熒光劑–示蹤液體法檢查滴眼劑包裝密封完整性

江燕，任錕，馮霞蘭，張莞英，郭宏偉，趙代國

（1.四川省藥品檢驗(yàn)研究院（四川省醫(yī)療器械檢測(cè)中心），成都 611731；2.成都市金鼓藥用包裝有限公司，成都 611530）

藥品包裝系統(tǒng)密封完整性是一項(xiàng)涉及藥品質(zhì)量的重要物理監(jiān)測(cè)指標(biāo)，良好的包裝形式能夠防止藥品內(nèi)容物的損失，阻止微生物和有害物質(zhì)的進(jìn)入，從而保證藥品安全、穩(wěn)定[1]。歐美國家很早就認(rèn)識(shí)到包裝密封完整性的重要性，制定了USP<1207>、PDANO.27、ASTM F 2391—05 等一系列標(biāo)準(zhǔn)指南，為藥品包裝系統(tǒng)密封完整性驗(yàn)證提供了指導(dǎo)[2-7]。我國藥品監(jiān)管部門在藥品生產(chǎn)質(zhì)量管理規(guī)范（2010 年修訂）（衛(wèi)生部令第79 號(hào)）中提及了包裝系統(tǒng)密封完整性要求，并于2020 年正式發(fā)布了《化學(xué)藥品注射劑包裝系統(tǒng)密封性研究技術(shù)指南（試行）》，將藥品包裝系統(tǒng)密封完整性的要求提到了一個(gè)新的高度[8-9]。

包裝系統(tǒng)密封完整性測(cè)試方法多種多樣，包括色水法、微生物挑戰(zhàn)法、質(zhì)量提取法、示蹤氣體法、真空衰減法、高壓放電法、激光法、壓力衰減法等[10-20]。以上方法各有優(yōu)劣，如色水法對(duì)硬件的要求較低，但通常靈敏度較低；微生物挑戰(zhàn)法需要操作人員具備微生物相關(guān)的專業(yè)知識(shí)；其他方法諸如質(zhì)量提取法、高壓放電法等需要配備專用且昂貴的設(shè)備。此次試驗(yàn)根據(jù)《化學(xué)藥品注射劑包裝系統(tǒng)密封性研究技術(shù)指南（試行）》的研究原則和思路，開發(fā)了熒光劑–示蹤液體法，以檢查包裝系統(tǒng)的密封完整性。以羅丹明B為示蹤劑，采用高效液相色譜–熒光檢測(cè)器法進(jìn)行檢測(cè)，評(píng)價(jià)利巴韋林滴眼液貨架期密封性，模擬臨床開啟后的密封性。該方法無須專用的密封性測(cè)試設(shè)備，簡單可靠，通用性強(qiáng)，能為滴眼劑產(chǎn)品的包裝系統(tǒng)密封完整性檢測(cè)提供有力的技術(shù)支持，目前國內(nèi)尚無相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道。

1 實(shí)驗(yàn)

1.1 材料與儀器

主要材料：羅丹明B（分析純，批號(hào)C10788105，純度100%），麥克林公司；甲醇（HPLC 級(jí)，批號(hào)201209），F(xiàn)isher Chemical 公司；利巴韋林滴眼液（樣品A、B、C 均為近效期產(chǎn)品），分別購自相關(guān)企業(yè)；實(shí)驗(yàn)用水為自制超純水。

主要儀器：1100 型高效液相色譜儀（配熒光檢測(cè)器），美國安捷倫公司；XS205DU 電子天平，德國梅特勒公司；Milli–Q Advantage A10 超純水機(jī)，美國密理博公司。

1.2 方法

1.2.1 HPLC 色譜條件

以Waters Symmetry C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）為色譜柱，流動(dòng)相為甲醇–水溶液（V甲醇∶V水=65 ∶35 ），流速為1.0 mL/min，柱溫為30 ℃，進(jìn)樣量為10 μL，激發(fā)波長為550 nm，發(fā)射波長為574 nm，PMT 增益為11。

1.2.2 對(duì)照品溶液的制備

取羅丹明B 約11 mg，精密稱定，置于10 mL 容量瓶中，加超純水稀釋至刻度，搖勻，作為對(duì)照品貯備液（S0）。精密量取適量S0，用超純水逐級(jí)稀釋成系列濃度的對(duì)照品溶液（S1—S9）：0.055、0.110、0.221、0.552、1.103、2.206、5.515、11.03、22.06 μg/mL。

1.2.3 供試品溶液的制備

1）陽性樣品。取低密度聚乙烯滴眼液空瓶（樣品C 包裝），加入超純水5 mL，在瓶塞及瓶蓋處用快速透明萬能膠（PP 膠）密封。在液面下方用外徑0.45 mm的注射針垂直于表面扎孔，取內(nèi)徑為5 μm 的標(biāo)準(zhǔn)毛細(xì)管（已用掃描電子顯微鏡確認(rèn)內(nèi)徑）穿過上述扎孔，用PP 膠密封毛細(xì)管與孔的空隙，待PP 膠凝滯不流動(dòng)后，向外拔出部分毛細(xì)管，使滴眼劑瓶內(nèi)露出的毛細(xì)管盡可能短，并確保毛細(xì)管不被堵塞，以此為標(biāo)準(zhǔn)陽性樣。同法制備5、10、20 μm 3 種標(biāo)準(zhǔn)陽性樣，各6 支。

2）陰性樣品。取低密度聚乙烯滴眼液空瓶（樣品C 包裝），按照陽性樣品的方法制備樣品，堵塞毛細(xì)管，以此為陰性樣品。

1.2.4 測(cè)試

將陽性樣品和陰性樣品置于裝有羅丹明B 溶液的燒杯中（質(zhì)量濃度約為1 mg/mL，已用0.45 μm 濾膜過濾），將液體浸沒樣品漏孔，置于正壓箱中，加壓至0.1 MPa，保持30 min，然后緩慢釋壓。取出樣品，用超純水洗滌樣品表面，用濾紙吸干樣品表面水分，振搖，使瓶內(nèi)液體混勻。取瓶內(nèi)液體，按1.2.1節(jié)色譜條件進(jìn)樣分析，記錄色譜圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 加壓測(cè)試方式的選擇

為了使染料快速進(jìn)入樣品瓶內(nèi)，通常采用抽負(fù)壓或加正壓的方式。在抽負(fù)壓時(shí)，測(cè)試腔內(nèi)壓力降低，氣體從瓶內(nèi)轉(zhuǎn)移至測(cè)試腔中，再將測(cè)試腔恢復(fù)常壓，使樣品瓶內(nèi)的相對(duì)測(cè)試腔形成一定的真空度，從而促使測(cè)試腔中液體（如染料）進(jìn)入樣品瓶內(nèi)。該方法通常耗時(shí)較長，尤其是當(dāng)漏孔尺寸較小時(shí)，藥品成分（如粉針劑、混懸制劑等）可能會(huì)在測(cè)試中堵塞漏孔，造成假陰性結(jié)果。文中采用加正壓方式，將羅丹明溶液直接壓入瓶內(nèi)，有效避免了該風(fēng)險(xiǎn)。經(jīng)驗(yàn)證，在加壓時(shí)間為30 min 時(shí)能保證測(cè)試的有效性。

2.2 檢測(cè)能力的驗(yàn)證

取空白溶劑（超純水）、對(duì)照品溶液、陰性樣品、不同孔徑陽性樣品分別進(jìn)行測(cè)試。結(jié)果表明，空白溶劑、陰性樣品在目標(biāo)組的分出峰位置均無響應(yīng)。在該條件下，5、10、20 μm 3 種陽性樣品均能檢測(cè)，檢測(cè)限級(jí)別達(dá)到《化學(xué)藥品注射劑包裝系統(tǒng)密封性研究技術(shù)指南（試行）》中的3 級(jí)（見表1）。統(tǒng)計(jì)空白溶劑、陽性樣品、陰性樣品的峰面積，結(jié)果見表2，色譜圖見圖1。5 μm 陽性樣品的照片見圖2，可觀察到明顯的紅色。

圖1 樣品色譜圖Fig.1 Chromatogram of samples

圖2 5 μm 孔徑陽性樣品照片F(xiàn)ig.2 Photograph of positive samples with 5 μm aperture

表1 氣體泄漏率與泄漏孔徑尺寸的關(guān)系Tab.1 Relationship between gas leakage rate and leakage aperture size

表2 樣品測(cè)試峰面積Tab.2 Peak area of tested samples

2.3 線性范圍和檢測(cè)限

進(jìn)樣分析系列對(duì)照品溶液S1—S9，以主成分峰面積（Y）對(duì)濃度（X）進(jìn)行線性回歸，計(jì)算回歸方程及相關(guān)系數(shù)。結(jié)果表明，羅丹明B 在測(cè)試濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，線性方程：Y=118.610 1X?2.432 0，相關(guān)系數(shù)為0.999 9。

將對(duì)照品溶液依次稀釋，按照信噪比3 ∶1 計(jì)算檢測(cè)限，按照信噪比10 ∶1 計(jì)算定量限，檢測(cè)限為9.675 μg/L，定量限為32.249 μg/L。羅丹明B 的檢測(cè)限濃度對(duì)應(yīng)的峰面積為1.10，即峰面積大于該值視為檢出，5、10、20 μm 3 種陽性樣品均能被有效檢出。

2.4 精密度

取對(duì)照品溶液S4，按照前述方法連續(xù)進(jìn)樣6 針，記錄色譜圖，計(jì)算待測(cè)組分的精密度。峰面積相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為1.22%，該方法的精密度良好。

2.5 穩(wěn)定性

取對(duì)照品溶液S4，按前述分析方法分別在0、81、99、207 h 時(shí)進(jìn)樣分析，考察溶液的穩(wěn)定性，羅丹明B對(duì)照品溶液在207 h 內(nèi)穩(wěn)定，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為1.38%。

2.6 樣品測(cè)試結(jié)果及分析

2.6.1 利巴韋林滴眼液陽性樣品

由2.2 節(jié)的結(jié)果可知，以水為基質(zhì)，測(cè)得5 μm陽性樣的平均峰面積為5.40，測(cè)試樣品時(shí)的實(shí)際基質(zhì)為藥液。采用3 種利巴韋林藥液和水為溶劑，分別配制羅丹明B（質(zhì)量濃度為500 ng/mL）樣品。結(jié)果表明，此試驗(yàn)中羅丹明B 的響應(yīng)在不同基質(zhì)中無顯著性差異，故以利巴韋林滴眼液（樣品C）為溶劑，配制與以水為基質(zhì)的5 μm 陽性樣響應(yīng)相當(dāng)?shù)娜芤海鳛槔晚f林滴眼液陽性樣。6 份樣品的峰面積均值為4.33，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為3.32%，此時(shí)羅丹明B 溶液的質(zhì)量濃度為62.52 ng/mL。以利巴韋林滴眼液為溶劑時(shí)，對(duì)應(yīng)的5 μm 陽性樣的峰面積為4.33。通過測(cè)定供試品，如果對(duì)應(yīng)峰面積小于該值，則視為樣品無泄漏，包裝系統(tǒng)密封性完整。

2.6.2 測(cè)定供試品

取3 批次樣品各10 支，按1.2.4 節(jié)方法操作，考察貨架期樣品的密封完整性。另取3 批次樣品各10支，模擬臨床使用情況。反復(fù)開封5 次，每次擠出5滴后旋緊瓶蓋，置于裝有羅丹明B 的燒杯中（質(zhì)量濃度約為1 mg/mL，已用0.45 μm 濾膜過濾）。采用相同方法制作樣品，將其作為反復(fù)開封樣品，考察多劑量滴眼液在實(shí)際使用過程中的密封完整性。

取貨架期樣品和反復(fù)開封樣品，按1.2.1 節(jié)的色譜條件進(jìn)樣分析，并將所測(cè)結(jié)果與利巴韋林滴眼液5 μm陽性結(jié)果進(jìn)行比較，見表3—4。以5 μm 漏孔為限度評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行泄漏判定，結(jié)果表明，被測(cè)樣品在有效期內(nèi)的包裝系統(tǒng)密封性良好，未檢測(cè)到泄漏；反復(fù)開封后的樣品出現(xiàn)了不同程度的泄漏。

表4 反復(fù)開封樣品測(cè)試結(jié)果Tab.4 Test results of repeatedly opened samples

2.6.3 樣品瓶設(shè)計(jì)對(duì)密封性的影響

各滴眼劑瓶樣品具有不同的結(jié)構(gòu)設(shè)計(jì)。此次實(shí)驗(yàn)考察了瓶身?瓶嘴一體式（樣品A）、瓶身?瓶嘴分體式（瓶嘴管路直通型）（樣品B）、瓶身?瓶嘴分體式（瓶嘴管路錐形）（樣品C）3 種結(jié)構(gòu)的樣品。在開啟前，由于瓶身?瓶嘴一體式樣品（樣品A）的瓶嘴和瓶身被完全密封（見圖3），因此在理論上它具有最良好的密封性，但在具體使用過程中發(fā)現(xiàn)其開口尺寸受人為因素的影響較大，且瓶嘴以下藥液流通管路內(nèi)徑迅速增大，樣品開封后在加壓過程中羅丹明B 溶液易進(jìn)入瓶內(nèi)。瓶身?瓶嘴分體式（瓶嘴管路直通型）樣品（B）瓶內(nèi)接近瓶嘴部分具有相同內(nèi)徑（見圖4），相較于一體式設(shè)計(jì)降低了外界物質(zhì)的侵入風(fēng)險(xiǎn)，但因采用分體式設(shè)計(jì)，瓶身與瓶嘴的配合性會(huì)影響其密封性。由于在瓶身?瓶嘴分體式（瓶嘴管路錐形）樣品（C）的瓶口與瓶身銜接部位設(shè)計(jì)了一段錐形管路（見圖4），孔徑較小，在加壓時(shí)羅丹明B 進(jìn)入瓶內(nèi)的阻力較大，因此未檢測(cè)到泄漏，包裝系統(tǒng)的密封性較好。此次測(cè)試的3 種不同設(shè)計(jì)結(jié)構(gòu)樣品，在未開封時(shí)均具有良好的密封完整性，但開啟使用后的密封性顯現(xiàn)出較大的差異：C＞B＞A。由此可見，藥品生產(chǎn)企業(yè)在選擇滴眼劑藥包裝材料時(shí)應(yīng)關(guān)注結(jié)構(gòu)設(shè)計(jì)對(duì)藥液開啟后密封性的影響。

圖3 樣品照片F(xiàn)ig.3 Photograph of samples

圖4 瓶嘴照片F(xiàn)ig.4 Photographs of bottle mouth

3 結(jié)語

包裝系統(tǒng)密封完整性檢測(cè)最理想的情況是能進(jìn)行全樣品檢測(cè)和樣品全生命周期檢測(cè)。根據(jù)《藥品生產(chǎn)質(zhì)量管理規(guī)范》（2010 版）和《化學(xué)藥品注射劑包裝系統(tǒng)密封性研究技術(shù)指南（試行）》的規(guī)定，熔融封口產(chǎn)品（如玻璃或塑料安瓿）應(yīng)進(jìn)行100%檢漏試驗(yàn)，其他包裝容器的密封性應(yīng)根據(jù)操作規(guī)程進(jìn)行抽樣檢查。玻璃或塑料安瓿等產(chǎn)品采用熔融封口工藝，不能精確控制其封口質(zhì)量，在實(shí)踐中通常需進(jìn)行100%檢漏試驗(yàn)。全樣品密封性檢查需要避免對(duì)樣品引入污染和產(chǎn)生破壞，因此在選用檢測(cè)方法時(shí)有較大的局限性，需要綜合考慮。對(duì)于采用多劑量滴眼劑瓶等由多組件配合密封的產(chǎn)品，可通過模具和生產(chǎn)工藝精確控制組件尺寸及組件間的配合性，以保證包裝系統(tǒng)的密封性，通過抽檢即可保證密封性測(cè)試的有效性。

目前，針對(duì)包裝系統(tǒng)密封性的檢查多局限于出廠產(chǎn)品的包裝密封性檢測(cè)，對(duì)于需要反復(fù)開啟的多劑量產(chǎn)品，其密封完整性能否得到保證，也應(yīng)在產(chǎn)品設(shè)計(jì)時(shí)考慮，并進(jìn)行驗(yàn)證。在采用文中方法進(jìn)行反復(fù)開啟密封性檢查時(shí)，應(yīng)保證樣品在重新密封時(shí)的擰瓶蓋圈數(shù)或扭矩保持一致，同時(shí)避免選用有磨損或變形的樣品，避免產(chǎn)生假陽性結(jié)果。

陽性樣品的制備是驗(yàn)證檢測(cè)方法能力的關(guān)鍵，常用的方式為激光打孔。塑料橡膠材質(zhì)包裝材料具有一定彈性和收縮性，如果采用常規(guī)的激光打孔方式，則所制孔徑大小不固定，與理論值的偏差較大。文中采用毛細(xì)管制備陽性樣品，能夠準(zhǔn)確控制孔徑尺寸，同時(shí)在實(shí)際操作中使毛細(xì)管的長度與樣品瓶身的厚度基本保持一致?？晒z查藥品包裝系統(tǒng)密封完整性的方法較多，但在具體推廣中需要平衡考量檢測(cè)靈敏度和使用成本。文中采用改進(jìn)的色水法（熒光劑?示蹤液體法），可準(zhǔn)確檢測(cè)低密度聚乙烯材質(zhì)滴眼液包裝系統(tǒng)中存在的5 μm 孔徑泄漏，檢測(cè)限級(jí)別達(dá)到相關(guān)技術(shù)指南的3 級(jí)，可有效評(píng)價(jià)利巴韋林滴眼液產(chǎn)品包裝系統(tǒng)的密封完整性。該方法具有通用性強(qiáng)、靈敏度高等優(yōu)點(diǎn)，對(duì)設(shè)備和人員的要求較低，為滴眼劑產(chǎn)品密封完整性檢查和評(píng)估提供了新的檢測(cè)方法參考。