基于基因測序技術分析肛瘺患者微小RNA的表達特點及功能

蔡濤 李志 冷羽 張?zhí)┪?曹波 吳雪峰 景茂林 張琪琦 吳媛媛 王雪亮 李歡

肛瘺是肛門直腸部位的常見疾病,多為肛周膿腫發(fā)展的延續(xù)[1]。近年來隨著生活及飲食模式的變化,肛腸疾病的發(fā)病率持續(xù)上升,肛腸疾病發(fā)病率在成年人中達50.1%,我國肛瘺發(fā)病率占肛腸病的1.67%～3.60%[2,3]。microRNA(miRNA)是小的內(nèi)源性非編碼 RNA,已被證明可以影響許多重要的生物學過程,如細胞生長、組織分化、細胞增殖、胚胎發(fā)育和細胞凋亡。因此,miRNA 功能的失調(diào)會導致人類發(fā)生疾病[4]。發(fā)現(xiàn)miRNA、確定其靶標并進一步推斷 miRNA 功能已成為了解 miRNA 的正常生物學過程及其在疾病發(fā)展中的作用的關鍵策略。多項研究表明,包括癌癥、心血管和代謝疾病在內(nèi)的無數(shù)生理過程和病理過程均高度依賴于miRNA[5]。然而,對于肛瘺的特征性miRNA及其相關通路的研究報道卻十分有限。RNA測序(RNA-Seq)是近年來發(fā)展較為成熟的高通量測序技術,具有快捷分析、高分辨率等優(yōu)勢[6]。目前國內(nèi)外鮮有關于肛瘺患者特征性表達miRNA的報道,既往有課題組通過基因檢測技術共得出13個差異表達的miRNA,但該研究存在樣本量較小等不足[7]。為得到更加準確的研究結果,本研究納入6例極具代表性的高位復雜性肛瘺患者,采用RNA-Seq技術篩選出在肛瘺組織中特異性表達的miRNA,進一步豐富肛瘺患者特征性表達miRNA的數(shù)據(jù)庫,旨在為臨床中肛瘺的診斷及防治提供一定的證據(jù)及思路。

1 資料與方法

1.1 一般資料 病例均來源于貴州中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院肛腸科2021年10月至2021年11月符合納入標準的高位復雜性肛瘺住院手術患者,本研究共計納入6例極具代表性的患者。所有患者簽署知情同意書,并通過醫(yī)院倫理審查。

1.2 納入與排除標準 納入標準:(1)符合2006 年中華中醫(yī)藥學會肛腸分會,中華醫(yī)學會外科學分會結直腸肛門外科學組,中國中西醫(yī)結合學會大腸肛門病專業(yè)委員會制定的《肛瘺臨床診治指南》高位復雜性肛瘺診斷;(2)經(jīng)歷≥2次肛瘺手術治療均未治愈;(3)年齡30～50 歲;(4)無糖尿病、高血壓、嚴重慢性肝腎功能不全等基礎疾病;(5)患者簽署知情同意書,并符合醫(yī)學倫理學相關規(guī)定。排除標準:(1)精神障礙患者;(2)嚴重心肺及肝腎功能不全患者或孕婦。

1.3 方法 (1)分組及取材:將6例患者按照入院先后順序隨機分為3組,每組各2例,每例患者均取手術切除的瘺管組織標本及瘺管遠端正常組織標本,形成自身配對對比。標本采集后,采用PBS緩沖液反復沖洗血污,直至沖洗液接近無色,然后立即將組織置于凍存管液氮預處理,隨后放入干冰中保存轉運。最終將3組測序結果進行整合分析。(2)實驗流程按照Illumina公司提供的標準步驟執(zhí)行,包括制備文庫和測序實驗。小RNA測序文庫制備采用TruSeq Small RNA Sample Prep Kits(Illumina,San Diego,USA)試劑盒。文庫制備工作完成后,對構建好的文庫使用 Illumina Hiseq2500 進行測序,測序讀長為單端 1X50bp。

1.4 信息分析流程

1.4.1 miRNA差異表達分析:本研究采用浙江杭州聯(lián)川生物自主開發(fā)的ACGT101-miR(LC Sciences,Houston,Texas,USA)軟件,該軟件的分析流程如下:①去除3’接頭和垃圾序列:獲取clean data;②長度篩選:保留堿基長度在18-26nt的序列;③各種RNA數(shù)據(jù)庫比對分析:將剩余序列比對(不包含miRNA)mRNA、RFam和Repbase數(shù)據(jù)庫,并進行過濾;④miRNA鑒定:獲取有效數(shù)據(jù),并比對前體和基因組進行miRNA鑒定;⑤采用T檢驗,進行miRNA差異性分析。

1.4.2 差異性miRNA靶基因預測分析:針對動物物種,使用TargetScan、miRanda兩款軟件對顯著性差異的miRNA分別進行靶基因預測。對兩款軟件預測出的靶基因分別按照每款軟件的評分標準進行篩選。TargetScan算法中去除context score percentile<50的靶基因,miRanda算法中去除最大自由能(Max Energy)>-10的靶基因。最后取此兩款軟件的交集作為差異miRNA的最終靶基因。

1.4.3 富集分析:富集分析主要包括兩部分,一部分是GO功能注釋,一部分是KEGG Pathway功能注釋。首先把所有選定miRNA對應的靶基因對應于每個功能或者每個通路注釋的gene數(shù)目統(tǒng)計出來,然后應用超幾何檢驗,找出與所有選定miRNA對應的靶基因mRNA與注釋庫中的GO或者KEGG pathway對應的gene數(shù)量(全部具備功能注釋的基因,或者全部具備功能注釋的miRNA靶基因)相比,計算得到P-value ≤ 0.05為閾值,滿足此條件的功能定義為miRNA-mRNA關系對中顯著富集的功能。通過功能顯著性富集分析能確定miRNA-mRNA關系對行使的主要生物學功能。

2 結果

2.1 差異miRNA表達水平分析 本研究共測得1116個差異表達的miRNA,共20個miRNA表達水平差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05),其中hsa-miR-432-3p、hsa-miR-181b-5p_R+1和hsa-miR-30d-3p表達水平具有明顯差異(P<0.01)。在表達水平升高的miRNA中,hsa-miR-2355-3p在肛瘺瘺管壁組織中表達水平是遠端正常組織的7.07倍,hsa-miR-3910在肛瘺瘺管壁組織中表達水平是遠端正常組織的3.01倍,bta-miR-2478_L-1_1ss2TA在肛瘺瘺管壁組織中表達水平是遠端正常組織的2.99倍;在表達水平降低的miRNA中,hsa-miR-1277-3p在肛瘺瘺管壁組織中表達水平僅占遠端正常組織的8%,hsa-miR-616-5p在肛瘺瘺管壁組織中表達水平僅占遠端正常組織的10%,hsa-miR-223-5p_R+1在肛瘺瘺管壁組織中表達水平僅占遠端正常組織的39%。見圖1～4,表1。

表1 差異表達的miRNA

圖1 20個差異表達miRNA的聚類分析圖

圖2 差異表達miRNA火山圖 圖3 差異表達miRNA韋恩圖 圖4 2組差異表達的miRNA

2.2 靶基因預測及富集分析結果

2.2.1 靶基因預測:對差異表達的20個miRNA進行靶基因預測,結果顯示20個miRNA均預測到靶基因,共計預測到85510個靶基因。其中表達水平差異較顯著的hsa-miR-432-3p所預測到的評分較高的主要靶基因包括MSTN、ITGAV、YPEL5、LARS1、ASB15等,hsa-miR-181b-5p_R+1所預測到評分較高的主要靶基因包括YTHDC2、RPS6KB1、KLHL2、IL2、PRDM4等,hsa-miR-30d-3p所預測到評分較高的主要靶基因包括CCN3、DNAJC27、ZCCHC14、GLRA3、FSTL1等。

2.2.2 GO富集分析:結果顯示,每個基因參與的子條目分別是:生物功能、細胞組分、分子功能。本研究有差異表達的20個miRNA靶基因參與的生物過程包括:轉移酶活性、調(diào)控轉錄、三磷酸腺苷結合、金屬離子結合、DNA結合、核酸結合、核苷酸結合、細胞骨架、細胞投影、細胞連接、RNA聚合酶對轉錄的正調(diào)控作用、胞內(nèi)信號轉導等。細胞組分:細胞核、核質、細胞質、細胞溶質。分子功能:激酶。見圖5、6。

圖5 GO富集分析

圖6 GO富集分析結果統(tǒng)計圖

2.2.3 KEGG富集分析:通過KEGG富集分析顯示,與本研究中差異表達的20個miRNA密切相關的信號通路主要包括癌通路、癌癥中的蛋白聚糖、磷脂酰肌醇信號系統(tǒng)、胰腺癌、神經(jīng)營養(yǎng)因子信號通路、長時程抑制、炎癥介質調(diào)節(jié)TRP通道、肝細胞癌、谷氨酸突觸、黏著斑、慢性粒細胞白血病以及Ras、Rap1、PI3K-Akt、cAMP、MAPK、Hippo、ErBb、Calcium、Apelin等通路。見圖7。

圖7 KEGG富集分析

3 討論

肛瘺作為臨床的常見病、多發(fā)病,目前主要通過手術治療,然而由于肛門解剖位置的特殊性,常導致術后創(chuàng)面難愈且并發(fā)癥較多,是肛腸外科醫(yī)生所面臨的巨大難題。MicroRNAs(miRNAs)是大小為19～25個核苷酸的內(nèi)源性小RNA,作為一種新興的研究領域逐漸成為研究的熱點。20多年前,第一個微小RNA(miRNA)的發(fā)現(xiàn)開啟了分子生物學的新紀元。迄今為止,已經(jīng)在人類中發(fā)現(xiàn)了2000多種miRNA,它們可通過抑制mRNA翻譯或促進mRNA降解,從而調(diào)控人類基因組中約三分之一的基因。一種miRNA 可以同時靶向位于同一細胞信號通路中的多個基因[8-10]。miRNA與許多人類疾病有關,已被廣泛用作臨床診斷和治療的靶點。對于生物學家來說,定義 miRNA 的目標集是理解其生物學作用的關鍵;而對于開發(fā) miRNA 療法的醫(yī)學學者而言,經(jīng)過驗證的靶標為確定 miRNA 模擬物或抑制劑的功效提供了最佳生物標志物。因此,對疾病的特征性miRNA 及其靶基因、信號通路、生物功能等方面的研究顯得十分重要[11]。

miRNA 靶點預測在整個工作流程中占據(jù)核心位置,是揭示 miRNA 功能并將 miRNA 與其他 RNA(mRNA、lncRNA 和 circRNA)聯(lián)系起來的關鍵步驟。本研究采用基因測序技術,共測得20個差異有統(tǒng)計學意義的特征性miRNA。通過靶基因預測,并進一步GO及KEGG富集分析,結果顯示,本研究得到的差異表達的20個miRNA靶基因所參與的生物過程主要包括:轉移酶活性、調(diào)控轉錄、三磷酸腺苷結合、金屬離子結合、DNA結合、核酸結合、核苷酸結合、細胞骨架、細胞投影、細胞連接、RNA聚合酶對轉錄的正調(diào)控作用、胞內(nèi)信號轉導等,細胞組分主要包括細胞核、核質、細胞質、細胞溶質,分子功能主要包括激酶。與本研究中差異表達的20個miRNA密切相關的信號通路主要包括癌通路、癌癥中的蛋白聚糖、磷脂酰肌醇信號系統(tǒng)、胰腺癌、神經(jīng)營養(yǎng)因子信號通路、長時程抑制、炎癥介質調(diào)節(jié)TRP通道、肝細胞癌、谷氨酸突觸、黏著斑、慢性粒細胞白血病以及Ras、Rap1、PI3K-Akt、cAMP、MAPK、Hippo、ErBb、Calcium、Apelin等通路。

研究發(fā)現(xiàn)MAPK-RAS信號通路與細胞生長、分化、增殖、凋亡和遷移功能密切相關,與癌癥的發(fā)生發(fā)展聯(lián)系密切,被認為是癌癥治療的潛在治療靶點[12]。此外,劉宏偉等[13,14]研究發(fā)現(xiàn),RAS通路在慢性難愈性創(chuàng)面中,對促進皮膚損傷修復和再生發(fā)揮重要調(diào)控作用。不僅如此,多項研究表明,增強 RAS/RAF/ERK 信號通路的活性,可顯著促進血管新生,從而促進創(chuàng)面愈合[15-21]。PI3K-Akt 信號通路涉及許多生物過程,包括細胞周期、細胞凋亡、血管生成和葡萄糖代謝[22]。PI3K/Akt 通路是細胞增殖和凋亡必不可少的途徑,在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中起著重要作用[23]。已經(jīng)證實抑制PI3K/Akt可以抑制腫瘤細胞增殖并在體外和體內(nèi)誘導細胞凋亡。PI3K抑制劑可能靶向腫瘤血管生成以增強癌癥治療,也可能是靶向傷口血管生成,促進創(chuàng)面愈合的靶點。由上可知,RAS、MAPK、PI3K-Akt等通路的抑制也可能是肛瘺術后創(chuàng)面難愈的機制之一,上述通路也可能成為促進肛瘺術后創(chuàng)面愈合的治療靶點之一。近期研究發(fā)現(xiàn),Rap1可能會拮抗 Ras蛋白,要么通過競爭共同目標,要么通過作為G蛋白轉導抑制性生長信號,對抗成纖維細胞中的Ras生長促進信號[24]。因此,Rap1的過表達,可能會延遲創(chuàng)面的愈合。環(huán)磷酸腺苷(cAMP)是第一個發(fā)現(xiàn)的第二信使,在細胞信號傳導中起關鍵作用,并調(diào)節(jié)許多生理和病理過程。cAMP 可以調(diào)節(jié)多種靶基因的轉錄,主要通過蛋白激酶 A(PKA)及其下游效應子如 cAMP 響應元件結合蛋白(CREB)。此外,PKA 可以磷酸化多種激酶,如 Raf、GSK3 和 FAK。異常的 cAMP-PKA 信號傳導涉及各種類型的人類腫瘤。cAMP-PKA 信號可以調(diào)節(jié)癌細胞的生長、遷移、侵襲和代謝[25],值得注意的是,cAMP 信號既可能具有腫瘤抑制作用,又可能具有腫瘤促進作用,具體取決于腫瘤類型和背景。cAMP主要通過PKA、Epac1 和 Epac2調(diào)節(jié)多個細胞過程,包括遷移和黏著斑形成、心輸出量、神經(jīng)遞質釋放、葡萄糖穩(wěn)態(tài)、胞吐作用、細胞增殖、細胞分化和細胞存活[26]。Hippo通路是一種進化上保守的信號通路,在器官發(fā)育、上皮穩(wěn)態(tài)、組織再生、傷口愈合和免疫調(diào)節(jié)中起關鍵作用[27]。YAP/TAZ是Hippo通路的成員之一,YAP/TAZ在基底層干細胞控制中的作用在表皮發(fā)育和皮膚創(chuàng)傷修復中都很明顯。在皮膚基底層觀察到核YAP和TAZ定位,表達水平在傷口愈合時明顯升高。實驗證明,成年小鼠特異性敲除Yap1和Wwtr1后,皮膚組織損傷后的再生受到嚴重影響[28,29],提示YAP/TAZ活性在皮膚穩(wěn)態(tài)中是必不可少的,因為Yap1/SWwtr1缺失使基底層細胞增殖減慢,導致組織損傷[30]。

然而,本研究結果與其他研究結果也存在一定差異,裘建明等[7]通過檢測對比肛瘺并發(fā)混合痔的患者與單純混合痔患者手術切除的痔核近端肛管粘膜標本,共得出13個差異表達的miRNA,兩項研究結果有且僅有一個miRNA相同,即hsa-miR-181a-2-3p?？紤]出現(xiàn)此差異的原因主要與兩個研究所采用的標本及檢測技術不同相關。目前諸多檢測分析所得出的miRNA結果存在較大的差異,也是限制miRNA進一步研究的重要因素。

綜上所述,通過對肛瘺瘺管壁組織中特征性表達miRNA的檢測分析,發(fā)現(xiàn)大量與創(chuàng)面愈合密切相關的信號通路,提示Ras、PI3K-Akt、cAMP、MAPK、Hippo等通路的抑制,可能是肛瘺術后創(chuàng)面難愈的原因之一,這也與肛瘺術后創(chuàng)面屬于慢性難愈性創(chuàng)面的特點不謀而合。同時,Ras、PI3K-Akt、cAMP、MAPK、Hippo等通路也可能成為促進肛瘺術后創(chuàng)面愈合的潛在靶點,對于肛瘺的診治具有一定的指導意義。