR Green I熒光染料相結(jié)合，通過VPCR實(shí)現(xiàn)小檗皮特異性DNA的快速擴(kuò)增，再將SYBR Green I染料加入到VPCR擴(kuò)增產(chǎn)物中，實(shí)現(xiàn)對擴(kuò)增產(chǎn)物的熒光可視化檢測[19-20]。該體系反應(yīng)時(shí)間短，整個(gè)擴(kuò)增和檢測過程可在40 min內(nèi)完成，特異性好，靈敏度高，不僅可以應(yīng)用于小檗皮藥材的真?zhèn)舞b別，還可以應(yīng)用于藏成藥中小檗皮的定性鑒別，期望可以對制藥企業(yè)產(chǎn)品的質(zhì)量控制、監(jiān)管部門的快速檢測提供參考。

圖1 3種PCR體系的溫度-時(shí)間曲線圖

1 材料與儀器

1.1 材料

本研究建立方法時(shí)所使用的4批小檗皮基原植物由成都中醫(yī)藥大學(xué)范剛教授鑒定且經(jīng)DNA條形碼驗(yàn)證，用于方法適用性考察的16批小檗皮藥材以及3種含有小檗皮的藏成藥購自各大藏醫(yī)院及藥材市場，所有樣品詳細(xì)信息見表1，小檗皮藥材、混淆品黃柏藥材、藏成藥照片見圖2。

表1 所用藥材及藏成藥信息

1～4-4種小檗皮基原植物 5～20-小檗皮待測藥材 21～23-待測藏成藥

1—4-four different original plants of5—20-the tested medicinal materials of21—23-the tested Tibetan patent medicine

圖2 小檗皮、黃柏藥材以及待測藏成藥

1.2 試劑與儀器

LifeTouch型基因擴(kuò)增儀（杭州博日科技股份有限公司），DYY-6C型電泳儀電源（北京六一生物科技有限公司），JY04S-3C型凝膠電泳成像系統(tǒng)（北京君意東方電泳設(shè)備有限公司），H1650-K型臺式微量高速離心機(jī)（湖南湘儀實(shí)驗(yàn)室儀器開發(fā)有限公司），S1010型掌上離心機(jī)（SCILOGEX），XW-80A型旋渦混合器（上海馳唐電子有限公司），ThermoCell MixingBlock型振蕩恒溫金屬浴（杭州博日科技股份有限公司），ZF-90型多功能暗箱式紫外透射儀（上海寶山顧村電光儀器廠）。

DNA聚合酶（貨號：AP111）購自北京全式金生物技術(shù)有限公司。Marker（貨號B500350）、瓊脂糖（A620014）、10 mmol/L dNTP Mixture Solution（B500056）和50×TAE緩沖液（B548101）均購于生工生物工程（上海）股份有限公司，50X TAE緩沖液使用前用H2O稀釋成1×的工作液。Goldview I型核酸染料（貨號：G8140）購于北京索萊寶科技有限公司。SYBR Green Ⅰ核酸染料（貨號：S7563）購于Invitrogen，使用前用DMSO稀釋成500×的工作液。引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成并純化（HAP純化），超純滅菌水溶解，?20 ℃保存。植物基因組DNA提取試劑盒（貨號：DE-06111）購于成都福際生物技術(shù)有限公司。

2 方法

2.1 DNA的提取

取藥材或藏成藥樣品適量，研磨均勻后分別置于1.5 mL離心管中，采用植物DNA提取試劑盒提取樣品DNA，利用超微量紫外可見分光光度計(jì)測定DNA提取液的濃度和純度，并用通用引物對成藥DNA模板的質(zhì)量進(jìn)行檢驗(yàn)。DNA提取液置于?20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

2.2 ITS2序列擴(kuò)增及檢測

將4種小檗皮基原植物和黃柏的DNA提取物用ITS2序列的通用引物[21]S2F（5’-ATGCGAT- ACTTGGTGTGAAT-3’）和S3R（5’-GACGCTT- CTCCAGACTACAAT-3’）進(jìn)行PCR擴(kuò)增。反應(yīng)總體系為25 μL，包括10×buffer緩沖液2.5 μL，10 mmol/L dNTP 0.5 μL，引物各1 μL，0.5 μL，DNA提取液1 μL，加滅菌水補(bǔ)足25 μL。藏成藥擴(kuò)增體系總體積仍為25 μL，其中將DNA提取液增加至2 μL。PCR反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性90 s；95 ℃變性10 s，55 ℃復(fù)性10 s，72 ℃延伸45 s，30個(gè)循環(huán)。反應(yīng)結(jié)束后取各PCR產(chǎn)物5 μL，與1 μL 6×DNA上樣緩沖液混合后點(diǎn)樣，在2%的瓊脂糖凝膠上進(jìn)行電泳，200 V電壓下電泳8 min，在凝膠成像儀下觀察并采集圖像，出現(xiàn)明亮清晰的條帶即為擴(kuò)增成功，將擴(kuò)增成功的PCR產(chǎn)物送至生工生物工程（上海）股份有限公司進(jìn)行雙向測序。

2.3 特異性引物的設(shè)計(jì)

利用LaserGene軟件中Megalign對測序得到的4種小檗皮及混淆品黃柏的ITS2序列進(jìn)行分析，根據(jù)序列對比結(jié)果找出其穩(wěn)定變異位點(diǎn)，采用Primer Premier 5.0軟件設(shè)計(jì)出能夠擴(kuò)增4種小檗皮藥材的特異性引物，同時(shí)經(jīng)過BLAST發(fā)現(xiàn)，小檗屬植物的序列相似度極高，本實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)的引物也可以擴(kuò)增同屬的其他多種小檗皮，即可應(yīng)用于其他同屬小檗皮藥材的鑒定。

2.4 VPCR熒光可視化檢測體系的建立

以“2.1”項(xiàng)下制備的DNA作為模板，采用小檗皮特異性引物進(jìn)行VPCR擴(kuò)增，反應(yīng)總體系為25 μL，包括10×buffer緩沖液2.5 μL，10 mmol/L dNTP 0.5 μL，引物各1 μL，0.5 μL，DNA 5 μL，加滅菌水補(bǔ)足25 μL。VPCR反應(yīng)體系：95 ℃預(yù)變性30 s；95 ℃變性0.1 s，55 ℃復(fù)性0.1 s，35個(gè)循環(huán)。反應(yīng)結(jié)束后取各PCR產(chǎn)物5 μL，與1 μL 6×DNA上樣緩沖液混合后點(diǎn)樣，在2%的瓊脂糖凝膠上進(jìn)行電泳，200 V電壓下電泳8 min，在凝膠成像儀下觀察并采集圖像；熒光可視化檢測則直接向PCR產(chǎn)物中加入1 μL 500×SYBR Green I型熒光染料，混勻，在365 nm紫外光下觀察并拍照記錄。

3 結(jié)果與分析

3.1 序列對比以及特異性引物的設(shè)計(jì)

4種基原植物和黃柏測序所得序列與GenBank中所登記序列一致，且對比結(jié)果顯示4種小檗皮之間的序列差異較小，但是與混淆品黃柏序列差異較大，比對結(jié)果如圖3所示。利用Primer Premier 5.0軟件，結(jié)合引物設(shè)計(jì)原則，設(shè)計(jì)出能夠同時(shí)擴(kuò)增4種小檗皮，但不能擴(kuò)增黃柏的特異性引物XBPa-F（5’-CCTAAATGATGGCCTCGA-3’）和XBPa-R（5’-ACAAGGGTTTGTACAGCT-3’），引物擴(kuò)增后片段大小為112 bp。

圖3 小檗皮主流品種和黃柏的ITS2序列分析

3.2 VPCR熒光可視化檢測體系的建立以及特異性考察

利用“2.4”項(xiàng)下的方法對我國使用的4個(gè)小檗皮主流品種（匙葉小檗、鮮黃小檗、甘肅小檗、刺紅珠）以及常見的混淆品黃柏的基因組DNA進(jìn)行擴(kuò)增和檢測，建立VPCR熒光可視化檢測體系，同時(shí)考察體系的特異性。實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖4所示，4種小檗皮在112 bp處可出現(xiàn)清晰明亮的特異性擴(kuò)增條帶，黃柏樣品不出現(xiàn)擴(kuò)增條帶；在熒光檢測圖中，只有4種小檗皮樣品發(fā)出綠色熒光，黃柏樣品不出現(xiàn)熒光，表明VPCR熒光檢測體系特異性良好，結(jié)果直觀，可以明確區(qū)分小檗皮及常見混淆品黃柏。

NC-陰性對照 1-黃柏 2-匙葉小檗 3-鮮黃小檗 4-甘肅小檗 5-刺紅珠 M-Marker

3.3 VPCR熒光可視化檢測體系的靈敏度考察

將等量的4種小檗皮DNA提取液充分混勻，稀釋成不同質(zhì)量濃度的提取液，利用小檗皮特異性引物分別對質(zhì)量濃度為1～1×104pg/μL的小檗皮DNA提取液進(jìn)行VPCR熒光檢測，檢測結(jié)果如圖5所示，當(dāng)模板質(zhì)量濃度為100～1×104pg/μL時(shí)，凝膠電泳圖中出現(xiàn)清晰擴(kuò)增條帶，熒光檢測圖中出現(xiàn)綠色熒光，當(dāng)DNA模板濃度降至10 pg/μL時(shí)，有較暗條帶產(chǎn)生，熒光檢測圖中也出現(xiàn)較淺的綠色熒光，所以該體系的靈敏度為10 pg/μL。

NC-陰性對照 1-1×104 pg·μL?1 2-1×103 pg·μL?1 3-100 pg·μL?1 4-50 pg·μL?1 5-25 pg·μL?1 6-10 pg·μL?1 7-1 pg·μL?1 M-Marker

3.4 真實(shí)樣本檢測結(jié)果

利用所建立的小檗皮VPCR熒光可視化檢測體系對來自甘肅、青海、四川、云南、西藏的16個(gè)批次小檗皮藥材進(jìn)行真?zhèn)舞b定，鑒定結(jié)果如圖6所示，除14號樣本以外，其余15個(gè)樣本在電泳圖中均出現(xiàn)明顯清晰的擴(kuò)增條帶，在熒光檢測圖中出現(xiàn)明顯的綠色熒光。為驗(yàn)證檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性，按照“2.2”項(xiàng)下操作利用ITS2通用引物對所有樣本的基因組DNA進(jìn)行擴(kuò)增，并將得到的PCR產(chǎn)物進(jìn)行測序，測序結(jié)果顯示14號樣本的ITS2序列與數(shù)據(jù)庫中黃柏序列（MN966484.1）一致，判斷14號樣本為黃柏，其余擴(kuò)增產(chǎn)物測序結(jié)果均與小檗皮序列一致。上述結(jié)果表明所建立的VPCR熒光可視化檢測體系具有較高的準(zhǔn)確性，可以應(yīng)用于小檗皮藥材的真?zhèn)舞b別。

NC-陰性對照 1～16-小檗皮待測樣本 M-Marker

3.5 藏成藥DNA質(zhì)量評價(jià)

將“2.1”項(xiàng)下提取的藏成藥DNA采用ITS2通用引物（S2F/S3R）進(jìn)行PCR反應(yīng)，檢測藏成藥的DNA質(zhì)量。PCR產(chǎn)物凝膠電泳結(jié)果（圖7）顯示，這3種藏成藥均在500 bp處有清晰明亮的擴(kuò)增條帶；熒光檢測圖中3種藏成藥也均顯示出明顯的綠色熒光，說明本實(shí)驗(yàn)提取出的藏成藥DNA均可以用于分子鑒別。

NC-陰性對照 1-BBJ 2-BBS 3-SWJH M-Marker

3.6 藏成藥中小檗皮原料藥的真?zhèn)舞b別

利用所建立的小檗皮VPCR熒光可視化檢測體系對藏成藥基因組DNA進(jìn)行擴(kuò)增和檢測，檢測結(jié)果如圖8所示，3個(gè)樣本在電泳圖中均出現(xiàn)明顯清晰的擴(kuò)增條帶，在熒光檢測圖中均出現(xiàn)明顯的綠色熒光。上述結(jié)果表明，所建立的檢測方法可以成功地檢測出藏成藥八味小檗皮膠囊、八味小檗皮散和四味姜黃湯散中的小檗皮原料藥。

NC-陰性對照 1-BBJ 2-BBS 3-SWJH M-Marker

4 討論

小檗皮品種多樣，基原復(fù)雜，且資源有限，大宗中藥材黃柏與小檗皮藥材的外形均為黃色或鮮黃色，性狀十分相似，所以藥材市場上常出現(xiàn)以黃柏?fù)饺胄￠奁せ煊玫那闆r，嚴(yán)重影響了藥材的質(zhì)量和臨床療效。藥材的混用還會(huì)導(dǎo)致藏成藥中原料藥的混用，藏成藥均為多味藥制成，化學(xué)成分復(fù)雜，藥材經(jīng)過粉碎加工，其本身的性狀已難以辨別，所以藏成藥中原料藥的真?zhèn)舞b定比原藥材的真?zhèn)舞b定更加困難。本研究通過對小檗皮特異性DNA進(jìn)行檢測可以實(shí)現(xiàn)對小檗皮藥材以及藏成藥中原料藥的真?zhèn)舞b別，研究結(jié)果顯示該方法具有較高的特異性、準(zhǔn)確性和靈敏度。值得一提的是，藏成藥中的藥材多以粉末形式入藥，本研究使用的藏成藥均不涉及提取物入藥，所以可以輕松提取到足夠量的DNA用于后續(xù)檢測。如涉及以提取物形式入藥的成藥，藥材DNA損失較大，還需要對其DNA提取和富集方式進(jìn)行考察和優(yōu)化，方能實(shí)現(xiàn)成藥中原料藥DNA的檢測。

PCR技術(shù)是病原微生物檢測、遺傳疾病診斷、物種分類中最常用的檢測技術(shù)之一，傳統(tǒng)的PCR擴(kuò)增方法需要在3個(gè)或2個(gè)特定的溫度點(diǎn)保持一定的停留時(shí)間，整個(gè)操作需要60～70 min，本研究利用課題組自主研發(fā)的超快速VPCR技術(shù)對小檗皮特異性DNA進(jìn)行擴(kuò)增，擴(kuò)增時(shí)間可縮短至30 min左右。由于本研究采用的PCR擴(kuò)增儀配置較低，升降溫速度較慢（平均升降溫速率約為1.6 ℃/s），所以擴(kuò)增時(shí)間較長，如采用升降溫速率更快的PCR擴(kuò)增儀，擴(kuò)增時(shí)間可進(jìn)一步降低至15～20 min。在擴(kuò)增產(chǎn)物的檢測方面，傳統(tǒng)的凝膠電泳法耗費(fèi)時(shí)間較長且操作繁瑣，本研究利用SYBR Green I染料可與雙鏈DNA結(jié)合發(fā)出綠色熒光的原理，實(shí)現(xiàn)了檢測產(chǎn)物的可視化分析，使得檢測結(jié)果更加直觀，提高了檢測效率。綜上，本研究建立了小檗皮藥材以及藏成藥中小檗皮的快速可視化鑒別方法，對小檗皮的真?zhèn)舞b定提供了科學(xué)的技術(shù)手段，有利于藥材及藏成藥的質(zhì)量控制和評價(jià)，同時(shí)本研究所用的方法為藥材的分子鑒定提供了技術(shù)參考，也可以推廣到其他品種的中藥與民族藥。

利益沖突 所有作者均聲明不存在利益沖突

[1] 宇妥·元丹貢布. 四部醫(yī)典 [M]. 馬世林, 羅達(dá)尚, 毛繼祖, 王振華譯. 上海: 上海科學(xué)技術(shù)出版社, 1987; 23.

[2] 羅達(dá)尚. 中華藏本草 [M]. 北京: 民族出版社, 1997: 84-85.

[3] 張燕, 孟憲麗, 岳麗珺, 等. 藏藥小檗皮對糖尿病模型小鼠血糖水平影響的初步研究 [J]. 現(xiàn)代生物醫(yī)學(xué)進(jìn)展, 2013, 13(19): 3619-3622.

[4] Bhardwaj D, Kaushik N. Phytochemical and pharmacological studies in genus[J]., 2012, 11(4): 523-542.

[5] 艾小鵬, 王小博, 王小艷, 等. 基于代謝組學(xué)的小檗皮對STZ誘導(dǎo)糖尿病大鼠腎病的保護(hù)機(jī)制研究 [J]. 中藥藥理與臨床, 2019, 35(2): 67-73.

[6] 徐鑫梅, 杜歡, 易歡, 等. 基于UPLC-Q-Exactive Orbitrap MS代謝組學(xué)技術(shù)篩選不同基原小檗皮品種鑒別的指標(biāo)性成分[J]. 中草藥, 2022, 53(23): 7524-7531.

[7] 中華人民共和國衛(wèi)生部藥品標(biāo)準(zhǔn). 藏藥. [S]. 第一冊, 1995: 340.

[8] 李艷. 藏藥小檗皮DNA條形碼鑒定及質(zhì)量控制研究 [D]. 成都: 成都中醫(yī)藥大學(xué), 2016.

[9] 吳艷, 劉佳, 王夢月, 等. 海龍及其常見偽品的RAPD鑒別 [J]. 中國中藥雜志, 2009, 34(14): 1758-1760.

[10] 闞萌萌, 王恒, 康東建, 等. 新疆荒地阿魏遺傳多樣性的ISSR分析 [J]. 中草藥, 2017, 48(10): 2100-2104.

[11] 蒲婧哲, 張亞中, 朱夜琳, 等. 基于物種特異性PCR方法的雞內(nèi)金真?zhèn)舞b別 [J]. 中國實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志, 2019, 25(17): 142-147.

[12] 胡沖, 張亞中, 袁媛, 等. 霍山石斛的PCR-RFLP鑒別研究 [J]. 藥物分析雜志, 2020, 40(12): 2109-2115.

[13] 朱林, 蒲婧哲, 張亞中, 等. PCR-RFLP法對蛇膽川貝散中川貝母的鑒別研究 [J]. 淮海醫(yī)藥, 2017, 35(6): 719-722.

[14] 崔占虎, 蔣超, 袁媛, 等. 6種成藥中原料藥材金銀花的分子鑒別研究 [J]. 包頭醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào), 2014, 30(1): 1-3.

[15] 中國藥典[S]. 一部. 2020: 263.

[16] Chen R, Ding S, Wei Y H,. Ultrafast identification of Pinelliae Rhizoma using colorimetric direct-VPCR [J]., 2021, 11(12): 493.

[17] Chen R, Lu X, Li M,. Polymerase chain reaction using “V” shape thermal cycling program [J]., 2019, 9(6): 1572-1579.

[18] 陳蓉, 余佳文, 徐瑞超, 等. 虎掌南星超快速Real-time VPCR閉管檢測方法的建立及應(yīng)用 [J]. 中草藥, 2021, 52(18): 5722-5728.

[19] 蔣超, 侯靜怡, 黃璐琦, 等. 快速PCR方法在金銀花真?zhèn)舞b別中的應(yīng)用 [J]. 中國中藥雜志, 2014, 39(19): 3668-3672.

[20] 魏藝聰, 袁媛, 陳建雄, 等. 快速PCR法鑒別魚腥草與百部還魂的方法研究[J]. 中草藥, 2016, 47(12): 2163-2166.

[21] Chen S, Yao H, Han J,. Validation of the ITS2 region as a novel DNA barcode for identifying medicinal plant species[J]., 2010, 5(1): e8613.

Identification ofand its Tibetan patent medicine based on Ultra-fast VPCR and fluorescence visual identification technology

LI Hong-ying1, SONG Wen-jun2, LI Hui-lin1, ZHANG Ji-chen3, FAN Gang2, CHEN Rong2

1. School of Pharmacy, Chengdu University of Traditional Chinese Medicine, Chengdu 611137, China 2. School of Ethnic Medicine, Chengdu University of Traditional Chinese Medicine, Chengdu 611137, China 3. Sichuan Tianfu New Area New Economic Development Research Center, Chengdu 610299, China

To develop an ultra-fast VPCR fluorescence visual identification method forXiaobopi ()-specific DNA to realize fast identification ofand its Tibetan patent medicine.Specific primers forwere designed according to the alignment results of theand its confusions. A fast VPCR amplification system was established for-specific DNA both in crude drugs and in Tibetan patent medicine. Moreover, this fast VPCR assay is also developed as a visual detection method by combing SYBR Green I fluorescent dye. Characters of an identification method including specificity, sensitivity, and generality were systematically studied.The amplification and fluorescence visual identification of-specific DNA could be finished within 40 minutes. The detection limit is as low as 10 pg/μL. A total of 16 batches ofwere analyzed by the developed method, of which 15 batches generated positive signals and one batch generated negative signal which was identified as Huangbo () using DNA sequencing method. All these results were 100% consistent with the sequencing results. Three kinds of Tibetan patent medicines containingwere analyzed and all samples yielded positive signals.The developed method not only greatly shortens the detection time, but also has a good specificity and sensitivity, which can effectively identifyand its Tibetan patent medicine.

; VPCR; fast amplification; visual detection; Tibetan patent medicine

R286.2

A

0253 - 2670(2023)12 - 3983 - 07

10.7501/j.issn.0253-2670.2023.12.024

2022-12-09

國家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目（81874370）；國家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目（81973434）；四川省重點(diǎn)研發(fā)項(xiàng)目（2022YFS0434）；成都中醫(yī)藥大學(xué)“杏林學(xué)者”學(xué)科人才科研提升計(jì)劃（QNXZ2018043）

李紅穎，女，碩士研究生，研究方向?yàn)橹兴幖懊褡逅庂|(zhì)量評價(jià)。E-mail: 1850631575@qq.com

通信作者：范 剛，男，博士，教授，研究方向?yàn)槊褡逅庂|(zhì)量控制及藥效物質(zhì)基礎(chǔ)。E-mail: fangang1111@163.com

陳 蓉，女，博士，副教授，研究方向?yàn)橹兴幖懊褡逅幏治黾百|(zhì)量評價(jià)。E-mail: chenrong@cdutcm.edu.cn

[責(zé)任編輯 時(shí)圣明]