基于NLRP3/細(xì)胞焦亡通路研究荊芥揮發(fā)油的抗抑郁作用及作用機(jī)制

秦甜甜，黃如楊，謝紅瀟，胡靖文，曾九僧，劉 蓉*，曾 南*

基于NLRP3/細(xì)胞焦亡通路研究荊芥揮發(fā)油的抗抑郁作用及作用機(jī)制

秦甜甜1, 2，黃如楊1, 2，謝紅瀟1, 2，胡靖文1, 2，曾九僧1, 2，劉 蓉1, 2*，曾 南1, 2*

1. 成都中醫(yī)藥大學(xué) 西南特色中藥資源國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，四川 成都 611137 2. 成都中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，四川 成都 611137

觀察荊芥揮發(fā)油對(duì)慢性溫和不可預(yù)知應(yīng)激（chronic unpredictable mild stress，CUMS）模型小鼠抑郁樣行為的干預(yù)作用，探究其調(diào)控NOD樣受體熱蛋白結(jié)構(gòu)域相關(guān)蛋白3（NOD-like receptor pyrin domain containing 3，NLRP3）炎癥小體/細(xì)胞焦亡從而抑制神經(jīng)炎癥的作用機(jī)制。雄性ICR小鼠制備CUMS抑郁樣模型，依據(jù)糖水偏好率將造模成功的小鼠隨機(jī)分為模型組、氟西?。?0 mg/kg）組和荊芥揮發(fā)油高、低劑量（100、50 mg/kg）組，同時(shí)設(shè)置對(duì)照組。給予藥物干預(yù)5周后，進(jìn)行小鼠糖水偏好實(shí)驗(yàn)、強(qiáng)迫游泳實(shí)驗(yàn)、懸尾實(shí)驗(yàn)與飛濺實(shí)驗(yàn)。行為學(xué)測(cè)試結(jié)束后，取血并分離血清，取海馬組織。ELISA法測(cè)定血清中白細(xì)胞介素-1β（interleukin-1β，IL-1β）和腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）水平；尼氏染色法檢測(cè)海馬CA3區(qū)神經(jīng)元尼氏小體平均吸光度值；免疫熒光法檢測(cè)海馬CA3區(qū)NLRP3、活化的半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-1（cleaved cystein-asparate protease-1，cleaved Caspase-1）、IL-1β及小膠質(zhì)細(xì)胞離子鈣結(jié)合適配器分子-1（ionized calcium binding adapter molecule-1，Iba-1）表達(dá)；Western blotting檢測(cè)海馬組織NLRP3炎癥小體及焦亡通路相關(guān)蛋白表達(dá)。與模型組比較，荊芥揮發(fā)油能明顯提高小鼠糖水偏好率（＜0.01），顯著縮短小鼠強(qiáng)迫游泳與懸尾實(shí)驗(yàn)中的不動(dòng)時(shí)間（＜0.01、0.001），明顯延長飛濺實(shí)驗(yàn)中的小鼠梳洗時(shí)間（＜0.05），表現(xiàn)出抗抑郁樣行為作用。荊芥揮發(fā)油顯著降低小鼠血清中IL-1β水平（＜0.05、0.01），增加海馬CA3區(qū)神經(jīng)元尼氏小體數(shù)目（＜0.05、0.01），減弱海馬CA3區(qū)cleaved Caspase-1、IL-1β及Iba-1的平均熒光強(qiáng)度（＜0.05、0.01、0.001），并顯著下調(diào)海馬組織NLRP3、凋亡相關(guān)斑點(diǎn)樣蛋白（apoptosis-associated speck-like protein containing a CARD，ASC）、Caspase-1、cleaved Caspase-1、IL-1β、pro IL-1β、gasdermin-D（GSDMD）、-GSDMD及Iba-1的蛋白表達(dá)（＜0.05、0.01、0.001）。荊芥揮發(fā)油能改善CUMS模型小鼠的抑郁樣行為，具有抗抑郁作用，其作用機(jī)制與抑制NLRP3炎癥小體激活及細(xì)胞焦亡、抑制小膠質(zhì)細(xì)胞活化，從而減輕神經(jīng)炎癥反應(yīng)與神經(jīng)元損傷有關(guān)。

荊芥揮發(fā)油；抑郁；慢性溫和不可預(yù)知應(yīng)激；神經(jīng)炎癥；NOD樣受體熱蛋白結(jié)構(gòu)域相關(guān)蛋白3；細(xì)胞焦亡；胡薄荷酮；異薄荷酮；薄荷酮；胡椒酮

抑郁癥是一種常見的精神疾病，以顯著而持久的情緒低落為主要臨床特征，主要表現(xiàn)有心境低落、意志活動(dòng)減退、思維遲緩和認(rèn)知功能損害，同時(shí)伴有睡眠障礙、焦慮，甚者出現(xiàn)嚴(yán)重的自殘或自殺行為[1]。抑郁癥的病因和發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，且尚未完全闡明。目前認(rèn)為中樞神經(jīng)炎癥是抑郁癥發(fā)病的核心機(jī)制之一，機(jī)體長期暴露于高水平的炎性細(xì)胞因子可誘發(fā)神經(jīng)系統(tǒng)的病變，進(jìn)而可能導(dǎo)致抑郁障礙等神經(jīng)精神疾病的發(fā)生[2]，表現(xiàn)為炎癥因子能促進(jìn)活性氧自由基生成，直接損傷與抑郁癥發(fā)病相關(guān)的腦區(qū)神經(jīng)元和膠質(zhì)細(xì)胞，擾亂神經(jīng)內(nèi)分泌功能，引起抑郁癥相關(guān)的各種癥狀[3-4]。臨床研究發(fā)現(xiàn)，抑郁癥患者外周血中的白細(xì)胞介素-1β（interleukin-1β，IL-1β）、IL-6和腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）等細(xì)胞因子水平顯著升高，使用抗抑郁藥治療后，上述促炎細(xì)胞因子的水平顯著降低[5]。活化的神經(jīng)小膠質(zhì)細(xì)胞會(huì)產(chǎn)生大量炎癥介質(zhì)，誘導(dǎo)神經(jīng)炎癥和認(rèn)知障礙[6]，其機(jī)制涉及炎癥反應(yīng)發(fā)生密切相關(guān)的NOD樣受體熱蛋白結(jié)構(gòu)域相關(guān)蛋白3（NOD-like receptor pyrin domain containing 3，NLRP3）炎性小體激活，NLRP3炎性小體存在于中樞神經(jīng)系統(tǒng)的小膠質(zhì)細(xì)胞和星形膠質(zhì)細(xì)胞中[7]，激活后釋放炎癥因子并啟動(dòng)下游炎癥反應(yīng)[8]，誘發(fā)的神經(jīng)炎癥參與神經(jīng)損傷，可導(dǎo)致疾病和抑郁樣行為。

荊芥Briq.揮發(fā)油及其主要成分胡薄荷酮、薄荷酮具有良好的抗炎作用，能夠減輕炎性損傷[9]。左旋薄荷酮還能抑制下丘腦-垂體-腎上腺（hypothalamic-pituitary-adrenocortical，HPA）軸過度活化，促進(jìn)皮質(zhì)腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子（brain-derived neurotrophic factor，BDNF）的表達(dá)，從而發(fā)揮抗抑郁作用[10]。課題組前期研究表明，荊芥揮發(fā)油的良好抗炎效應(yīng)與抑制NLRP3炎癥小體激活有關(guān)[11]，同時(shí)發(fā)現(xiàn)荊芥揮發(fā)油通過減輕神經(jīng)炎癥反應(yīng)對(duì)脂多糖（lipopolysaccharides，LPS）誘導(dǎo)的抑郁樣模型小鼠發(fā)揮保護(hù)作用[12]?；谇捌谘芯炕A(chǔ)，結(jié)合目前中藥揮發(fā)油的中樞神經(jīng)系統(tǒng)作用的認(rèn)識(shí)[13]，本研究采用慢性溫和不可預(yù)知應(yīng)激（chronic unpredictable mild stress，CUMS）誘導(dǎo)的小鼠抑郁樣模型，開展荊芥揮發(fā)油的抗抑郁作用及NLRP3/細(xì)胞焦亡通路作用機(jī)制研究，為進(jìn)一步探究荊芥揮發(fā)油的抗抑郁作用及臨床應(yīng)用拓展提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料

1.1 動(dòng)物

SPF級(jí)雄性ICR小鼠，5周齡，體質(zhì)量18～20 g，購自斯貝福（北京）生物技術(shù)有限公司，合格證號(hào)SCXK（京）2019-0010。所有動(dòng)物均自由飲食飲水，在24 h明暗周期的環(huán)境中飼養(yǎng)，晝夜各12 h，溫度（25±1）℃，相對(duì)濕度40%～60%。本實(shí)驗(yàn)符合動(dòng)物實(shí)驗(yàn)倫理學(xué)標(biāo)準(zhǔn)，獲得成都中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會(huì)的批準(zhǔn)（批準(zhǔn)號(hào)20200320）。

1.2 藥材

荊芥穗Briq.購自太極大藥房，批號(hào)20210101，經(jīng)成都中醫(yī)藥大學(xué)鑒定教研室嚴(yán)鑄云教授鑒定符合《中國藥典》2020年版要求。

1.3 藥品與試劑

鹽酸氟西汀（fluoxetine，F(xiàn)LX）膠囊（20 mg/粒，批號(hào)9833A）購自Patheon France公司；小鼠IL-1β、TNF-α ELISA試劑盒（批號(hào)分別為E-EL-M0037C、E-EL-M3063）購自武漢伊萊瑞特生物科技股份有限公司；BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒（批號(hào)P0010）購自碧云天試劑公司；UltraSignal超敏ECL化學(xué)發(fā)光底物（批號(hào)4AW011-100）購自北京四正柏生物科技有限公司；二甲苯、中性樹膠（批號(hào)分別為10023418、10004160）購自國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；冰醋酸（批號(hào)G10000218）購自武漢谷歌生物科技有限公司；NLRP3兔多克隆抗體（批號(hào)T55655ES）購自Abmart公司；凋亡相關(guān)斑點(diǎn)樣蛋白（apoptosis-associated speck-like protein containing a CARD，ASC）兔多克隆抗體（批號(hào)DF6304）、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-1（cystein-asparate protease-1，Caspase-1）兔多克隆抗體（批號(hào)AF5418）、cleaved Caspase-1兔多克隆抗體（批號(hào)AF4022）、IL-1β兔多克隆抗體（批號(hào)AF4006）、gasdermin-D（GSDMD）兔多克隆抗體（批號(hào)AF4012）、離子鈣結(jié)合適配器分子-1（ionized calcium binding adapter molecule-1，Iba-1）兔多克隆抗體（批號(hào)DF6442）均購自Affinity公司；β-tubulin兔多克隆抗體（批號(hào)GB11017B）、甘油醛-3-磷酸脫氫酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH）兔多克隆抗體（批號(hào)GB11002）、尼氏染液（批號(hào)G1032）均購自塞維爾有限公司。

1.4 儀器

UPK-10T型純水儀（廣州市優(yōu)普科技有限公司）；BS323S型電子天平（德國Sartorius公司）；3001型酶標(biāo)儀、ST16R型冷凍離心機(jī)、Revos型脫水機(jī)（美國Thermo Fisher Scientific公司）；DYY-6C型電泳儀電源（北京市六一儀器廠）；1658000型小型垂直電泳槽、轉(zhuǎn)膜槽、ChemiDoc型免染型化學(xué)發(fā)光凝膠成像系統(tǒng)（美國Bio-Rad公司）；JB-P5型包埋機(jī)、JB-L5型凍臺(tái)（武漢俊杰電子有限公司）；RM2016型病理切片機(jī)（上海徠卡儀器有限公司）；KD-P型組織攤片機(jī)（浙江省金華市科迪儀器設(shè)備有限公司）；GFL-230型烤箱（天津市萊玻瑞儀器設(shè)備有限公司）；Eclipse E100型正置光學(xué)顯微鏡、DS-U3型成像系統(tǒng)（日本尼康公司）。

2 方法

2.1 荊芥揮發(fā)油的制備

荊芥穗打粉，以6倍量水浸泡30 min后，水蒸氣蒸餾法提取揮發(fā)油，大火煮沸后微火加熱至無揮發(fā)油生成為止，收集揮發(fā)油提取器中上層揮發(fā)油，無水硫酸鈉脫水后避光保存，1 kg生藥經(jīng)提取得到9 mL荊芥揮發(fā)油。荊芥揮發(fā)油經(jīng)GC-MS檢測(cè)，其主要成分有胡薄荷酮、異薄荷酮、薄荷酮及胡椒酮等，相對(duì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為36.76%、14.39%、14.39%、2.73%[12]。

2.2 CUMS模型的建立、分組及給藥

小鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)3 d后，按體質(zhì)量分層隨機(jī)分為對(duì)照組和造模組，對(duì)照組小鼠合籠飼養(yǎng)不施加造模程序，造模組小鼠單籠飼養(yǎng)，并施加CUMS程序進(jìn)行造模：冷水游泳（4 ℃、5 min），空籠，夾尾（3 min），頻閃燈刺激（12 h），明暗顛倒，禁食24 h，禁水24 h，潮濕墊料（12 h），異味刺激（3 h），束縛（3 h），鼠籠傾斜，噪音環(huán)境（60 Hz，1 h），將以上刺激因子隨機(jī)分配，每日安排2種單因子刺激或復(fù)合因子刺激，相鄰2 d刺激因子不重復(fù)，使動(dòng)物不能預(yù)料刺激的發(fā)生。給藥期間造模程序不停止。造模前及開始造模后每周測(cè)定小鼠糖水偏好率，連續(xù)造模6周后，與對(duì)照組比較模型組小鼠糖水偏好率出現(xiàn)顯著降低，提示造模成功。隨后依據(jù)小鼠糖水偏好率，將造模組小鼠重新分組，使各組糖水偏好率相近且與對(duì)照組比較均有顯著性差異，分為模型組、FLX（10 mg/kg，相當(dāng)于成人臨床日用劑量的30倍）組和荊芥揮發(fā)油高、低劑量（100、50 mg/kg，分別為1/5 LD50、1/10 LD50）組，每組10只，其中荊芥揮發(fā)油的劑量設(shè)置參考其急性毒性實(shí)驗(yàn)結(jié)果及以往研究基礎(chǔ)[12]。各給藥組ig相應(yīng)藥物（20 mL/kg），對(duì)照組和模型組ig等體積蒸餾水，1次/d，連續(xù)給藥5周。

2.3 行為學(xué)實(shí)驗(yàn)

2.3.1 糖水偏好實(shí)驗(yàn) 糖水偏好實(shí)驗(yàn)前，各組小鼠給予1瓶白水與1瓶1%蔗糖水飲用，適應(yīng)一邊白水、一邊蔗糖水的情況。適應(yīng)12 h后，所有小鼠單籠飼養(yǎng)，禁食禁水12 h。每只小鼠各給予1瓶白水與1瓶1%蔗糖水，稱定2只水瓶質(zhì)量。在小鼠飲用白水或蔗糖水12 h后，取下水瓶，再次稱定水瓶質(zhì)量，以2次水瓶質(zhì)量差值記為小鼠白水或蔗糖水的消耗量，計(jì)算小鼠糖水偏好率。造模前測(cè)定小鼠糖水偏好率基礎(chǔ)值，造模開始后于每周固定時(shí)間測(cè)定小鼠糖水偏好率1次。

糖水偏好率＝蔗糖水消耗量/(白水消耗量＋蔗糖水消耗量

2.3.2 強(qiáng)迫游泳、懸尾實(shí)驗(yàn) 參考文獻(xiàn)方法[14-15]，各組小鼠于處理前1周進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

（1）強(qiáng)迫游泳實(shí)驗(yàn)：在高30 cm、直徑20 cm的圓柱型透明器皿中注入20 cm深清水，溫度（25±2）℃。將小鼠置于器皿內(nèi)，計(jì)時(shí)6 min，前2 min使其適應(yīng)性游泳，記錄后4 min內(nèi)累積不動(dòng)時(shí)間。

（2）懸尾實(shí)驗(yàn)：將小鼠尾部后2 cm處用膠帶固定在水平位置，使其呈倒掛狀態(tài)，頭部離下水平面5～6 cm，記錄動(dòng)物在6 min內(nèi)后4 min的累積不動(dòng)時(shí)間。

2.3.3 飛濺實(shí)驗(yàn) 將10%的蔗糖水連續(xù)3次噴于小鼠背部靠近尾端處。之后放入小鼠原本居住的籠中記錄5 min內(nèi)小鼠的梳洗時(shí)間（小鼠梳洗背部噴灑糖水位置的行為時(shí)間記為梳洗時(shí)間），于取材前1周進(jìn)行測(cè)定。

2.4 ELISA檢測(cè)血清炎癥因子水平

行為學(xué)測(cè)試完畢后，小鼠眼球取血，室溫靜置2 h，3500 r/min離心10 min（離心半徑7.5 cm），分離血清，按試劑盒說明書測(cè)定血清中IL-1β及TNF-α水平。

2.5 尼氏染色檢測(cè)海馬CA3區(qū)尼氏小體

取小鼠大腦組織固定于4%多聚甲醛中，常規(guī)方法脫水、透明、浸蠟并包埋。取小鼠全腦蠟塊切片（3 μm），烘干后將切片放入二甲苯Ⅰ 20 min、二甲苯Ⅱ 20 min、無水乙醇Ⅰ 5 min、無水乙醇Ⅱ 5 min、75%乙醇5 min，水洗。甲苯胺藍(lán)染色45 min，水洗，0.1%冰醋酸分化，水洗終止反應(yīng)，顯微鏡下控制分化程度，水洗后置于60 ℃烤箱烘干。切片于二甲苯透明5 min，中性樹膠封片。置于顯微鏡下拍照，采用Image-Pro Plus 6.0軟件進(jìn)行圖像分析，IDO法檢測(cè)海馬CA3區(qū)尼氏小體平均吸光度（）值。

2.6 免疫熒光法檢測(cè)小鼠海馬CA3區(qū)NLRP3、cleaved Caspase-1、IL-1β和Iba-1的表達(dá)

取各組小鼠腦組織脫水、包埋、切片（約3 μm），切片常規(guī)脫蠟至水，用檸檬酸緩沖液進(jìn)行抗原修復(fù)。PBS溶液（pH 7.4）洗滌后用組化筆畫圈，在圈內(nèi)加入自發(fā)熒光淬滅劑后流水沖洗。牛血清白蛋白封閉30 min后，滴加PBS配制的一抗，切片平放于濕盒內(nèi)4 ℃孵育過夜。PBS洗滌后滴加與一抗相應(yīng)種屬的二抗覆蓋組織，避光室溫孵育50 min。切片于熒光顯微鏡下觀察并采集圖像，使用CaseViewer 4.0掃描瀏覽軟件選取組織的目的區(qū)域?qū)ｑRCA3區(qū)進(jìn)行成像，應(yīng)用Image J軟件分析平均熒光強(qiáng)度。

2.7 Western blotting檢測(cè)海馬組織NLRP3/細(xì)胞焦亡通路相關(guān)蛋白表達(dá)

稱取各組小鼠海馬組織20 mg，加入RIPA裂解液200 μL勻漿、裂解，12 000×離心10 min后，取上清液，BCA法測(cè)定總蛋白濃度，調(diào)整蛋白濃度一致后，蛋白樣品經(jīng)十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳，轉(zhuǎn)至PVDF膜，加入5%脫脂牛奶室溫封閉1.5 h，洗膜后分別加入NLRP3、ASC、GSDMD、Caspase-1、cleaved Caspase-1、IL-1β、Iba-1（1∶1000）兔抗，4 ℃孵育過夜；洗膜后孵育二抗（1∶5000），洗膜后在凝膠成像系統(tǒng)中成像，Image Lab凝膠圖像分析系統(tǒng)分析條帶灰度值。

2.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

3 結(jié)果

3.1 荊芥揮發(fā)油對(duì)CUMS模型小鼠行為學(xué)的影響

3.1.1 糖水偏好率 如表1所示，與對(duì)照組比較，模型組小鼠糖水偏好率顯著降低（＜0.05），提示動(dòng)物快感缺失，出現(xiàn)抑郁樣行為，表明造模成功。與模型組比較，各給藥組小鼠糖水偏好率顯著升高（＜0.01），表明荊芥揮發(fā)油能夠改善模型小鼠快感缺失的行為異常表現(xiàn)，表現(xiàn)出抗抑郁作用。

表1 荊芥揮發(fā)油對(duì)CUMS模型小鼠糖水偏好率的影響()

與對(duì)照組比較：#＜0.05##＜0.01；與模型組比較：*＜0.05**＜0.01***＜0.001，下表同

#< 0.05##< 0.01control group;*< 0.05**< 0.01***< 0.001model group, same as below tables

3.1.2 強(qiáng)迫游泳、懸尾實(shí)驗(yàn)不動(dòng)時(shí)間及飛濺實(shí)驗(yàn)梳洗時(shí)間 如表2所示，與對(duì)照組比較，模型組小鼠游泳及懸尾實(shí)驗(yàn)中的不動(dòng)時(shí)間分別延長（＜0.05），飛濺實(shí)驗(yàn)中小鼠梳洗時(shí)間縮短（＜0.01），表明CUMS模型小鼠出現(xiàn)行為學(xué)異常。與模型組比較，各給藥組小鼠懸尾和強(qiáng)迫游泳實(shí)驗(yàn)中的不動(dòng)時(shí)間明顯縮短（＜0.01、0.001），梳洗時(shí)間延長（＜0.05）。

3.2 荊芥揮發(fā)油對(duì)CUMS模型小鼠血清炎癥因子水平的影響

如表3所示，與對(duì)照組比較，模型組小鼠血清IL-1β水平明顯升高（＜0.05），TNF-α呈升高趨勢(shì)；與模型組比較，各給藥組小鼠血清IL-1β水平顯著降低（＜0.05、0.01），TNF-α呈降低趨勢(shì)。

表2 荊芥揮發(fā)油對(duì)CUMS模型小鼠行為學(xué)表現(xiàn)的影響()

表3 荊芥揮發(fā)油對(duì)CUMS小鼠血清中IL-1β和TNF-α水平的影響()

3.3 荊芥揮發(fā)油對(duì)CUMS模型小鼠海馬CA3區(qū)尼氏小體的影響

如圖1所示，對(duì)照組小鼠海馬神經(jīng)元尼氏體豐富，著色明顯，排列整齊，神經(jīng)元細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)較好。與對(duì)照組比較，模型組小鼠海馬CA3區(qū)神經(jīng)元細(xì)胞排列不佳，細(xì)胞間間隙增寬，胞體多角形變小改變明顯，海馬神經(jīng)元細(xì)胞皺縮，胞質(zhì)尼氏體數(shù)量減少。與模型組比較，各給藥組海馬CA3區(qū)神經(jīng)元形態(tài)結(jié)構(gòu)正常，胞質(zhì)尼氏體豐富呈藍(lán)染顆粒狀，染色比較清晰，排列較為整齊。如表4所示，與對(duì)照組比較，模型組尼氏小體數(shù)量明顯減少（＜0.01）；與模型組比較，各給藥組尼氏小體數(shù)量均顯著增加（＜0.05、0.01），說明荊芥揮發(fā)油可以通過發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用對(duì)抗動(dòng)物的抑郁樣行為。

3.4 荊芥揮發(fā)油對(duì)CUMS模型小鼠海馬CA3區(qū)NLRP3、cleaved Caspase-1、IL-1β及Iba-1表達(dá)的影響

如圖2和表5所示，與對(duì)照組比較，模型組小鼠海馬CA3區(qū)NLRP3、cleaved Caspase-1及Iba-1的熒光強(qiáng)度顯著升高（＜0.05、0.01），IL-1β有升高趨勢(shì)，提示小膠質(zhì)細(xì)胞的激活及炎癥反應(yīng)啟動(dòng)；與模型組比較，各給藥組cleaved Caspase-1和Iba-1熒光強(qiáng)度顯著降低（＜0.05、0.01、0.001），F(xiàn)LX組NLRP3熒光強(qiáng)度顯著降低（＜0.05），F(xiàn)LX組和荊芥揮發(fā)油高劑量組IL-1β熒光強(qiáng)度顯著降低（＜0.05）。

黃箭頭表示海馬神經(jīng)元細(xì)胞皺縮，藍(lán)箭頭表示胞質(zhì)尼氏體數(shù)量減少，黑箭頭表示胞質(zhì)尼氏體豐富呈藍(lán)染顆粒狀

表4 荊芥揮發(fā)油對(duì)CUMS模型小鼠海馬CA3區(qū)尼氏小體的影響(, n = 4)

3.5 荊芥揮發(fā)油對(duì)CUMS模型小鼠海馬組織NLRP3/細(xì)胞焦亡通路相關(guān)蛋白表達(dá)的影響

如圖3和表6所示，與對(duì)照組比較，模型組小鼠海馬組織NLRP3、Caspase-1、cleaved Caspase-1、IL-1β、pro IL-1β、ASC、GSDMD、-GSDMD和Iba-1蛋白表達(dá)水平均明顯升高（＜0.05、0.01），提示CUMS模型小鼠海馬組織中小膠質(zhì)細(xì)胞活化且NLRP3炎癥小體被激活，細(xì)胞焦亡發(fā)生，引起小鼠海馬部位的神經(jīng)炎癥。與模型組比較，各給藥組NLRP3、Caspase-1、IL-1β、GSDMD、-GSDMD、蛋白表達(dá)水平均明顯降低（＜0.05、0.01、0.001），荊芥揮發(fā)油各劑量組cleaved Caspase-1、Iba-1蛋白表達(dá)水平均明顯降低（＜0.01、0.001），F(xiàn)LX組和荊芥揮發(fā)油低劑量組pro IL-1β、ASC蛋白表達(dá)水平均明顯降低（＜0.05、0.01），表明荊芥揮發(fā)油能對(duì)抗模型小鼠海馬組織中小膠質(zhì)細(xì)胞的活化，同時(shí)抑制NLRP3炎癥小體的激活，抑制細(xì)胞焦亡，從而減少炎癥因子釋放。

圖2 荊芥揮發(fā)油對(duì)CUMS模型小鼠海馬CA3區(qū)NLRP3、cleaved Caspase-1、IL-1β及Iba-1表達(dá)的影響(×200)

表5 荊芥揮發(fā)油對(duì)CUMS模型小鼠海馬CA3區(qū)NLRP3、cleaved Caspase-1、IL-1β及Iba-1表達(dá)的影響(, n = 4)

圖3 荊芥揮發(fā)油對(duì)CUMS模型小鼠海馬組織NLRP3/細(xì)胞焦亡通路相關(guān)蛋白表達(dá)的影響

表6 荊芥揮發(fā)油對(duì)CUMS模型小鼠海馬組織NLRP3/細(xì)胞焦亡通路相關(guān)蛋白表達(dá)的影響(, n = 4)

4 討論

傳統(tǒng)中藥揮發(fā)油（精油）依賴于其獨(dú)特的芳香氣味、易透過血腦屏障、多靶點(diǎn)、不良反應(yīng)少等特點(diǎn)，通過抗焦慮、抗抑郁、鎮(zhèn)靜安神、神經(jīng)保護(hù)等多種藥理活性，在防治抑郁、焦慮等情志疾病上呈現(xiàn)出獨(dú)特優(yōu)勢(shì)[13]。荊芥揮發(fā)油作為荊芥的主要物質(zhì)基礎(chǔ)，已被證明具有良好的抗炎、抗病毒、抗腫瘤、解熱鎮(zhèn)痛等作用[16]，且前期研究亦表明其抗炎作用與其對(duì)抗LPS所致的抑郁樣模型小鼠行為學(xué)異常有關(guān)[12]，因此究其抗抑郁效應(yīng)，值得進(jìn)一步探究。

CUMS抑郁模型模仿了人類抑郁癥的發(fā)生和發(fā)病機(jī)制，被認(rèn)為是較為理想的動(dòng)物抑郁模型[17-20]。接觸重復(fù)應(yīng)激的動(dòng)物糖水消耗會(huì)減少，出現(xiàn)快感缺乏跡象，因此糖水偏好實(shí)驗(yàn)可用于評(píng)價(jià)抑郁程度[21-22]。飛濺實(shí)驗(yàn)主要觀察動(dòng)物是否出現(xiàn)行為淡漠狀態(tài)。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，CUMS造模后，小鼠糖水偏好率降低，提示CUMS抑郁模型構(gòu)建成功。荊芥揮發(fā)油連續(xù)給藥5周，能明顯提高糖水偏好率，顯著縮短小鼠懸尾與強(qiáng)迫游泳實(shí)驗(yàn)中不動(dòng)時(shí)間，延長飛濺實(shí)驗(yàn)中的梳洗時(shí)間，結(jié)合小鼠行為絕望抑郁模型的結(jié)果，表明荊芥揮發(fā)油具有抗抑郁作用。

近年來研究認(rèn)為，壓力增加會(huì)引起外周和中樞神經(jīng)系統(tǒng)中的促炎細(xì)胞因子釋放，以及大腦中小膠質(zhì)細(xì)胞的激活，特征表現(xiàn)為細(xì)胞表面標(biāo)志物Iba-1的增加。IL-1β和TNF-α作為炎癥介質(zhì)在細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)中發(fā)揮重要作用，自身也會(huì)影響神經(jīng)遞質(zhì)系統(tǒng)、大腦功能和情緒[23]，與抑郁癥的發(fā)生、發(fā)展較為密切[24]。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，CUMS模型小鼠血清中炎癥因子IL-1β、TNF-α水平升高，小鼠海馬CA3區(qū)Iba-1蛋白表達(dá)上調(diào)，提示小膠質(zhì)細(xì)胞被激活，荊芥揮發(fā)油則能顯著對(duì)抗上述變化，表明藥物能抑制小膠質(zhì)細(xì)胞激活，減少炎癥因子釋放，從而抑制神經(jīng)炎癥來發(fā)揮抗抑郁作用。當(dāng)神經(jīng)元長期受到應(yīng)激或受損時(shí)，尼氏體會(huì)減少、解體甚至消失，常被用于評(píng)估神經(jīng)元損傷表現(xiàn)[25]。與模型組小鼠比較，荊芥揮發(fā)油治療后能減輕小鼠海馬CA3區(qū)神經(jīng)元形態(tài)病理表現(xiàn)，增加尼氏小體數(shù)目，提示藥物對(duì)CUMS造模導(dǎo)致的海馬神經(jīng)元損傷有保護(hù)作用。

研究認(rèn)為，抑郁癥的神經(jīng)炎癥反應(yīng)病理機(jī)制與小膠質(zhì)細(xì)胞功能變化、Toll樣受體（Toll-like receptors，TLRs）以及NLRPs等信號(hào)通路有關(guān)[26]，其中NLRP3炎癥小體被證實(shí)參與了抑郁癥的發(fā)病機(jī)制[27]。NLRP3作為炎癥小體的核心蛋白，組裝ASC和Caspase-1形成NLRP3炎癥小體，NLRP3炎癥小體被激活后，cleaved Caspase-1切割GSDMD中端和端結(jié)構(gòu)域之間的接頭，然后端GSDMD結(jié)構(gòu)域片段易位到質(zhì)膜形成膜孔，導(dǎo)致細(xì)胞裂解死亡或通過孔分泌成熟狀態(tài)的IL-1β、IL-18，誘導(dǎo)一系列炎癥反應(yīng)，最終引起細(xì)胞焦亡[28-29]。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，CUMS抑郁模型小鼠海馬組織NLRP3、ASC、Caspase-1、IL-1β、pro IL-1β蛋白表達(dá)水平顯著上調(diào)，免疫熒光法同樣表明NLRP3、IL-1β蛋白表達(dá)量增加，提示模型小鼠海馬組織NLRP3炎癥小體被激活，致使炎癥因子增加；進(jìn)一步檢測(cè)發(fā)現(xiàn)GSDMD、-GSDMD、cleaved Caspase-1表達(dá)量增加，提示出現(xiàn)細(xì)胞焦亡，進(jìn)而導(dǎo)致神經(jīng)元的損傷。研究結(jié)果也證實(shí)了抑郁癥的發(fā)生與NLRP3炎癥小體激活、細(xì)胞焦亡發(fā)生密切相關(guān)。荊芥揮發(fā)油治療后，上述蛋白的表達(dá)量均呈現(xiàn)下調(diào)的表現(xiàn)，表明荊芥揮發(fā)油能通過抑制NLRP3炎癥小體激活及細(xì)胞焦亡發(fā)生，從而減輕神經(jīng)損傷來發(fā)揮抗抑郁作用。

綜上，本研究證實(shí)了荊芥揮發(fā)油的抗抑郁作用，并提示其抗抑郁作用與抑制NLRP3炎癥小體激活及細(xì)胞焦亡、抑制小膠質(zhì)細(xì)胞活化、降低炎癥因子表達(dá)等有關(guān)。研究結(jié)果豐富并拓展了荊芥揮發(fā)油良好抗炎作用的應(yīng)用依據(jù)，明確了該揮發(fā)油的抗抑郁作用表現(xiàn)。

利益沖突 所有作者均聲明不存在利益沖突

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Antidepressant effect and mechanism of essential oil frombased on NLRP3/pyroptosis pathway

QIN Tian-tian1, 2, HUANG Ru-yang1, 2, XIE Hong-xiao1, 2, HU Jing-wen1, 2, ZENG Jiu-seng1, 2, LIU Rong1, 2, ZENG Nan1, 2

1. State Key Laboratory of Southwestern Chinese Medicine Resources, Chengdu University of Traditional Chinese Medicine, Chengdu 611137, China 2. School of Pharmacy, Chengdu University of Traditional Chinese Medicine, Chengdu 611137, China

To observe the intervention effect of essential oil fromon depression-like behavior in chronic unpredictable mild stress (CUMS) model mice, and investigate its mechanism of regulating NOD-like receptor pyrin domain containing 3 (NLRP3) inflammasome and pyroptosis signaling pathway to inhibit neuroinflammation.CUMS depression-like model was established in male ICR mice. According to the preference rate of sugar water, the successful modeling mice were randomly divided into model group, fluoxetine (10 mg/kg) group and essential oil fromhigh-, low-dose (100, 50 mg/kg) groups, and the control group was set at the same time. After five weeks of drug intervention, the sugar water preference test, forced swimming test, tail suspension test and splash test were carried out in mice. After the behavioral test, blood was taken and serum was separated, and hippocampus tissue was taken. Levels of interleukin-1β (IL-1β) and tumor necrosis factor α (TNF-α) in serum were measured by ELISA. Nissl staining was used to detect the average optical density of Nissl body in hippocampal CA3 neurons. The expressions of NLRP3, cleaved cystein-asparate protease-1 (cleaved Caspase-1), IL-1β and ionized calcium binding adapter molecule-1 (Iba-1) in hippocampus CA3 were detected by immunofluorescence. Western blotting was used to detect the expressions of NLRP3 inflammasome and pyroptosis signaling pathway related proteins in hippocampus.Compared with model group, essential oil fromsignificantly improved the preference rate of sugar water in mice (< 0.01), significantly shortened the immobility time in forced swimming and tail suspension tests (< 0.01, 0.001), and significantly prolonged the grooming time in splash tests (< 0.05), showing the antidepressant-like behavior. The essential oil fromsignificantly decreased the level of IL-1β in serum of mice (< 0.05, 0.01), increased the number of Nissl body in hippocampal CA3 area (< 0.05, 0.01), weakened the average fluorescence intensity of cleaved Caspase-1, IL-1β and Iba-1 in hippocampal CA3 area (< 0.05, 0.01, 0.001), downregulated NLRP3, apoptosis-associated speck-like protein containing a CARD (ASC), Caspase-1, cleaved Caspase-1, IL-1β, pro IL-1β, gasdermin-D (GSDMD),-GSDMD and Iba-1 protein expressions in hippocampus (< 0.05, 0.01, 0.001).The essential oil fromcan improve the depression-like behavior of CUMS model mice, and has antidepressant effect. Its mechanism is related to inhibiting the activation of inflammasome of NLRP3 and pyroptosis, and inhibiting the activation of microglia, thus reducing the neuroinflammatory reaction and neuronal injury.

essential oil fromBriq.; depression; chronic unpredictable mild stress; neuroinflammation; NOD-like receptor pyrin domain containing 3; pyroptosis; pulegone; isomenthone; menthone; ()-piperitone

R285.5

A

0253 - 2670(2023)12 - 3878 - 09

10.7501/j.issn.0253-2670.2023.12.014

2022-12-13

西南特色中藥資源國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室開放研究基金項(xiàng)目（2020XSGG002）；國家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目（82074094）

秦甜甜，碩士研究生，研究方向?yàn)橹兴幩幚砼c毒理。E-mail: qinyankao@163.com

通信作者：曾 南，教授，博士生導(dǎo)師，主要從事中藥藥理和毒理學(xué)研究。E-mail: zengnan966@126.com

劉 蓉，教授，研究生導(dǎo)師，主要從事中藥藥理和毒理學(xué)研究。E-mail: liurong_1116@126.com

[責(zé)任編輯 李亞楠]