乙基纖維素/藍(lán)莓花青素浸泡型標(biāo)簽對(duì)牛奶新鮮度的指示

方仕陽(yáng)，鐘秋夏，張一弛，劉婕，陳漢城，范小平

（1.華南農(nóng)業(yè)大學(xué) 食品學(xué)院，廣州 510642; 2.廣東安德力新材料有限公司，廣東 汕頭 515800）

如今，人們對(duì)飲食已不再簡(jiǎn)單滿足于溫飽，越來(lái)越多的人開始注重食品質(zhì)量安全，這給食品包裝帶來(lái)了新的挑戰(zhàn)，也激發(fā)了食品包裝系統(tǒng)的發(fā)展。智能包裝領(lǐng)域的創(chuàng)新性理念在延長(zhǎng)保質(zhì)期和有效監(jiān)控食品質(zhì)量安全方面正在發(fā)揮著越來(lái)越重要的作用，這引起了人們的極大興趣和關(guān)注。智能包裝材料通過(guò)直接或間接識(shí)別食品或食品周圍環(huán)境某些特征指標(biāo)的變化，以特定的方式將結(jié)果傳遞給消費(fèi)者[1]。因?yàn)槎鄶?shù)食品的變質(zhì)通常伴隨著pH 值的變化，所以可以通過(guò)pH 指標(biāo)來(lái)監(jiān)測(cè)食品新鮮度，并通過(guò)包裝內(nèi)的新鮮度指示標(biāo)簽的顏色變化將結(jié)果呈現(xiàn)給消費(fèi)者，使消費(fèi)者通過(guò)肉眼感知食品品質(zhì)，實(shí)現(xiàn)可視化監(jiān)控食品質(zhì)量安全。

新鮮度指示標(biāo)簽通常由聚合物基材和pH 敏感染料組成[2]。聚合物基材是指示標(biāo)簽的重要組成部分，通過(guò)影響標(biāo)簽的完整性、通過(guò)性等對(duì)指示效果造成較大的影響，目前常用的聚合物基材有聚乙烯醇[3]、明膠[4]、羧甲基纖維素[5]等，但該類聚合物基材易溶于水，不能長(zhǎng)期浸泡在溶液中，導(dǎo)致這類聚合物基材制備的指示標(biāo)簽只能應(yīng)用于氣敏性包裝的食品中[6]，而不能在液體食品中應(yīng)用。pH 敏感染料是指示標(biāo)簽的另一重要組成部分，常用的pH 敏感染料多為人工合成指示劑，如紅色甲酚[7]、溴甲酚綠[8]、甲基紅[9]等。但這些人工合成指示劑多數(shù)有毒，若在食品中使用會(huì)對(duì)人體健康造成一定影響，不利于其在食品類pH 指示標(biāo)簽中使用。

乙基纖維素由含5 個(gè)醚鍵的分子聚合而成的高分子化合物，因其醚鍵相對(duì)含量高而表現(xiàn)出明顯的水不溶性，由于無(wú)毒、穩(wěn)定性、保水性能較好，具有優(yōu)越成膜性的同時(shí)安全無(wú)毒，在食品和藥品領(lǐng)域被廣泛應(yīng)用[10-11]，但目前鮮有乙基纖維素應(yīng)用于指示標(biāo)簽的相關(guān)報(bào)道。藍(lán)莓花青素是一種天然的、無(wú)毒的水溶性色素，在食品中不但可作為營(yíng)養(yǎng)強(qiáng)化劑，而且還可作為天然食品防腐劑代替山梨酸、苯甲酸、苯甲酸鈉等合成防腐劑，并且可作為食品著色劑應(yīng)用于平常飲料和食品，符合人們對(duì)食品添加劑天然、安全、健康的總要求[12-14]?；ㄇ嗨貙?duì)不同酸堿度有較寬范圍的響應(yīng)，是一種優(yōu)異的可應(yīng)用于食品的化學(xué)指示劑的替代品。因此，本研究以乙基纖維素為聚合物基材，花青素為pH 敏感染料，吐溫80 和甘油為增塑劑[15-17]，通過(guò)物理交聯(lián)后流延制得指示標(biāo)簽，并對(duì)其進(jìn)行比色分析，溶脹率、接觸角、遷移測(cè)試，傅里葉變換紅外光譜分析，掃描電鏡等測(cè)試表征，最后應(yīng)用于牛奶新鮮度監(jiān)測(cè)。本研究將為開發(fā)新型安全無(wú)毒且可浸泡在液體食品中的食品級(jí)新鮮度指示標(biāo)簽提供新的思路和參考，并可推動(dòng)其在食品智能包裝領(lǐng)域的應(yīng)用。

1 實(shí)驗(yàn)

1.1 材料與試劑

主要材料與試劑：藍(lán)莓花青素（5%～25%），上海麥克林生化科技有限公司；乙基纖維素（80～120 mPa·s，乙氧基含量為48.5%～49.5%），上海麥克林生化科技有限公司；矢車菊素–3–O–葡萄糖苷，上海麥克林生化科技有限公司；吐溫80，科密歐化學(xué)試劑有限公司；甘油，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；無(wú)水乙醇，上海凌峰化學(xué)試劑有限公司；巴氏殺菌乳，購(gòu)自實(shí)驗(yàn)室附近農(nóng)戶。

1.2 儀器與設(shè)備

主要儀器與設(shè)備：HJ–4A 同步攪拌器，常州崢嶸儀器有限公司；GD0306 超聲波器，深圳市冠博科技實(shí)業(yè)有限公司；SDC–100 接觸角測(cè)量?jī)x，東莞市晟鼎精密儀器有限公司；Vertex70 傅里葉變換紅外光譜儀，布魯克公司；UV–4802S 型紫外可見分光光度計(jì)，尤尼柯（上海）儀器有限公司；FD–5 型分光密度儀，日本柯尼卡美能達(dá)（中國(guó)）投資有限公司；CHY–C1測(cè)厚儀，濟(jì)南蘭光機(jī)電技術(shù)發(fā)展中心；Verios460 場(chǎng)發(fā)射掃描電子顯微鏡，F(xiàn)EI 公司；EVOMA15 掃描式電子顯微鏡，ZEISS 公司。

1.3 方法

1.3.1 指示標(biāo)簽的制備及思路

如圖1 所示，將2 g 乙基纖維素、0.5 g 吐溫80和0.5 g 甘油添加到20 g 無(wú)水乙醇中，常溫下在磁力攪拌器攪拌 4 h 后，分別取乙基纖維素質(zhì)量分?jǐn)?shù)5%、7.5%、10%、12.5%、15%的藍(lán)莓花青素溶解于5 g 去離子水，超聲后添加到乙基纖維素溶液中；然后在40 ℃條件下攪拌2 h 使藍(lán)莓花青素和乙基纖維素發(fā)生物理交聯(lián)，以獲得藍(lán)莓花青素/乙基纖維素聚合物溶液。將聚合物溶液超聲消泡后倒入11 cm 的培養(yǎng)皿，在黑暗環(huán)境的室溫下干燥48 h，待成膜后剪成1.5 cm×1.5 cm 的指示標(biāo)簽，放在深色干燥袋里，需要用時(shí)取出即可。純乙基纖維素膜制備過(guò)程不加花青素，其他過(guò)程同上。

圖1 指示標(biāo)簽的制備過(guò)程及思路Fig.1 Preparation process and ideas of indication label

1.3.2 指示標(biāo)簽的表征

1.3.2.1 指示標(biāo)簽的比色分析

采用掃描儀對(duì)不同pH 值指示標(biāo)簽進(jìn)行光學(xué)圖片掃描，選用彩色照片掃描模式，分辨率為600 dpi，光源為儀器自帶標(biāo)準(zhǔn)光源。

參考Weston 等[18]的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，牛奶質(zhì)量變化過(guò)程的pH 值從6.8 減低至4，適當(dāng)擴(kuò)大pH 值范圍，利用分光密度儀記錄指示標(biāo)簽在pH 值為3～7 時(shí)緩沖溶液下的顏色變化。用分光密度儀測(cè)得指示標(biāo)簽的L*、a*、b*值，按式（1）計(jì)算總色差ΔE。

式中：ΔL*=L*?L0*，Δa*=a*?a0*，Δb*=b*?b0*；L*、a*、b*為不同pH 下指示標(biāo)簽的值；L0*、a0*、b0*為指示標(biāo)簽的初始值。

1.3.2.2 指示標(biāo)簽的厚度與質(zhì)量

使用測(cè)厚儀對(duì)標(biāo)簽進(jìn)行隨機(jī)采樣，取20 張指示標(biāo)簽采樣，厚度的平均值作為標(biāo)簽的厚度，單位為μm；質(zhì)量的平均值為標(biāo)簽的質(zhì)量，單位為g。

1.3.2.3 指示標(biāo)簽的溶脹率、含水率和水溶性

取3 片制得的純乙基纖維素膜和指示標(biāo)簽進(jìn)行稱量，記質(zhì)量為m0，然后分別浸泡在去離子水中，每隔24 h 取出并用濾紙快速擦干表面的去離子水后再次稱量，記質(zhì)量為mt，溶脹率SD[19]按公式（2）計(jì)算。

式中：mt為第t天溶脹時(shí)標(biāo)簽的質(zhì)量，g；m0為干質(zhì)量時(shí)標(biāo)簽的質(zhì)量，g。

參照封晴霞等[20]的方法測(cè)試標(biāo)簽的含水率，將質(zhì)量為m1的標(biāo)簽放入溫度為105 ℃的烘箱中烘干至標(biāo)簽質(zhì)量恒定，取出后標(biāo)簽的質(zhì)量為m2，每次標(biāo)簽測(cè)試3 個(gè)平行試樣，取平均值作為標(biāo)簽的含水率，含水率（MC）按式（3）計(jì)算。

式中：m1為標(biāo)簽的初始質(zhì)量，g；m2為標(biāo)簽烘干后的質(zhì)量，g。

取3 片制得的指示標(biāo)簽，干燥至質(zhì)量不變，記質(zhì)量為m3，于常溫條件下浸泡在三級(jí)水中24 h，取出后干燥至質(zhì)量不變，質(zhì)量為m4，水溶性（WS）按式（4）計(jì)算。

式中：m3為標(biāo)簽首次質(zhì)量不變時(shí)的值，g；m4為標(biāo)簽浸泡后再次質(zhì)量不變時(shí)的值，g。

1.3.2.4 遷移測(cè)試

將指示標(biāo)簽進(jìn)行花青素遷移測(cè)試，驗(yàn)證花青素遷移量是否超標(biāo)并對(duì)牛奶造成不良影響。參照李夏[21]的方法繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線：準(zhǔn)確稱量100 mg 矢車菊素–3–O–葡萄糖苷標(biāo)準(zhǔn)品，用體積分?jǐn)?shù)為50%的乙醇溶液（含0.8%的鹽酸）準(zhǔn)確定容至100 mL，得到1 mg/mL 的標(biāo)準(zhǔn)使用液。用移液槍分別吸取0、0.04、0.08、0.12、0.16、0.20 mL，分別加入1、0.96、0.92、0.88、0.84、0.80 mL 的體積分?jǐn)?shù)為50%的乙醇溶液（含0.8%的鹽酸），在500 nm 的波長(zhǎng)測(cè)各濃度標(biāo)準(zhǔn)品的吸光度，以標(biāo)準(zhǔn)品的花青素濃度為橫坐標(biāo)，以吸光度為縱坐標(biāo)，繪制花青素標(biāo)準(zhǔn)曲線。將指示標(biāo)簽浸泡于180 mL 的體積分?jǐn)?shù)為50%的乙醇溶液（含0.8%的鹽酸）中，3 d后取溶液測(cè)其吸光度，并代入標(biāo)準(zhǔn)曲線求溶液中花青素含量。根據(jù)標(biāo)簽質(zhì)量，按比例計(jì)算出其他物質(zhì)含量，對(duì)比國(guó)標(biāo)及已有的相關(guān)研究結(jié)果，驗(yàn)證標(biāo)簽的安全性。

1.3.2.5 指示標(biāo)簽的接觸角

采用SDC–100 接觸角測(cè)量?jī)x在室溫下測(cè)定標(biāo)簽的接觸角。具體過(guò)程如下：將標(biāo)簽裁剪成15 mm×15 mm的試樣并利用雙面膠將其粘貼于玻片上；測(cè)試開始時(shí)滴加2 μL 的水滴至標(biāo)簽上，拍攝1 s 左右時(shí)的接觸角圖片，并利用儀器自帶軟件處理角度數(shù)據(jù)，進(jìn)行3 組平行測(cè)試取平均值。

1.3.2.6 傅里葉變換紅外光譜分析

為了研究指示標(biāo)簽中乙基纖維素和花青素的相互作用，使用傅里葉變換紅外光譜儀測(cè)定純乙基纖維素膜和指示標(biāo)簽的紅外光譜。掃描范圍為4 000～500 cm?1，掃描次數(shù)為32 次，分辨率為4 cm?1。

1.3.2.7 掃描電鏡測(cè)試

使用掃描電子顯微鏡采集標(biāo)簽表面和截面的微觀結(jié)構(gòu)。掃描前將標(biāo)簽裁剪為4 mm×4 mm 的正方形試樣，真空濺射噴金，加速電壓設(shè)置為5 kV，電流為50 pA，觀察形貌。

1.3.3 牛奶新鮮度的監(jiān)測(cè)

1.3.3.1 牛奶中菌落總數(shù)和pH 值的測(cè)定

按照GB 4789.2—2016《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品微生物學(xué)檢驗(yàn)菌落總數(shù)測(cè)定》[22]對(duì)牛奶貯存期間的菌落總數(shù)進(jìn)行測(cè)定。以GB 19645—2010《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 巴氏殺菌乳》[23]的細(xì)菌總數(shù)標(biāo)準(zhǔn)對(duì)牛奶的品質(zhì)進(jìn)行評(píng)價(jià)。

取少量牛奶置于無(wú)菌無(wú)霉的器皿中，利用均質(zhì)儀均質(zhì)后再用pH 計(jì)測(cè)得牛奶的pH 值。

1.3.3.2 指示標(biāo)簽的應(yīng)用比色分析

在10 個(gè)杯子中分別裝入180 mL 牛奶，在保鮮膜內(nèi)部貼上大小為1.5 cm×1.5 cm 的正方形指示標(biāo)簽。用貼有指示標(biāo)簽的保鮮膜對(duì)杯子進(jìn)行密封，后置于常溫條件中貯藏。在隔著保鮮膜的條件下，每隔24 h利用分光密度儀測(cè)定標(biāo)簽的L*、a*、b*值，按照公式計(jì)算ΔE值并分析。

1.3.4 數(shù)據(jù)處理

本研究實(shí)驗(yàn)內(nèi)容的性能、指標(biāo)測(cè)定均做3 組平行實(shí)驗(yàn)，結(jié)果為平均值（Mean）±標(biāo)準(zhǔn)差(SD)，使用Office Excel 處理數(shù)據(jù)、SPSS Statistics 26 進(jìn)行顯著性分析、Origin 2021 軟件進(jìn)行作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同濃度花青素指示標(biāo)簽對(duì)不同pH 緩沖液的顏色響應(yīng)

不同花青素含量的指示標(biāo)簽在不同的pH 值下顯示出的顏色見圖2，顏色變化既與花青素的含量有關(guān)，還與花青素的結(jié)構(gòu)有關(guān)。當(dāng)標(biāo)簽暴露于pH=3的環(huán)境時(shí)，由于黃烊鹽陽(yáng)離子大量存在使標(biāo)簽顏色顯現(xiàn)為粉紅色；在pH=4 的環(huán)境時(shí)，此時(shí)黃烊鹽陽(yáng)離子開始少量分解成無(wú)色的甲醇假堿，使標(biāo)簽顏色變淡成為淡粉色；在pH=5～6 時(shí)，由于無(wú)色的甲醇假堿少量轉(zhuǎn)化為紫色的喹啉無(wú)水堿基，標(biāo)簽顏色變?yōu)樽戏凵?；在pH=6～7 時(shí)，甲醇假堿快速且大量向紫色喹啉無(wú)水堿基轉(zhuǎn)移，標(biāo)簽顏色變?yōu)樽仙玔24-26]。標(biāo)簽的顏色隨pH 值的變化與Prietto 等[27]制備的黑豆花青素薄膜的顏色變化結(jié)果基本一致，證明成功制備了指示標(biāo)簽。

圖2 不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)花青素的指示標(biāo)簽在不同pH 緩沖溶液中的顯色照片F(xiàn)ig.2 Color rendering photograph of indication labels of different anthocyanin content in different pH buffer solutions

用分光密度儀記錄指示標(biāo)簽在pH 值為3～7 的透明緩沖溶液下的顏色參數(shù)（L*、a*、b*）。計(jì)算總色差ΔE，并比較總色差ΔE與pH 值的關(guān)系。根據(jù)圖3 可知，在pH 值為3～7 時(shí)，質(zhì)量分?jǐn)?shù)為5%的花青素和10%的花青素的總色差ΔE值的差值較大，都超過(guò)了12。根據(jù)Tassanawatm 等[28]研究可知，ΔE大于5 意味著人眼可以察覺到的顏色變化，ΔE大于12 表示顏色具有絕對(duì)差異。說(shuō)明質(zhì)量分?jǐn)?shù)為5%的花青素和10%的花青素的標(biāo)簽顏色變化效果明顯。這可能是質(zhì)量分?jǐn)?shù)為5%的花青素添加量的標(biāo)簽顏色偏淡，即使顏色變化也淡，但對(duì)比初始色偏淡的標(biāo)簽色差也是較大的，而質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10%的花青素的標(biāo)簽顏色適中且花青素含量足夠使其色差變化足夠大。基于牛奶的變質(zhì)過(guò)程，牛奶的pH 值變化范圍也是集中在4～7[18]。當(dāng)在pH=5 的總色差?E附近時(shí)，質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10%的花青素的標(biāo)簽顏色變化相對(duì)明顯。綜合說(shuō)明質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10%的花青素的標(biāo)簽的應(yīng)用效果最好，因此之后研究的指示標(biāo)簽都以質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10%的花青素制備的指示標(biāo)簽為樣本。

圖3 指示標(biāo)簽對(duì)不同pH 緩沖液的顏色響應(yīng)總色差ΔE 與pH 值關(guān)系Fig.3 Relationship between pH and total color difference ΔE of color response of indication labels to different pH buffers

2.2 溶脹率和含水率

溶脹可能會(huì)影響標(biāo)簽的完整性，從而影響顏色響應(yīng)性能。因此溶脹率也是衡量指示標(biāo)簽的重要指標(biāo)，它還可以體現(xiàn)指示標(biāo)簽的物理完整性和耐水性。由圖4 看出，從第1 天到第2 天的溶脹率的平均值急劇上升。這是由于水分子通過(guò)孔隙不斷向核心滲透達(dá)到一個(gè)峰值，然后在第3 天有一個(gè)小幅下降，接下來(lái)6 d的溶脹率都圍繞第3 天的溶脹率上下小幅震蕩，趨于相對(duì)平穩(wěn)狀態(tài)。結(jié)合水溶性結(jié)果可知，純乙基纖維素膜水溶性僅為0.7%，指示標(biāo)簽的水溶性為0.9%，這可能是極少數(shù)乙基纖維素從膜中脫落導(dǎo)致。證明該膜材料具有較高的吸水性，且該膜耐水性較好，不易溶于水，可以浸泡在牛奶中做指示標(biāo)簽。

圖4 純乙基纖維素膜和指示標(biāo)簽溶脹率Fig.4 Plot of pure ethyl cellulose membrane and indication label swelling rate

由表1 可知，純乙基纖維素膜的平均含水率為2.6%，指示標(biāo)簽的平均含水率為3.8%。花青素本身含有少部分的水分子，且指示標(biāo)簽的孔隙結(jié)構(gòu)更多，使部分水分子的可接觸面積更大，更好地殘留在標(biāo)簽內(nèi)部使得平均含水率更高。

表1 純乙基纖維素膜和指示標(biāo)簽的含水率及水溶性Tab.1 Water content and water solubility of pure ethyl cellulose membrane and indicator label

2.3 遷移測(cè)試

利用紫外分光光度儀，分別測(cè)1.3.2.4 節(jié)中各濃度標(biāo)準(zhǔn)品的吸光度，對(duì)應(yīng)吸光度分別為0、0.32、0.654、1.021、1.396、1.751。以標(biāo)準(zhǔn)品的花青素濃度為橫坐標(biāo)，以吸光度為縱坐標(biāo)，繪制花青素標(biāo)準(zhǔn)曲線，見圖5，標(biāo)準(zhǔn)曲線為y=0.008 8x?0.009 7，R2=0.999 6，滿足相關(guān)檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)。取指示標(biāo)簽浸泡的體積分?jǐn)?shù)為50%的乙醇溶液（含0.8%的鹽酸）多次測(cè)其吸光度，得到吸光度均值為0.000 3。將均值代入標(biāo)準(zhǔn)曲線公式中，得出溶液中遷移的花青素質(zhì)量濃度為1.136 μg/mL，即一盒180 mL 規(guī)格的巴氏殺菌乳中含花青增加量為0.204 mg?；ㄇ嗨貫榉宇愇镔|(zhì)，Pandey 等[29]通過(guò)對(duì)乳制品添加花青素，不僅提高了乳制品的營(yíng)養(yǎng)特性，還增加了抗氧化性而延長(zhǎng)了貯存時(shí)間，Vázquez 等[30]通過(guò)研究得出牛乳自身酚類物質(zhì)含量為（49.00±10.77）mg/L，因此1.1 mg 的酚類物質(zhì)添加量不會(huì)對(duì)牛乳造成影響。

圖5 花青素標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.5 Standard curve of anthocyanin

通過(guò)分析天平稱量指示標(biāo)簽的質(zhì)量，可知每張指示標(biāo)簽平均質(zhì)量為38 mg，根據(jù)比例得乙基纖維素約為25 mg、吐溫80 約為6.3 mg、甘油約為6.3 mg。乙基纖維素為水不溶性纖維，不會(huì)與牛奶反應(yīng)造成安全問題。根據(jù)GB 2760—2014《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品添加劑使用標(biāo)準(zhǔn)》可知，吐溫80 的添加量不能超過(guò)1.5 g/kg，食品級(jí)甘油的添加量不能超過(guò)5 g/kg。因此，如若標(biāo)簽中的吐溫80 與甘油全部遷移至產(chǎn)品中，也不會(huì)超過(guò)國(guó)標(biāo)限量而引起安全問題，該標(biāo)簽誤食也不會(huì)存在安全問題。

2.4 接觸角

接觸角是衡量液體對(duì)材料表面潤(rùn)濕性能的重要參數(shù)。如表2 所示，未加花青素的純乙基纖維素膜的平均接觸角為102.15°，這與乙基纖維素是疏水材料相符，證明純乙基纖維素膜是疏水膜。指示標(biāo)簽的接觸角為88.61°，這與胡婉婷等[31]發(fā)現(xiàn)的當(dāng)乙基纖維素的質(zhì)量分?jǐn)?shù)超過(guò)25%時(shí)，大量的乙基纖維素顆粒使復(fù)合膜結(jié)構(gòu)的致密性下降，水分子更容易滲透進(jìn)復(fù)合膜內(nèi)部的結(jié)果是一致的。又因?yàn)橹甘緲?biāo)簽含水溶性花青素，所以水在滲進(jìn)孔隙的同時(shí)會(huì)與花青素結(jié)合，導(dǎo)致了該指示標(biāo)簽接觸角比未加花青素的乙基纖維素的標(biāo)簽還小，展現(xiàn)出親水性。這也是指示標(biāo)簽可以顯色的前提，且該標(biāo)簽實(shí)際上還是表現(xiàn)出耐水性，結(jié)合2.2 節(jié)溶脹率和水溶性實(shí)驗(yàn)的結(jié)果也可以證明該觀點(diǎn)。

表2 純乙基纖維素膜和指示標(biāo)簽接觸角Tab.2 Pure ethyl cellulose membrane and indication label contact angle

2.5 傅里葉變換紅外光譜

由圖6 可以看出，在673 cm?1處的特征峰屬于乙基纖維素中的C?H 振動(dòng)特征峰，加入藍(lán)莓花青素后，吸收峰強(qiáng)度明顯增強(qiáng)，這可能是部分花青素芳香環(huán)結(jié)構(gòu)發(fā)生了鄰位取代引起的。在1 051 cm?1處的特征峰是乙基纖維素的C?O 特征峰。在1 643 cm?1處的吸收峰是由于膜中含少量乙醇的部分羥基，而指示標(biāo)簽中少量花青素與水分子密切結(jié)合產(chǎn)生了一個(gè)小的加強(qiáng)峰，可以初步推斷花青素包埋進(jìn)了乙基纖維素里。在3 350 cm?1和3 365.62 cm?1附近都有明顯強(qiáng)而寬的O?H 伸縮振動(dòng)峰，而花青素的加入使特征峰發(fā)生偏移，同時(shí)可以看到花青素的加入使這個(gè)峰得到加強(qiáng)，表明花青素被良好地包埋進(jìn)乙基纖維素里。

圖6 傅里葉變換紅外光譜圖Fig.6 Fourier transform infrared spectrogram

已知乙基纖維素的非離子醚鍵具有良好的穩(wěn)定性，不與酸、堿、氧化劑和還原劑相互作用[32]。因此，乙基纖維素中的醚鍵不參與體系中分子間氫鍵的形成。然而，乙基纖維素的OH 可作為H 鍵受體，而花青素中的Ar?OH 具有良好的反應(yīng)性，可作為氫鍵供體。乙基纖維素和花青素成功發(fā)生物理交聯(lián)，兩者形成Ar?OH…HO?R 的氫鍵，破壞了乙基纖維素的有序排列，導(dǎo)致物理性質(zhì)的改變。這與Su 等[33]研究的辣椒素和乙基纖維素的相互作用一致，由此得出交聯(lián)的化學(xué)結(jié)構(gòu)如圖7 所示。

圖7 乙基纖維素和花青素間氫鍵相互作用Fig.7 Interaction of hydrogen bonding between ethyl cellulose and anthocyanins

2.6 掃描電鏡分析

通過(guò)圖8 掃描電鏡圖分析純乙基纖維素膜和指示標(biāo)簽的表面和截面結(jié)構(gòu)。在5 000 倍下可以清楚看到純乙基纖維素膜存在很多孔隙結(jié)構(gòu)，與高紅芳[34]制備的乙基纖維素復(fù)合膜形貌結(jié)果一致。同時(shí)還可以清楚地看到條狀結(jié)構(gòu)的纖維素，而指示標(biāo)簽的結(jié)構(gòu)上有很多顆粒，這些顆粒為花青素，該結(jié)構(gòu)也證明了2.5 節(jié)中傅里葉變換紅外光譜的分析，即花青素和乙基纖維素由于氫鍵作用復(fù)合在一起。隨著花青素的加入，指示標(biāo)簽的厚度明顯增加，純乙基纖維素膜的平均厚度為 288.17 μm，而指示標(biāo)簽的平均厚度為530.95 μm?；ㄇ嗨嘏c乙基纖維素發(fā)生了氫鍵作用，破壞了乙基纖維素的有序排列，增加了標(biāo)簽的網(wǎng)絡(luò)交錯(cuò)結(jié)構(gòu)和孔隙率，導(dǎo)致厚度增加。Chu 等[35]通過(guò)加入精油減少花青素對(duì)原有結(jié)構(gòu)的破壞，也證明了花青素的加入會(huì)對(duì)乙基纖維素的有序排列造成影響。

圖8 純乙基纖維素膜和指示標(biāo)簽SEM 圖Fig.8 SEM images of pure ethyl cellulose membrane and indication label

2.7 牛奶新鮮度監(jiān)測(cè)

菌落總數(shù)是判斷牛奶品質(zhì)的重要指標(biāo)，根據(jù)GB 19645—2010《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 巴氏殺菌乳》的規(guī)定，1 mL 牛奶的菌落總數(shù)限量為105CFU/mL，1 mL牛奶的大腸菌群限量為5 CFU/mL，若超過(guò)國(guó)標(biāo)限度則牛奶變質(zhì)，不可正常食用。在牛奶貯藏期間，微生物的生長(zhǎng)會(huì)導(dǎo)致乳酸的積累和pH 值變化，對(duì)標(biāo)簽顏色造成影響。

由圖9 可知，第1 天菌落總數(shù)為0，pH 值為（6.73±0.02），此時(shí)牛奶處于新鮮可食用狀態(tài)。第2天，菌落總數(shù)為1 000 CFU/mL，pH 值小幅下降為（6.67±0.02），牛奶依舊新鮮可食。第3 天，菌落總數(shù)上升至5.95×104CFU/mL，此時(shí)pH 值也較快跌至（5.28±0.03），此時(shí)細(xì)菌總數(shù)相比于第2 天的細(xì)菌總數(shù)增長(zhǎng)明顯。這可能是因?yàn)榈? 天已有細(xì)菌滋生，使牛奶中蛋白質(zhì)部分變質(zhì)，有利于細(xì)菌吸收生長(zhǎng)繁殖，分解利用了牛奶中的蛋白質(zhì)和乳糖等物質(zhì)，牛奶開始變酸，此時(shí)牛奶需要盡快食用。保存至第4 天時(shí)的細(xì)菌總數(shù)為1.302×105CFU/mL，pH 值為（4.21±0.01），完全超過(guò)國(guó)標(biāo)105CFU/mL 的限定值。說(shuō)明此時(shí)牛奶處于變質(zhì)狀態(tài)，已經(jīng)不能食用，且之后菌落總數(shù)已經(jīng)嚴(yán)重超標(biāo)，甚至無(wú)法進(jìn)行菌落計(jì)數(shù)了。

圖9 牛奶中菌落總數(shù)和pH 值變化Fig.9 Changes in total colonies and pH in milk

2.8 指示標(biāo)簽的應(yīng)用比色分析

隨著貯藏時(shí)間的延長(zhǎng)，牛奶中指示標(biāo)簽的顏色隨之發(fā)生相應(yīng)變化。貯藏期內(nèi)指示標(biāo)簽的顏色和總色差變化見圖10。結(jié)合2.7 節(jié)的菌落總數(shù)結(jié)果，第1、2天為新鮮牛奶，此時(shí)由于牛奶的滲入使指示標(biāo)簽的顏色為淺紫色，總色差變化也沒超過(guò)5，顏色變化肉眼不可見。第3 天的菌落總數(shù)接近國(guó)標(biāo)限值，牛奶還未變質(zhì)，指示標(biāo)簽顏色為粉紫色，總色差與第1 天指示標(biāo)簽的總色差差值達(dá)到11.09，屬于人眼可觀察到的顏色變化。第4 天的菌落總數(shù)已超過(guò)國(guó)標(biāo)限值，指示標(biāo)簽的顏色為粉色，總色差差值達(dá)到16.15，此時(shí)標(biāo)簽顏色存在絕對(duì)差異。標(biāo)簽在牛奶中的應(yīng)用比在緩沖溶液中的總色差變化更加明顯，這可能是新鮮牛奶的白色在一開始抑制了標(biāo)簽的紫色，使標(biāo)簽顯示的是新鮮時(shí)的淡紫色與變質(zhì)時(shí)的粉色，使顏色區(qū)別更加明顯，實(shí)際應(yīng)用效果比在緩沖溶液中更好。該標(biāo)簽實(shí)際應(yīng)用時(shí)顏色變化與Kang 等[36]制備的應(yīng)用于對(duì)揮發(fā)性氨監(jiān)測(cè)的比色膜的變化一致。

圖10 指示標(biāo)簽在牛奶中應(yīng)用的總色差變化Fig.10 Total color difference change of indication label in milk

由2.7 節(jié)的菌落總數(shù)結(jié)果可知，前4 天為牛奶變質(zhì)的過(guò)程，因此，相關(guān)性取前4 天的結(jié)果進(jìn)行分析。指示標(biāo)簽的總色差?E與pH 值、菌落總數(shù)之間的相關(guān)性結(jié)果見表3，相關(guān)性分別為0.022 和0.038，均小于0.05，說(shuō)明指標(biāo)之間存在顯著相關(guān)性。再通過(guò)對(duì)牛奶變質(zhì)過(guò)程中的指示標(biāo)簽總色差?E和菌落總數(shù)、牛奶pH 分別進(jìn)行線性回歸擬合，結(jié)果見圖11，可得決定系數(shù)（R2）分別為0.926 2 和0.957 3。表明指示標(biāo)簽總色差?E變化和牛奶變質(zhì)過(guò)程中菌落總數(shù)、牛奶pH 的變化存在相關(guān)性。證明該標(biāo)簽可用于牛奶新鮮度的監(jiān)測(cè)。

表3 指示標(biāo)簽總色差變化和pH 值、菌落總數(shù)變化的相關(guān)性和顯著性分析Tab.3 Correlation and significance analysis on change of total color difference of indication label, pH and total colonies

圖11 指示標(biāo)簽?E 與菌落總數(shù)和牛奶pH 的回歸擬合分析結(jié)果Fig.11 Regression fitting analysis results of indication label ?E versus total colonies and milk pH

3 結(jié)語(yǔ)

本研究以乙基纖維素為聚合物基材，藍(lán)莓花青素為pH 敏感染料，吐溫80 和甘油為增塑劑，制備出了一種安全無(wú)毒且耐水性好可浸泡在牛奶中的食品級(jí)新鮮度指示標(biāo)簽。通過(guò)比色分析、溶脹率、遷移測(cè)試、接觸角、傅里葉變換紅外光譜、掃描電鏡等對(duì)指示標(biāo)簽性能進(jìn)行測(cè)試表征，結(jié)果表明標(biāo)簽中的乙基纖維素與花青素發(fā)生物理交聯(lián)，產(chǎn)生氫鍵作用，標(biāo)簽孔隙增大，牛奶更易滲入標(biāo)簽并提高標(biāo)簽的顯色效果。遷移測(cè)試結(jié)果表明，該標(biāo)簽花青素遷移量少且其他成分遷移均在相關(guān)要求范圍內(nèi)，不會(huì)對(duì)牛奶安全造成影響，即使誤食標(biāo)簽也不會(huì)造成安全問題。溶脹率和接觸角結(jié)果證明，雖然該標(biāo)簽表面潤(rùn)濕性能較好，但耐水性好，仍屬于不溶性標(biāo)簽，可以浸泡在溶液中，更符合實(shí)際應(yīng)用場(chǎng)景。將該標(biāo)簽應(yīng)用于牛奶新鮮度實(shí)際監(jiān)測(cè)，常溫條件下，前2 天新鮮牛奶中標(biāo)簽的總色差變化僅為肉眼不可見的3.61，第3 天亞變質(zhì)牛奶中指示標(biāo)簽的總色差變化為肉眼可見的11.09，第4 天變質(zhì)牛奶的指示標(biāo)簽總色差變化達(dá)到了顏色絕對(duì)差異的16.15。結(jié)合牛奶中菌落總數(shù)、pH值與指示標(biāo)簽總色差存在顯著相關(guān)性，證明該指示標(biāo)簽在牛奶變質(zhì)過(guò)程中的指示是有效的，可用于實(shí)時(shí)指示牛奶的新鮮度。