分子模擬預(yù)測離子液體修飾南極假絲酵母脂肪酶B修飾位點(diǎn)

張曉光,魯澤平,徐 超,胡 燚

(南京工業(yè)大學(xué) 藥學(xué)院,材料化學(xué)工程國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,江蘇 南京 211800)

脂肪酶(EC 3.1.1.3)是一種絲氨酸水解酶,能夠催化三?；视退獬筛视秃椭舅帷；谥久冈谒?、酸解、醇解和酯交換過程中對各種底物的獨(dú)特催化活性,其被廣泛應(yīng)用于油脂化工、食品加工、制漿造紙、污水處理、制藥工程等領(lǐng)域[1-2]。然而,由于酶的空間結(jié)構(gòu)極易受到高溫、高鹽度、極端pH等多種因素的影響,這阻礙了其在諸多領(lǐng)域的實(shí)際應(yīng)用[3]。近年來,化學(xué)修飾被證實(shí)為一種有效的脂肪酶分子改造方法,通過化學(xué)修飾劑對蛋白質(zhì)表面特定的氨基酸進(jìn)行修飾,可以在一定程度上提高生物催化劑的性能[4-6]。

離子液體(ionic liquid,ILs)由于其獨(dú)特的性質(zhì)和可設(shè)計性,在酶催化領(lǐng)域中得到了廣泛的應(yīng)用[8-9]。在課題組之前的研究中,將咪唑、膽堿等不同類型的功能化離子液體對南極假絲酵母脂肪酶B(lipase B fromCandidaantarctica, CALB)、豬胰脂肪酶(lipase from porcine pancreatic, PPL)、褶皺假絲酵母脂肪酶(lipase fromCandidarugosa, CRL)等脂肪酶進(jìn)行了共價修飾[10-12]。結(jié)果發(fā)現(xiàn),離子液體作為修飾劑可以同時提高脂肪酶包括水解活性、穩(wěn)定性和選擇性等各種催化性能。近年來,分子模擬技術(shù)飛速發(fā)展,利用分子模擬對酶的性質(zhì)變化、反應(yīng)機(jī)制進(jìn)行合理分析,并進(jìn)一步指導(dǎo)酶在分子水平上的修飾成為當(dāng)前熱點(diǎn)。如從光滑念珠菌獲得的酮還原酶CgKR1表現(xiàn)出廣泛的底物特異性,但對大多數(shù)底物的催化活性很低。為了獲得高性能酮還原酶CgKR1突變體,Zheng等[13]利用分子動力學(xué)(MD)模擬、分子力學(xué)和分子對接法,識別出兩個關(guān)鍵殘基(Phe92和Phe94),解析出底物與酶突變體之間較高的結(jié)合親和力是提高催化酶活性的部分原因。Gong等[14]利用分子模擬技術(shù),研究了酮還原酶LbCR的兩種突變體A201D/A202L的結(jié)構(gòu)-功能關(guān)系,對不同結(jié)構(gòu)的分析表明,突變酶熱穩(wěn)定性的提高在很大程度上歸因于活性位點(diǎn)周圍形成額外的氫鍵和疏水相互作用。

本課題組在近期設(shè)計了4種新型手性脯氨酸離子液體修飾CALB,并利用肽質(zhì)量圖紋圖譜確定了修飾的位點(diǎn),將分子模擬技術(shù)與現(xiàn)代光譜學(xué)表征相結(jié)合,深入解析了離子液體修飾脂肪酶后酶學(xué)性能變化的機(jī)制[15]。然而,酶的化學(xué)修飾過程隨機(jī)性大,酶表面氨基酸殘基的分布,修飾劑種類的不同都會影響修飾位點(diǎn)和修飾度。不同脂肪酶的分子改造對離子液體修飾劑的分子結(jié)構(gòu)和修飾條件有不同的要求,修飾劑分子結(jié)構(gòu)設(shè)計具有較大的盲目性,修飾位點(diǎn)通常又需要繁瑣的肽譜解析過程才能確定,這對進(jìn)一步篩選高效的修飾劑造成了阻礙。在前期工作基礎(chǔ)上,本文擬運(yùn)用分子模擬技術(shù)建立一種簡單而新穎的預(yù)測修飾部位的方法,通過分析賴氨酸殘基的溶劑可及性面積(solvent accessible surface area,SASA)以及與周圍氨基酸的成鍵情況,篩選出最有可能被修飾的賴氨酸位點(diǎn)。本研究可以為以后理性指導(dǎo)脂肪酶催化性能強(qiáng)化改造及篩選具有卓越性能的離子液體修飾劑提供更加簡便、高效的方法。

1 模擬方法

所有的模擬都是在DELL-3620工作站上使用Gromacs 2018.1[16]軟件完成。CALB的初始結(jié)構(gòu)從蛋白數(shù)據(jù)庫中獲取(1TCA),分辨率為0.155 nm[17]。動力學(xué)模擬前,需要去除晶體結(jié)構(gòu)中的配體(N-乙酰-D-氨基葡萄糖NAG)分子,保留晶體結(jié)構(gòu)中的結(jié)晶水,兩性殘基設(shè)置為 pH=7.0時的電離狀態(tài)。

4種脯氨酸離子液體的結(jié)構(gòu)如圖1所示,首先設(shè)置好帶電荷的原子,使用Chemoffice 3D軟件自帶的分子力學(xué)2(molecular mechanics 2,MM2)力場對初始結(jié)構(gòu)進(jìn)行結(jié)構(gòu)優(yōu)化,使用Malde等[18]自動拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)生成器(automated topology builder,ATB)在線軟件生成Gromacs可以識別的4種脯氨酸離子液體的電荷及力場參數(shù)。之后,使用Gromacs自帶的建模命令構(gòu)建蛋白處在離子液體中溶劑體系。為盡量與實(shí)際實(shí)驗(yàn)條件吻合,所有模型模擬在277 K、1.01325 MPa、pH 7.0條件下進(jìn)行,用Martínez等[19]開發(fā)的Packmol軟件實(shí)現(xiàn)體系中離子液體的隨機(jī)分布。殘基的質(zhì)子化狀態(tài)由Li等[20]開發(fā)的PROPKA在線服務(wù)器預(yù)測。采用Gromacs 54a7力場、顯示模型簡單點(diǎn)電荷模型(simple point charge,SPC)、Darden等[21]開發(fā)的PME(particle mesh ewald)處理長程靜電作用,遠(yuǎn)程靜電截斷值為1.2 nm、遠(yuǎn)程范德華力(range van der Waals, rvdw)的截斷值為1.2 nm、壓力模擬體系采用Parrinello等[22]開發(fā)的Parrinello-Rahman算法(耦合常數(shù)為0.1 ps),溫度模擬采用Bussi等[23]開發(fā)的V-rescale算法(耦合常數(shù)為0.5 ps),用Jean-Paul等[24]開發(fā)的LINCS算法固定所有的共價鍵,相對偏差設(shè)為10-4。

圖1 脯氨酸離子液體修飾劑結(jié)構(gòu)[15]

模擬的具體步驟如下:體系采用周期性立方體cubic盒子,并將CALB置于中心,周圍填充100對離子液體陰陽離子對,其余部分采用spc216水模型填充,并在模型中加入7個Cl-來中和電荷,使體系整體的電荷為零。所有模擬體系采用最陡下降法優(yōu)化5 000步的能量,之后進(jìn)行500 ps的限制性動力學(xué)模擬確證體系已達(dá)到平衡。最后,進(jìn)行20 ns非限制性動力學(xué)模擬,步長為2 fs,每隔1 ps收集一次全部原子坐標(biāo),模擬結(jié)束后使用Gromacs自帶的分析命令分析蛋白整體構(gòu)象以及賴氨酸殘基的溶劑可及性面積變化,使用Humphrey等[25]開發(fā)的視覺分子動力學(xué)(visual molecular dynamics,VMD)可視化軟件進(jìn)行分析蛋白內(nèi)氫鍵和鹽橋作用,氫鍵的判定采用幾何判定準(zhǔn)則,角度截斷值設(shè)為120°,半徑截斷值設(shè)為0.35 nm。蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)圖采用Giacomo等[26]開發(fā)的PyMOL程序進(jìn)行繪制,CALB在水相以及4種離子液體溶劑體系的模型圖如圖2所示。

圖2 溶劑中CALB的分子動力學(xué)模擬

2 結(jié)果與討論

2.1 蛋白質(zhì)能量及結(jié)構(gòu)變化

圖3為CALB在5種溶劑體系中總能量的變化,在20 ns內(nèi),蛋白質(zhì)一直保持著較低的能量。圖4為在20 ns內(nèi)、在不同溶劑體系中,CALB蛋白的均方根偏差(RMSD)的變化。在水相中的模擬5 ns內(nèi)RMSD浮動較大,之后維持在0.13 nm左右波動。而在離子液體中的CALB的RMSD在前2.5 ns波動較大,之后蛋白的結(jié)構(gòu)迅速趨于穩(wěn)定。與在水相中相比,離子液體溶劑體系中的酶可以更快地進(jìn)入穩(wěn)定狀態(tài),這也與很多研究一致,離子液體作為溶劑時,可以提高酶的穩(wěn)定性[27]。通過模擬發(fā)現(xiàn),經(jīng)過20 ns的模擬,5種體系蛋白構(gòu)象均已基本平穩(wěn),證實(shí)該模型的合理性。

圖3 CALB在不同體系中總能量的變化

圖4 CALB在不同溶劑體系中RMSD的變化

2.2 溶劑可及性面積計算

溶劑可及性面積是描述蛋白質(zhì)親疏水性的重要參數(shù),它展現(xiàn)了蛋白在溶劑中暴露程度。氨基酸殘基越暴露,其發(fā)生化學(xué)修飾的可能性也越高。研究證實(shí),賴氨酸的氨基溶劑可及性面積越大,相應(yīng)的賴氨酸殘基側(cè)鏈ε-氨基反應(yīng)活性也越大[28-29]。脂肪酶CALB的主鏈中含有9個賴氨酸殘基,主鏈的構(gòu)象、周圍殘基側(cè)鏈及溶劑體系環(huán)境的影響使其可及性面積存在一定的差別。經(jīng)過20 ns的模擬,用Gromacs中自帶SASA分析命令進(jìn)行解析,結(jié)果如表1所示。由表1可知,在不同體系中CALB的溶劑可及性面積明顯不同,相同類型組成的離子液體受其構(gòu)型的影響,L型離子液體修飾后的總可及性面積要高于D型離子液體修飾后的可及性面積。當(dāng)構(gòu)型相同時,含咪唑陽離子的離子液體具有更強(qiáng)的疏水性,可以促使蛋白質(zhì)更大程度的開放,因此總可及性面積更大。從表1中可以看出,賴氨酸殘基的可及性面積與其所處的位置也有關(guān),處于主鏈兩端的賴氨酸殘基可及性面積相對較大,越接近中心的殘基可及性面積越小,由于CALB的9個賴氨酸殘基幾乎都分布在蛋白表面,這些殘基的最小可及性面積都在0.4 nm2以上,因此認(rèn)為,這些位點(diǎn)都可能發(fā)生修飾,為了準(zhǔn)確尋找離子液體與CALB的結(jié)合位點(diǎn),需要對氨基酸殘基進(jìn)行進(jìn)一步分析。

表1 賴氨酸殘基的溶劑可及性面積

2.3 鍵占據(jù)對修飾位點(diǎn)的影響

單一地考察氨基的溶劑可及性面積很難確定化學(xué)修飾的修飾位點(diǎn),需要更深入地分析殘基。通過模擬研究賴氨酸殘基與周圍殘基的位置關(guān)系以及是否存在相互作用,能夠判斷其能否被修飾。蛋白質(zhì)表面的殘基最易受到氫鍵和鹽橋的影響,因此可以通過分析在20 ns內(nèi),蛋白中形成這兩種鍵的殘基及數(shù)目,研究是否存在“鍵占據(jù)”現(xiàn)象。隨著分子動力學(xué)模擬的不斷進(jìn)行,在不同時間下,CALB蛋白的展開程度存在明顯不同,在軌跡后半段10～20 ns中共提取10 000幀的分子坐標(biāo)結(jié)構(gòu),通過分析存在氫鍵和鹽橋的幀數(shù)來判斷賴氨酸殘基的占據(jù)率。

2.3.1 氫鍵的影響

CALB蛋白表面氨基酸與周圍氨基酸可形成不同程度的氫鍵,這會影響賴氨酸側(cè)鏈氨基的修飾。趙軍等[29]的研究表明,當(dāng)賴氨酸與周圍氨基酸形成較強(qiáng)作用的氫鍵時,發(fā)生化學(xué)修飾的幾率將大大降低。CALB蛋白表面賴氨酸受結(jié)構(gòu)變化的影響,有一定的機(jī)率與周圍的殘基形成氫鍵,進(jìn)而導(dǎo)致修飾位點(diǎn)被占據(jù),難以發(fā)生修飾。表2為CALB在5種體系中形成氫鍵的幀數(shù)與提取幀數(shù)的比率,由表2可知,當(dāng)提取的10 000幀中出現(xiàn)氫鍵的幀數(shù)有2 000幀時,該殘基位點(diǎn)就很難與溶液中的修飾劑反應(yīng)了,筆者定義超過20%的幀數(shù)時,該殘基位點(diǎn)容易形成穩(wěn)定的氫鍵作用導(dǎo)致難以修飾。經(jīng)過氫鍵分析,發(fā)現(xiàn)構(gòu)型相同的[BMIM][N-AC-L-Pro]和[N-AC-L-Pro][Cl]離子液體中易修飾的位點(diǎn)均是Lys98、Lys124、Lys136、Lys290和Lys308這5個位點(diǎn),而構(gòu)型相同的[BMIM][N-AC-D-Pro]和[N-AC-D-Pro][Cl]則是Lys98、Lys124、Lys290和Lys308這4個位點(diǎn),其中Lys136位點(diǎn)在D構(gòu)型的離子液體中極為容易形成氫鍵,導(dǎo)致修飾難以發(fā)生。

表2 賴氨酸在不同溶劑體系中形成的氫鍵時間占比

2.3.2 鹽橋的影響

蛋白質(zhì)中的賴氨酸殘基容易與周圍酸性氨基酸(Asp或Glu)形成鹽橋,進(jìn)而影響修飾劑的引入。Shuvaev等[30]對載脂蛋白進(jìn)行糖基化時發(fā)現(xiàn),Lys75位殘基與Glu79殘基之間存在鹽橋作用,導(dǎo)致糖基化難度增加。同樣的,O’Brien等[31]探究乙二醇修飾辣根過氧化物酶(HRP)的修飾位點(diǎn)發(fā)現(xiàn),Lys65與Lys149分別與附近的Glu64與Asp258形成鹽橋,雖然Lys65與Lys149這兩個賴氨酸的溶劑暴露程度較高,但是由于鹽橋作用導(dǎo)致這兩個賴氨酸不容易被修飾。根據(jù)上述鹽橋可能影響賴氨酸的氨基反應(yīng)活性的觀點(diǎn),對離子液體體系環(huán)境下的CALB賴氨酸殘基形成的鹽橋進(jìn)行分析。表3為在20 ns內(nèi),CALB在不同體系中形成鹽橋的情況。由表3可知,受賴氨酸殘基周圍酸性氨基酸的數(shù)目限制,形成的鹽橋數(shù)目并不多。其中Lys98位殘基雖然具有較高的可及性面積以及較少的氫鍵作用,但是容易與鄰近的Asp126位殘基形成鹽橋,導(dǎo)致其不被修飾。

表3 賴氨酸在不同溶劑體系中形成的鹽橋

通過動力學(xué)模擬,結(jié)合溶劑可及性面積與“鍵占據(jù)”作用分析,確定了在Lys殘基在4種離子液體中容易被修飾的位點(diǎn),其中修飾劑的構(gòu)型對修飾位點(diǎn)具有一定的影響,L構(gòu)型離子液體中有4個易修飾位點(diǎn),D構(gòu)型的離子液體中有3個易修飾位點(diǎn),如圖5所示。由圖5可知,CALB經(jīng)過L構(gòu)型離子液體修飾的位點(diǎn)為Lys124、Lys136、Lys290以及Lys308,D構(gòu)型離子液體修飾的位點(diǎn)為Lys124、Lys290和Lys308,預(yù)測的結(jié)果與前期肽譜解析一致[13]。

圖5 預(yù)測離子液體中CALB的修飾位點(diǎn)

3 結(jié)論

1)根據(jù)殘基在溶劑中越暴露,越容易被修飾的原則,利用分子模擬手段分析了CALB在不同溶劑體系的賴氨酸殘基的SASA,由于CALB的賴氨酸殘基幾乎都分布在酶蛋白表面,暴露程度都較高,因此初步認(rèn)為這些位點(diǎn)都可能發(fā)生修飾。

2)單一的可及性面積分析并不能準(zhǔn)確地確定修飾位點(diǎn),進(jìn)而又引入氫鍵以及鹽橋這兩個影響不同位點(diǎn)賴氨酸修飾難易程度的因素,進(jìn)一步排除了反應(yīng)活性較低的氨基酸,在[BMIM][N-AC-L-Pro]和[N-AC-L-Pro][Cl]體系中酶蛋白因鍵占據(jù)難以被修飾的位點(diǎn)為Lys13、Lys32、Lys208、Lys271和Lys98,[BMIM][N-AC-D-Pro]和[N-AC-D-Pro][Cl]體系難以被修飾的位點(diǎn)為Lys13、Lys32、Lys208、Lys271、Lys136和Lys98。

3)結(jié)合溶劑可及面積與氫鍵、鹽橋兩個影響賴氨酸修飾難易程度的因素,最終篩選確定了4種離子液體化學(xué)修飾南極假絲酵母脂肪酶B的修飾位點(diǎn),[BMIM][N-AC-D-Pro]和[N-AC-D-Pro][Cl]修飾CALB最有可能的位點(diǎn)為Lys124、Lys290和Lys308,[BMIM][N-AC-L-Pro]和[N-AC-L-Pro][Cl]修飾CALB最有可能的位點(diǎn)為Lys124、Lys136、Lys290及Lys308,預(yù)測的位點(diǎn)與肽質(zhì)量指紋圖譜結(jié)果一致。本工作證明了分子模擬技術(shù)預(yù)測修飾位點(diǎn),理性指導(dǎo)脂肪酶化學(xué)修飾的可行性,為高效實(shí)現(xiàn)脂肪酶催化性能的全面提升奠定了基礎(chǔ)。