土壤生物膜的生態(tài)功能及其研究方法綜述

李宇佳 文翊 駱樂丹 趙升 歐陽凱

摘要：生物膜是指微生物附著于接觸表面并分泌多糖基質(zhì)、脂質(zhì)蛋白和胞外DNA等物質(zhì)包裹自身而形成的微生物微團(tuán)聚體。生物膜的形成是微生物適應(yīng)自然環(huán)境的一種生存策略。生物膜具有各種各樣的功能特性（吸附性、抗藥性、降解性等），在環(huán)境保護(hù)領(lǐng)域具有廣大的應(yīng)用前景。近年來，生物膜已經(jīng)成為各大領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)，在工業(yè)、醫(yī)學(xué)、水環(huán)境等領(lǐng)域都有其身影，但在土壤環(huán)境中的研究報(bào)道較少。主要介紹了土壤生物膜的組成及其形成過程，并對(duì)土壤生物膜高效攝取養(yǎng)分、抵御外部環(huán)境危害和充當(dāng)胞外消化系統(tǒng)等重要生態(tài)功能進(jìn)行綜述；同時(shí)比較分析了幾種常見的生物膜培養(yǎng)裝置（微量滴定板、卡爾加里培養(yǎng)、生物膜環(huán)、流動(dòng)池、微流體等）和檢測(cè)技術(shù)（染色法、熒光原位雜交、光學(xué)相干斷層掃描、激光共聚焦顯微鏡、原子力顯微鏡等）的優(yōu)缺點(diǎn)；最后對(duì)生物膜在土壤環(huán)境相關(guān)方面的研究潛力提出展望，旨在深入理解土壤生物膜與土壤各組分之間的相互作用，為提高土壤微生物的生態(tài)環(huán)境效益提供理論依據(jù)。

關(guān)鍵詞：土壤生物膜；生物膜功能；培養(yǎng)裝置；檢測(cè)技術(shù)

中圖分類號(hào)：S154.3? 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號(hào)：1002-1302（2023）10-0001-10

收稿日期：2022-07-30

基金項(xiàng)目：國家自然科學(xué)基金青年基金（編號(hào)：42007021）；中國博士后科學(xué)基金（編號(hào)：2020M672498）；湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)青年基金（編號(hào)：19QN39）。

作者簡介：李宇佳（1997—），男，湖南婁底人，碩士，主要研究方向?yàn)橥寥郎锘瘜W(xué)。E-mail：814708233@qq.com。

通信作者：歐陽凱，博士，副教授，主要研究方向?yàn)橥寥赖V物-有機(jī)物-微生物界面互作與環(huán)境、土壤生物膜的生態(tài)環(huán)境效應(yīng)。E-mail：Kai_ouyang@hunau.edu.cn。

微生物在介質(zhì)聚集，通過自身分泌物質(zhì)相互聯(lián)系形成一層膠狀薄膜，即生物膜。在土壤生態(tài)系統(tǒng)中，幾乎有99%的微生物以生物膜形式存在［1］。土壤環(huán)境是微生物的最大聚集地之一，微生物群落結(jié)構(gòu)多種多樣，為土壤生物膜的形成提供了良好的物質(zhì)條件［2］。土壤微生物以土壤顆?；蛑参锔底鳛榻缑孢M(jìn)行吸附，釋放土壤顆粒中的礦質(zhì)元素或與植物進(jìn)行物質(zhì)交換，為土壤生物膜的生長發(fā)育提供營養(yǎng)物質(zhì)［3］。土壤生物膜的形成可以對(duì)土壤結(jié)構(gòu)和質(zhì)量進(jìn)行改良，增加土壤對(duì)外界不良環(huán)境的抵御能力，在提高農(nóng)作物產(chǎn)量和保護(hù)農(nóng)業(yè)環(huán)境方面有著重大的潛力［4］。

已有研究表明，單一或多物種形成的土壤生物膜能夠定殖在礦物表面、土壤孔隙和植物根部等基質(zhì)或界面上［5-7］。在生物膜的形成過程中，微生物通過分泌胞外聚合物將細(xì)胞聚合在一起，同時(shí)黏附在物質(zhì)表面［8］。與單一物種形成的生物膜相比，多物種生物膜的競爭優(yōu)勢(shì)更明顯，能更好地適應(yīng)環(huán)境的變化。例如在缺水時(shí)期，多物種生物膜有更高的耐受性，并促進(jìn)細(xì)菌水平基因的轉(zhuǎn)移［9］。Koele 等研究了在不良外部環(huán)境條件下松樹根際細(xì)菌生物膜對(duì)植物養(yǎng)分情況的影響，發(fā)現(xiàn)土壤中含碳物質(zhì)的礦化速率隨生物膜的生長而加快，植物根系獲得更多的養(yǎng)分，以此來緩解外部環(huán)境的侵蝕［10］。土壤生物膜的發(fā)育會(huì)改變土壤的理化性質(zhì)，例如土壤孔隙中生物膜的形成會(huì)堵塞或縮小孔隙，從而降低土壤的含水量和水分的入滲［11-12］。生物膜具有致密且穩(wěn)定的結(jié)構(gòu)，對(duì)土壤中的有毒有害物質(zhì)具有較高的耐受能力，對(duì)作物的生長發(fā)育具有促進(jìn)作用。土壤生物膜提高了微生物在環(huán)境脅迫下的存活率，在土壤的形成和發(fā)育過程中承擔(dān)著至關(guān)重要的作用。

隨著對(duì)土壤生物膜研究的深入，現(xiàn)已獲得了一些重要的成就和突破?？偨Y(jié)前人的研究不難發(fā)現(xiàn)，以往的絕大多數(shù)研究主要考察的是土壤中單一物種微生物形成的生物膜。如Ouyang等研究了腐殖酸介導(dǎo)下納米顆粒對(duì)惡臭假單胞菌KT2440生物膜形成的影響，發(fā)現(xiàn)不同的生物膜形成階段對(duì)納米顆粒的耐受性不同，且腐殖酸能夠減輕納米顆粒對(duì)細(xì)菌生物膜形成的抑制作用［13］。Ma等將土壤礦物（蒙脫石、高嶺石、針鐵礦）與枯草芽孢桿菌兩兩混合培養(yǎng)，研究生物膜在礦物表面的形成狀況，結(jié)果表明3種土壤礦物表面形成的生物膜具有顯著的差異，且這種差異是由土壤礦物質(zhì)表面的理化性質(zhì)不同所造成［5］。Xing等研究在蒙脫石影響下Serratia marcescens S14對(duì)Cd2+的吸附效應(yīng)，證實(shí)了低濃度Cd2+和蒙脫石或其組合能夠促進(jìn)生物膜形成；相較于游離態(tài)的細(xì)菌，生物膜對(duì)Cd2+的吸附量增加了15倍［14］。在自然狀態(tài)下，土壤生物膜主要是以多種微生物相互聚集而形成。本文簡要綜述了土壤多物種生物膜的形成過程和功能及其對(duì)土壤改良、生態(tài)環(huán)境方面的影響；同時(shí)介紹了幾種常用的多物種生物膜培養(yǎng)方法和檢測(cè)技術(shù)及其優(yōu)缺點(diǎn)，期望這些方法有助于加深對(duì)生物膜形成機(jī)制、結(jié)構(gòu)、組成及功能的理解。

1 生物膜的形成及生態(tài)功能

Donlan等通過掃描電子顯微鏡和激光共聚焦掃描顯微鏡等儀器觀測(cè)到了生物膜的形態(tài)和結(jié)構(gòu)，他們將生物膜定義為一種包含在自身分泌的胞外聚合物（EPS）中的復(fù)雜生物群落［15］。自然界中的生物膜不是由單個(gè)微生物形成，而是由多種微生物相互聚合在一起，黏附于物體表面，并且能夠通過基因表達(dá)來適應(yīng)環(huán)境的變化。生物膜可以黏附在許多界面上，例如生物組織、醫(yī)療器械、污水管道、作物根系、土壤顆粒等各種自然或非自然界面［5，16-18］。與游離細(xì)菌相比，生物膜分泌的EPS能夠?yàn)榘趦?nèi)的細(xì)菌提供營養(yǎng)物質(zhì)、響應(yīng)外界不良環(huán)境的刺激；同時(shí)也可作為生物膜外部消化系統(tǒng)增強(qiáng)細(xì)胞的代謝能力［7，19-20］。

1.1 土壤生物膜的組成和形成過程

土壤生物膜主要由兩部分組成，即微生物細(xì)胞和分泌的EPS。從微生物黏附開始，隨后產(chǎn)生和積累由1種或多種聚合物質(zhì)組成的細(xì)胞外基質(zhì)，如蛋白質(zhì)、多糖、腐殖酸物質(zhì)、細(xì)胞外DNA（eDNA），有時(shí)還有其他分子，如參與細(xì)胞間通訊的信號(hào)分子［8］，其中含量占比最多的是多糖和蛋白質(zhì)。

土壤生物膜的形成不是一個(gè)恒定的過程，它會(huì)根據(jù)外部環(huán)境的變化來作出相對(duì)應(yīng)的動(dòng)態(tài)響應(yīng)。在自然生態(tài)環(huán)境中，土壤生物膜的形成是一個(gè)復(fù)雜并由多種微生物相互作用的過程，膜內(nèi)各種微生物通過一系列的基因表達(dá)來應(yīng)對(duì)外部環(huán)境的刺激。土壤生物膜的形成過程一般可劃分成4個(gè)階段（圖1）。第一階段為微生物的黏附。微生物在物質(zhì)界面的黏附作用是生物膜形成的開始，微生物通過土壤空氣的流動(dòng)到達(dá)物質(zhì)界面，經(jīng)過布朗運(yùn)動(dòng)、鞭毛運(yùn)動(dòng)、物理化學(xué)運(yùn)動(dòng)等運(yùn)動(dòng)方式相互聚集在一起，同時(shí)分泌出多糖、鞭毛蛋白等胞外基質(zhì)形成初步黏附［21］。起始階段，由于胞外基質(zhì)分泌較少導(dǎo)致細(xì)胞與物質(zhì)界面聯(lián)系不緊密，呈現(xiàn)的是可逆狀態(tài)的黏附作用；但隨著微生物分泌胞外物質(zhì)（多糖、蛋白質(zhì)、脂質(zhì)和eDNA等）的增加，達(dá)到足以改變自身的形態(tài)特征時(shí)，生物膜與物質(zhì)表面形成緊密的黏附，呈現(xiàn)出不可逆狀態(tài)［8］。第二階段為生物膜的初步形成。包裹在膜內(nèi)的各種微生物快速地生長繁殖、分裂，并不斷積累空氣流動(dòng)中的游離微生物，在界面上分散、擴(kuò)大形成具有一定形態(tài)的菌落聚集體［22-23］。第三階段為生物膜的成熟，各種微生物之間以胞外基質(zhì)為基礎(chǔ)相互聯(lián)系，構(gòu)建出成熟穩(wěn)定的三維立體生物膜；這一階段形成的生物膜具有特定的空間結(jié)構(gòu)和功能，并且能夠?qū)ν饨绲牟涣即碳ぷ龀鲰憫?yīng)［24］。第四階段為生物膜的分解階段。因在有限空間內(nèi)養(yǎng)分的耗盡或有毒物質(zhì)的超負(fù)荷造成生物膜結(jié)構(gòu)崩塌，生物膜細(xì)胞發(fā)生解體回歸游離狀態(tài)進(jìn)入外部環(huán)境，它們也可能在新的界面重新黏附形成新的生物膜，這一過程是生物膜的傳播和更新［25］。

1.2 生物膜的功能

生物膜可以被看成是一座“圍城”，胞外基質(zhì)就是“城墻”，它能夠保護(hù)膜內(nèi)細(xì)胞避免遭外部極端環(huán)境的干擾。大量具有功能多樣性的官能團(tuán)存在于生物膜表面，為生物膜發(fā)育提供了許多好處，例如：營養(yǎng)物質(zhì)的吸收、調(diào)控膜內(nèi)物質(zhì)的穩(wěn)定以及對(duì)外界環(huán)境變化的響應(yīng)等。生物膜的胞外消化系統(tǒng)存在于生物膜內(nèi)部，由微生物分泌的胞外聚合物質(zhì)和酶組成，通過它們來吸收外界的水分和養(yǎng)料物質(zhì)，同時(shí)膜內(nèi)的酶能夠分解自身的基底物質(zhì)來獲取養(yǎng)分［26］。

1.2.1 高效攝取養(yǎng)分

生物膜形成后，微生物獲取養(yǎng)分的效率要顯著高于單個(gè)游離態(tài)微生物。生物膜攝取養(yǎng)分主要依賴于微生物細(xì)胞所分泌的EPS，EPS能促進(jìn)外部環(huán)境與生物膜間的物質(zhì)運(yùn)輸和能量交換，如養(yǎng)分吸收、氣體排放以及各種離子、分子交換等［27］。

生物膜獲取養(yǎng)分的過程十分復(fù)雜，細(xì)胞質(zhì)、細(xì)胞壁和細(xì)胞外基質(zhì)等不同部位的吸收機(jī)制和結(jié)合位點(diǎn)各不相同， 使環(huán)境中的陰離子和陽離子都能夠被吸收，當(dāng)生物膜內(nèi)存在養(yǎng)分濃度梯度差時(shí)，營養(yǎng)物質(zhì)以吸收位點(diǎn)為通道進(jìn)入膜內(nèi)細(xì)胞［28］。即使在濃度很低的營養(yǎng)環(huán)境條件下，生物膜也能通過這種吸附作用使微生物存活下來。生物膜的吸附作用是被動(dòng)運(yùn)輸，在運(yùn)輸養(yǎng)分的同時(shí)也會(huì)有有毒物質(zhì)的運(yùn)輸，有毒物質(zhì)的積累會(huì)損害生物膜的結(jié)構(gòu)甚至?xí)斐善浔缐模?9］。生物膜結(jié)構(gòu)破壞后，部分細(xì)胞死亡或裂解，細(xì)胞殘?bào)w會(huì)保存在胞外基質(zhì)中被酶降解形成養(yǎng)分提供給其他細(xì)胞。Pinchuk等發(fā)現(xiàn)， 在枯草芽孢桿菌生物膜中，死亡細(xì)胞的DNA會(huì)被胞外酶分解形成磷源和碳源，為其他活性細(xì)胞提供能量［30］。相比于游離微生物，形成生物膜的微生物有更廣泛的養(yǎng)分來源，生物膜中所有的成分都會(huì)留在細(xì)胞外基質(zhì)中，形成有效的物質(zhì)循環(huán)。

1.2.2 抵御外部環(huán)境脅迫

生物膜的EPS能夠?qū)饘訇栯x子進(jìn)行阻隔作用，防止其進(jìn)入膜內(nèi)。Geng等通過研究發(fā)現(xiàn)，EPS能夠聚集外部環(huán)境中的鉛、鎘、鋅等重金屬離子［31］。生物膜的形成會(huì)受到這種聚集作用影響，這種聚集作用也能促進(jìn)生態(tài)環(huán)境中金屬的運(yùn)輸。當(dāng)過高的重金屬離子濃度對(duì)細(xì)菌有損傷刺激時(shí)，生物膜會(huì)聚集銅、鋅、鐵、鋁等重金屬陽離子來進(jìn)行絡(luò)合作用或沉淀，減少其對(duì)生物膜的毒害［32］。

生物膜內(nèi)含有大量的腐殖質(zhì)和活化酶，能夠增強(qiáng)微生物對(duì)干旱、高溫等不利環(huán)境的耐受能力。在干旱環(huán)境下，疏水分子會(huì)不斷地積累在生物膜基質(zhì)中，減少生物膜中水分的流失，同時(shí)形成一層保護(hù)屏障來降低水分的蒸發(fā)以此來保護(hù)生物膜。Weaver等將缺水生物膜放回水分充足的環(huán)境中發(fā)現(xiàn)，原本因缺水而失活的酶重新活躍起來［33］；對(duì)比未形成生物膜的浮游細(xì)菌，擁有胞外基質(zhì)保護(hù)的膜內(nèi)細(xì)菌有更高的干旱耐受性［34］?？梢姡锬さ男纬墒俏⑸锉Ｗo(hù)自身免受外部環(huán)境迫害的一種生存策略，不同微生物間相互作用分泌各種活性物質(zhì)來抵御不良環(huán)境的危害，提高了微生物的存活機(jī)率。

1.2.3 充當(dāng)胞外消化系統(tǒng)

生物膜內(nèi)細(xì)胞分泌的胞外酶會(huì)存儲(chǔ)在生物膜胞外基質(zhì)中，胞外酶可以和胞外聚合物質(zhì)相互作用［8］。游離態(tài)細(xì)菌分泌的胞外酶沒有胞外基質(zhì)進(jìn)行依托，因此會(huì)隨著細(xì)菌的移動(dòng)而擴(kuò)散，逐漸遠(yuǎn)離細(xì)胞，所以其胞外酶的作用效果并不明顯；而生物膜分泌的胞外酶相對(duì)集中，可以更有效地利用胞外酶去降解物質(zhì)而轉(zhuǎn)化成自身所需的養(yǎng)分物質(zhì)，胞外基質(zhì)就像是生物膜的一個(gè)胞外代謝系統(tǒng)［35］。已經(jīng)有多種細(xì)胞外酶被發(fā)現(xiàn)存在于陸地和水生生態(tài)系統(tǒng)中［36］。生物膜中的胞外酶是所有膜內(nèi)微生物都可以驅(qū)使的，不局限于某一類微生物。Worm等通過研究蛋白水解和非蛋白水解銅綠假單胞菌形成的生物膜，發(fā)現(xiàn)蛋白水解細(xì)菌分泌的降解酶可以分解非蛋白水解細(xì)菌分泌的蛋白質(zhì)，生物膜中所有微生物能夠共享膜內(nèi)細(xì)胞分泌的酶［37］。生物膜中不同種類的微生物分泌各種胞外酶進(jìn)入胞外基質(zhì)中，胞外酶的效果各不相同，極大地提高了生物膜中各種物質(zhì)的消化效率，增加了養(yǎng)分來源。

除上述3種功能外，其他功能還包括吸附重金屬離子［38］、降解抗生素［39］、提高土壤養(yǎng)分［40］等。生物膜已然成為研究熱點(diǎn)，近些年也不斷涌現(xiàn)出各種生物膜的培養(yǎng)裝置以及檢測(cè)技術(shù)，有關(guān)生物膜的常見培養(yǎng)裝置及關(guān)鍵測(cè)定技術(shù)總結(jié)如下。

2 生物膜的培養(yǎng)裝置

生物膜的培養(yǎng)因?qū)?shù)據(jù)獲取的精度要求不同而有所差異。以下介紹了幾種培養(yǎng)裝置，并將其優(yōu)缺點(diǎn)簡單的總結(jié)在表1中。

2.1 微量滴定板法

利用微量滴定板（圖2）培養(yǎng)生物膜是最常用的方法［41］。將菌液置于微孔中，在適當(dāng)溫度下靜置培養(yǎng)，細(xì)菌生物膜會(huì)在孔壁上形成。在不同時(shí)間段對(duì)附著在滴定板孔表面上的生物膜進(jìn)行染色之前，需要將孔清洗并且去除浮游細(xì)菌。微量滴定板分析是通過測(cè)定所有附著的細(xì)胞來計(jì)算生物膜生物量。但是，生物量的一部分可能是沉積在孔底部的細(xì)胞，被胞外聚合物所隱藏。因此，這種方式所得到的數(shù)據(jù)并不太精確。

2.2 卡爾加里培養(yǎng)裝置

在卡爾加里裝置（圖2）中，生物膜的形成是在蓋子上進(jìn)行，蓋子由安裝在含有生長培養(yǎng)基和微生物的微量滴定板孔中的銷釘組成。生物膜附著在銷釘上，這就避免了細(xì)胞的沉積，體現(xiàn)了生物膜的黏附。在該裝置中，生物量定量需要用到超聲波來回收細(xì)胞，這就造成了一定的限制?？赡苤挥胁糠旨?xì)胞能夠通過超聲波進(jìn)行懸浮，通常在群落的 5%～90%之間［49-50］；分離群體的生理特性也不能夠完全反應(yīng)出黏附細(xì)胞的生理特性，因?yàn)椴煌后w在材料上可能表現(xiàn)出不同的黏附和分離特性［51］。

2.3 生物膜環(huán)裝置

生物膜環(huán)裝置（圖3）是一種用于研究生物膜形成早期階段的方法［43，52］，該裝置主要基于細(xì)菌在表面形成生物膜時(shí)固定微球的能力。將細(xì)菌懸浮液與順磁性微球混合，然后裝入微量滴定板的孔中進(jìn)行培養(yǎng)，在不同時(shí)間點(diǎn)進(jìn)行直接測(cè)量，無需任何染色和清洗步驟。首先，在孔上覆蓋一層對(duì)比液（一種惰性不透明油），能夠使用專門的生物膜環(huán)掃描儀器讀取微量滴定板；然后將滴定板放置在一個(gè)由單個(gè)磁鐵組成的塊上，在孔底部中間放置1 min。磁鐵作用后，游離（未堵塞）的磁性微珠集中在孔底部中心位置，形成一個(gè)黑色圓點(diǎn)或圓環(huán)；而被細(xì)胞固定的則保持在原位置。生物膜環(huán)裝置不需要對(duì)最初接種物進(jìn)行干預(yù)，如染色或固定，從而避免了人員操作上的結(jié)果偏差。但與微量滴定板一樣，生物膜環(huán)裝置對(duì)重力沉降很敏感，然而由于其主要用于早期生物膜形成時(shí)，這個(gè)問題可能不那么重要。

2.4 流室法

流室法是一種動(dòng)態(tài)培養(yǎng)生物膜的方式，由通過管道連接的2個(gè)液室組成（圖4）。啟動(dòng)流動(dòng)泵， 將適當(dāng)濃度的菌液通過玻片，使細(xì)菌能夠依附在玻片表面，培養(yǎng)液從一個(gè)液室流出，穿過流動(dòng)池，然后被另一個(gè)液室收集，黏附在玻片上的細(xì)菌逐漸向生物膜發(fā)展。在這種流動(dòng)的方式中，培養(yǎng)液會(huì)對(duì)生物膜產(chǎn)生一種沖刷力，即剪切力，對(duì)生物膜的生長和發(fā)育產(chǎn)生相當(dāng)重要的作用［44］。同時(shí)，生物膜的生長狀況可以利用顯微鏡進(jìn)行實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)。流室法由于剪切力的存在所以會(huì)淘汰掉黏附能力弱的細(xì)菌，形成的生物膜量相對(duì)來說較少，并且保持裝置良好的氣密性并防止?jié)B漏是一大難點(diǎn)。但流室法可以直接接觸生物膜并取樣，能夠?qū)ι锬さ纳L狀況進(jìn)行實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)，如細(xì)菌的黏附、初始菌落的形成和成熟生物膜結(jié)構(gòu)的建立等。

2.5 微流體裝置

微流體提供了一個(gè)封閉的系統(tǒng)，生物膜可以與水動(dòng)力環(huán)境相互作用，并能夠開發(fā)數(shù)學(xué)模型來解釋這些相互作用的影響；同時(shí)，也可以揭示水動(dòng)力條件對(duì)生物膜發(fā)育的影響［46］。目前，現(xiàn)有的微流控裝置可以分為連續(xù)流動(dòng)裝置、紙基裝置和數(shù)字微流控裝置［53］，由通道、腔室、多孔壁、夾縫等結(jié)構(gòu)組成的微流體可制成人工微觀生態(tài)系統(tǒng)。微流控系統(tǒng)中的捕獲設(shè)備通常是光學(xué)顯微鏡（常規(guī)、熒光或共聚焦激光顯微鏡），為了追蹤微生物細(xì)胞，顯微鏡需要自動(dòng)聚焦和焦點(diǎn)偏移補(bǔ)償或者收集高分辨率圖像數(shù)據(jù)，通過對(duì)圖像和數(shù)據(jù)的處理獲取所需信息［47］。與傳統(tǒng)的方法相比，微流控的精度可達(dá)亞細(xì)胞，因此可從單細(xì)胞尺度上實(shí)現(xiàn)不同物理化學(xué)特性的生境［54］；液體流動(dòng)的性質(zhì)能夠調(diào)節(jié)養(yǎng)分、空氣、溫度等環(huán)境因素與生物膜之間的相互作用［55］。

3 生物膜的檢測(cè)技術(shù)

生物膜的生物量和活力可以通過微生物學(xué)或分子學(xué)方法來檢測(cè)，主要依賴于生物膜的物理和化學(xué)特性；顯微鏡技術(shù)可以更直觀地描述生物膜的空間結(jié)構(gòu)、異質(zhì)性及其與群落功能的聯(lián)系。表2總結(jié)了常用到的生物膜檢測(cè)技術(shù)及其優(yōu)缺點(diǎn)。

3.1 染色法

如圖5所示，利用生物膜內(nèi)物質(zhì)（如EPS）對(duì)某些染料或熒光染料的特異性結(jié)合和吸附，可以通過染色的辦法對(duì)生物膜進(jìn)行間接性定量測(cè)定。這種檢測(cè)方法可對(duì)活細(xì)胞、死細(xì)胞以及生物膜基質(zhì)中存在的一些成分進(jìn)行染色，因此非常適合于定量生物膜總生物量［56］。染色法適用于各種生物膜生物量的測(cè)定，但在洗滌染液過程中如操作不當(dāng)可能會(huì)分離和去除固著的細(xì)菌細(xì)胞，導(dǎo)致數(shù)據(jù)產(chǎn)生人工誤差，因此洗滌時(shí)需要控制好沖洗強(qiáng)度。

3.2 熒光原位雜交（fluorescent in situ hydridization，F(xiàn)ISH）

熒光原位雜交（圖6）利用熒光染料直接或間接標(biāo)記核酸探針，待標(biāo)記的探針與樣本的核酸序列堿基互補(bǔ)雜交后，將其置于顯微鏡下觀察。熒光染料的多樣性使得生物膜的觀察更具選擇性。這種技術(shù)的應(yīng)用能夠讓我們更深層次地對(duì)生物膜內(nèi)部物質(zhì)的分布有所認(rèn)識(shí)［21］，同時(shí)也能明確生物膜應(yīng)對(duì)外界環(huán)境變化時(shí)基因的表達(dá)和調(diào)控。熒光原位雜交能夠通過使用組合標(biāo)記技術(shù)識(shí)別更多的物種，其中每個(gè)物種用多個(gè)熒光探針標(biāo)記，然后光譜成像，對(duì)多物種生物膜形成的研究具有重大的意義。

3.3 光學(xué)相干斷層掃描（optical coherence tomography，OCT）

光學(xué)相干斷層掃描（圖7）是近年來發(fā)展較快的一種最具發(fā)展前景的新型層析成像技術(shù)，利用寬帶光源的低時(shí)間相干性分辨檢測(cè)樣品不同深度的反射光或背散射光，以獲取樣品的斷層掃描圖像。它能夠檢測(cè)生物膜不同深度層面的入射信號(hào)，通過掃描可以得到生物膜的三維結(jié)構(gòu)圖像，具有快速、無接觸、無損傷、成像分辨率高的優(yōu)點(diǎn)。Dreszer等對(duì)超濾膜表面生物膜應(yīng)用OCT進(jìn)行了觀測(cè)，發(fā)現(xiàn)生物膜呈“蘑菇”狀突起結(jié)構(gòu)，且生物膜厚度的局部差異是由這種突起結(jié)構(gòu)所引起［68］。

3.4 激光共聚焦掃描顯微鏡（confocal laser scanning microscope，CLSM）

激光共聚焦掃描顯微鏡（圖8）出現(xiàn)在20世紀(jì)后期，是一種廣泛應(yīng)用的新技術(shù)。它將一些現(xiàn)代科學(xué)技術(shù)（如激光、電子攝像、計(jì)算機(jī)圖像處理等）相結(jié)合，是研究生物膜常用和有效的原位觀測(cè)儀器。

CLSM在傳統(tǒng)熒光多功能顯微鏡成像的基礎(chǔ)上安裝了激光掃描裝置，通過紫外線或可見光觸發(fā)熒光探測(cè)器，并利用計(jì)算機(jī)對(duì)所觀測(cè)的對(duì)象進(jìn)行數(shù)碼影像處理觀察、數(shù)據(jù)分析并傳輸，由此獲得了生物膜內(nèi)微觀構(gòu)造的熒光圖像信息。其最大的優(yōu)勢(shì)是可以對(duì)生物膜進(jìn)行斷層掃描和成像，無損傷地觀測(cè)和分析生物膜的三維空間結(jié)構(gòu)［62］，能夠得到生物膜的厚度、粗糙度等信息。Xue等分別將銅綠假單胞菌和突變菌形成的生物膜進(jìn)行染色，用激光共聚焦顯微鏡成像后發(fā)現(xiàn)，與銅綠假單胞菌生物膜相比，突變菌生物膜的厚度顯著降低，粗糙度顯著增加［69］。

3.5 原子力顯微鏡（atomic force microscope，AFM）

原子力顯微鏡是一種功能強(qiáng)大的、無損生物樣品的納米到微米級(jí)成像技術(shù)（圖9），通過測(cè)量生物試樣表面與一些微力敏感元件間的極輕微的原子間作用力，來探究生物膜表面的構(gòu)造和特性。原子力顯微鏡通過掃描樣本可以再現(xiàn)生物膜的三維結(jié)構(gòu)圖；樣品不需要進(jìn)行前處理，沒有二次傷害；能夠測(cè)定生物膜細(xì)胞水平或分子水平上的硬度、彈性、黏性等機(jī)械結(jié)構(gòu)［70］。Oh等利用原子力顯微鏡對(duì)生物膜的壓痕進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果表明成熟的生物膜會(huì)積累胞外聚合物，促使生物膜細(xì)胞的彈性和黏性得以增強(qiáng)［71］。Steinberger 等在納米級(jí)尺度上利用原子力顯微鏡對(duì)銅綠假單胞菌生物膜進(jìn)行觀察發(fā)現(xiàn)，在低濃度環(huán)境條件下，細(xì)菌主要以增加菌體長度的策略來應(yīng)對(duì)外界環(huán)境的刺激［72］。

4 結(jié)論與展望

微生物是地球生命系統(tǒng)中的重要組分，由微生物聚集形成的生物膜對(duì)人類的健康、工業(yè)效率和農(nóng)業(yè)環(huán)境有著重要的影響。土壤環(huán)境的空間和化學(xué)異質(zhì)性使得在土壤顆粒尺度上觀測(cè)生物膜形成的難度增大，也幾乎不可能在原位觀察土壤生物膜，因此土壤生物膜的發(fā)育信息和生理學(xué)性質(zhì)常通過模擬體系來獲得。為最大程度地模擬土壤生物膜在自然條件下的發(fā)育過程，研究者們構(gòu)建了各式各樣的生物膜反應(yīng)器，比如文中提到過的卡爾加里培養(yǎng)、流動(dòng)法等［42，49-50］。利用這些模擬體系結(jié)合光學(xué)顯微鏡技術(shù)可以得到生物膜結(jié)構(gòu)、功能、物種多樣性以及生理學(xué)性質(zhì)等信息，這對(duì)于了解土壤生物膜至關(guān)重要。

本實(shí)驗(yàn)室前期探究了生物膜對(duì)天然及工程納米顆粒的響應(yīng)，采用了染色法、傅里葉變換紅外光譜（FTIR）、激光共聚焦顯微鏡（CLSM）、高分辨率的電子顯微鏡（SEM、AFM）、等溫滴定微量熱儀（ITC）、石英晶體微天平（QCM-D）等現(xiàn)代分析手段，對(duì)土壤環(huán)境中納米顆粒及微生物效應(yīng)進(jìn)行了評(píng)估，結(jié)果表明，低濃度納米顆粒刺激細(xì)菌釋放更多信號(hào)分子來促進(jìn)生物膜形成［73］，成熟生物膜對(duì)納米顆粒有更強(qiáng)的耐受性［13］；細(xì)胞毒性的產(chǎn)生是由于納米顆粒與細(xì)菌細(xì)胞直接接觸和內(nèi)生化進(jìn)入細(xì)胞所引起且納米顆粒能夠加速成熟生物膜中細(xì)胞的解體［73-74］。

以往針對(duì)單一物種形成的生物膜展開了較多研究，但是在自然界中多物種生物膜的存在形式才是常態(tài)，目前我們所獲取的有關(guān)多物種生物膜的信息還十分缺乏。結(jié)合筆者所在課題組前期研究成果以及目前土壤多物種生物膜研究面臨的問題，未來需要從以下幾個(gè)方面展開研究：（1） 進(jìn)行多物種生物膜與土壤礦物的相互作用研究，探索礦物對(duì)多物種生物膜中微生物間的競爭、協(xié)作、信息傳遞等的影響；（2） 多物種生物膜的形成對(duì)土壤團(tuán)聚體形成、穩(wěn)定性，土壤肥力的保持和養(yǎng)分循環(huán)的作用；（3） 多物種生物膜對(duì)有毒物質(zhì)（如重金屬等）、有機(jī)污染物（如抗生素等）的吸附和降解機(jī)制，揭示生物膜的生態(tài)環(huán)境效益；（4） 采用更加先進(jìn)的研究技術(shù)手段，如拉曼光譜技術(shù)、同步輻射光譜技術(shù)、組學(xué)技術(shù)等對(duì)多物種生物膜的形貌、熱力學(xué)特征、EPS組成及其功能、基因調(diào)控機(jī)制等方面進(jìn)行研究，這些技術(shù)對(duì)研究多物種生物膜結(jié)構(gòu)和功能有著重要作用；同時(shí)，也將加深我們對(duì)多物種生物膜的發(fā)育和演變的了解。

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