家蠶小分子熱激蛋白BmHsp19.1基因克隆及在蠶卵中的表達特征

龔競， 張偉， 唐苗， 程悅靜， 龐家欣

1. 西南大學 蠶桑紡織與生物質(zhì)科學學院，重慶 400715；2. 資源昆蟲高效養(yǎng)殖與利用全國重點實驗室，重慶 400715

昆蟲種類眾多、 分布廣泛, 受益于昆蟲在進化過程中生成的多種適應環(huán)境條件的能力, 滯育便是昆蟲周期性度過不良生存環(huán)境的一種策略． 與休眠不同, 滯育是昆蟲經(jīng)年累月受到特定的刺激(例如光周期、 溫度等)[1], 將這些外部信號轉(zhuǎn)化為生物的一種特性, 并遺傳給后代． 進入滯育的昆蟲, 新陳代謝速率下降、 應激耐受力增強、 生長發(fā)育停滯[2]．

滯育可以發(fā)生在昆蟲生長的任一階段, 按照不同的發(fā)育時期, 可分為卵滯育、 幼蟲滯育、 蛹滯育和成蟲滯育[3]． 家蠶(Bombyxmori)是典型的卵滯育昆蟲, 遺傳背景清晰, 有重要的經(jīng)濟價值． 實際生產(chǎn)中, 常使用一些特殊的處理法(如即時浸酸法、 冷藏浸酸法)阻斷或解除滯育[4], 使其進入正常的發(fā)育狀態(tài)． 此外, 高濃度氧氣處理滯育卵也能有效阻斷蠶卵滯育[5-6]． 由于滯育對家蠶生長繁育的影響與蠶業(yè)生產(chǎn)相關(guān), 滯育機制還未完全解析, 因此家蠶滯育研究一直是大家關(guān)注的焦點．

熱激蛋白(heat stress proteins, Hsps)廣泛存在于原核、 真核生物中, 最早在果蠅(Drosophilamelanogaster)中發(fā)現(xiàn)[7]． 當生物遭受外界脅迫(如高溫)時, 體內(nèi)細胞通過誘導合成熱激蛋白, 作為分子伴侶促進蛋白質(zhì)的完整性和細胞穩(wěn)態(tài), 以抵御脅迫反應[8]． Hsps分子量差異較大, 可分為sHsps(small heat shock proteins), Hsp60, Hsp70以及Hsp90[9]． 熱激蛋白的存在反映了生物對環(huán)境中存在的某些極端應力的響應機制． 有研究表明, 熱激蛋白與昆蟲的滯育聯(lián)系緊密, 在滯育期間熱激蛋白基因表達產(chǎn)物通過增加、 減少或者維持不變來促進昆蟲在逆境中的生存[8]．

在前期研究中, 我們通過對家蠶滯育卵與發(fā)育卵轉(zhuǎn)錄組的研究分析[6], 發(fā)現(xiàn)了一些差異表達的熱激蛋白基因, 在這些基因中篩選出小分子熱激蛋白BmHsp19.1基因, 進行克隆、 生物信息分析以及在不同發(fā)育狀態(tài)蠶卵中的表達特征調(diào)查, 對該基因的功能進行了初步推導． 該結(jié)果為解析BmHsp19.1功能提供了有價值的信息, 為其他昆蟲sHsps的研究提供了一些參考．

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 實驗昆蟲

家蠶二化性品種大造(Dazao)由西南大學蠶桑紡織與生物質(zhì)科學學院家蠶育種實驗室提供． 對母代胚胎進行25 ℃長光照、 15 ℃黑暗催青分別獲得滯育卵、 非滯育卵, 對其中的滯育卵進行高濃度氧氣處理、 HCl處理, 采集以上4種蠶卵產(chǎn)后0～7 d材料, 用液氮速凍, 保存于-80 ℃冰箱備用．

1.1.2 試劑耗材

RNAiso Plus, 反轉(zhuǎn)錄試劑盒, T4 DNA連接酶和pMD19-T載體, Takara; DNA聚合酶(2×Taq Master Mix), Novoprotein; 膠回收試劑盒(Gel Extraction Kit), 廣州美基生物; 氨芐霉素, 上海生工; 宿主菌 BL21 (DE3)和大腸桿菌(Escherichiacoli) 感受態(tài)菌株Trans1-T1, 上海唯地生物; 引物合成和測序, 上海生工; 純氧氣瓶, 重慶強勝; HCl溶液, 重慶科試．

1.2 方法

1.2.1 高濃度氧氣處理及HCl處理

高濃度氧氣處理: 滯育卵產(chǎn)后20 h, 放置于25 ℃氧氣濃度為70%的三氣培養(yǎng)箱中處理40 h．

HCl處理: 滯育卵產(chǎn)后20 h, 室溫25 ℃條件下在比重為1.100的HCl溶液中浸泡70 min, 用流水洗凈, 晾干．

期間收集兩種處理產(chǎn)后2 d, 3 d, 5 d和7 d的蠶卵材料．

1.2.2 基因克隆鑒定和表達量檢測

利用報道過的BmHsp19.1基因序列在NCBI (http: //www. ncbi. nlm. nih. gov/)以及SilkBase (http: //silkbase.ab.a.u-tokyo.ac.jp/cgi-bin/)中進行檢索, 檢索之后用引物設(shè)計軟件Primer Premier (Version5.0)[10]設(shè)計BmHsp19.1熒光定量 PCR (qRT-PCR)引物、 克隆引物和內(nèi)參引物 sw22671[11](表1)．

表1 引物序列

在BmHsp19.1載體構(gòu)建實驗中, 以家蠶滯育卵7 d的cDNA作為模板進行PCR擴增． 循環(huán)參數(shù)為94 ℃預變性5 min; 94 ℃變性30 s, 55 ℃退火30 s, 72 ℃延伸30 s, 反應32個循環(huán); 72 ℃終延伸10 min． 產(chǎn)物經(jīng)1.5%瓊脂糖電泳后檢測其大小, 對目的DNA片段切膠回收, 再與pMD19-T載體連接, 將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化到感受態(tài)細胞中, 通過菌液PCR篩選陽性克隆并進行測序鑒定．

以產(chǎn)后0 h, 20 h, 2 d, 3 d, 5 d, 7 d家蠶滯育卵、 非滯育卵, 產(chǎn)后2 d, 3 d, 5 d, 7 d高濃度氧氣處理、 HCl處理的滯育卵的cDNA為模板開展qRT-PCR分析, qRT-PCR反應程序設(shè)定為94 ℃預變性1 min; 94 ℃反應20 s, 60 ℃反應40 s, 30個循環(huán)． 每個樣品3個生物學重復, 相對定量(2-ΔΔCT法)計算基因表達量．

1.2.3 蛋白的生物信息學分析

利用在線網(wǎng)站預測BmHsp19.1的信號肽區(qū)域(https: //services.healthtech.dtu.dk/service.php? SignalP-5.0)和磷酸化位點以及糖基化位點(https: // prosite.expasy.org/), 采用在線網(wǎng)站(http: //smart.embl-heidelberg.de/) 預測結(jié)構(gòu)域, 采用在線網(wǎng)站(http: //www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM-2.0/)預測蛋白跨膜結(jié)構(gòu)域, 利用在線網(wǎng)站expasy (https: //web.expasy.org/protscale/)對蛋白親疏水性進行預測． 以BmHsp19.1為檢索序列, 采用NCBI(https: //www.ncbi.nlm.nih.gov/)blast工具收集部分生物的sHsps序列, 在TBtools軟件中進行建樹, 建樹方法為最大似然法, 檢驗5 000次． 采用SilkDB 3.0(https: //silkdb. bioinfotoolkits. net/ main / species-info/-1)進行亞細胞定位, 利用在線網(wǎng)站PSIPRED v3.3 (http: //bioinf.cs.ucl.ac.uk/ psipred/)進行二級結(jié)構(gòu)預測, 利用在線網(wǎng)站Robetta(https: //robetta.bakerlab.org/)對蛋白質(zhì)的三維結(jié)構(gòu)進行預測, 用PyMOLWin軟件制圖并導出．

1.2.4 統(tǒng)計分析

使用GraphPad Prism 5.0軟件對數(shù)據(jù)結(jié)果進行統(tǒng)計分析, 采用two-way ANOVA方法檢驗比較不同樣品的差異顯著性(p<0.05)．

2 結(jié)果與分析

2.1 BmHsp19.1基因克隆與分析

對BmHsp19.1基因進行克隆, 以家蠶品種大造滯育卵7 d 的cDNA為模板, 用基因的克隆引物進行PCR擴增, 產(chǎn)物的大小采用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測． 結(jié)果顯示, 在500～750 bp之間有1條特異性條帶, 與預期片段大小相符(圖1a)． 對該PCR產(chǎn)物進行切膠回收, 連接轉(zhuǎn)化pMD19-T載體, 篩選出陽性克隆進行測序, 得到CDS長度為507 bp核苷酸序列, 編碼168個氨基酸, 無信號肽結(jié)構(gòu), 無跨膜結(jié)構(gòu)域, 在第56～152個氨基酸位具備Hsp20功能結(jié)構(gòu)域, 屬于小分子熱激蛋白家族(圖1b)． 比對結(jié)果表明,BmHsp19.1基因克隆序列和家蠶SilkDB數(shù)據(jù)庫預測基因序列一致．

a圖中M為DL2000 Marker, 1為PCR擴增產(chǎn)物; b圖中Hsp20功能結(jié)構(gòu)域以灰色顯示．圖1 BmHsp19.1基因

2.2 BmHsp19.1蛋白序列分析

BmHsp19.1蛋白預測的分子量為19.06 kDa, 等電點為5.59, 具有5個潛在的磷酸化修飾位點(T-29, S-56, T-79, S-117和S-143), 無糖基化位點． 利用ProtScale軟件進行蛋白親疏水性分析, 結(jié)果顯示: BmHsp19.1蛋白親水性氨基酸在整個肽鏈中的分布占比較多(圖2a), 疏水性氨基酸相對較少, 分別占總氨基酸的68.45%和31.55%． 23～41區(qū)域、 81～89區(qū)域、 128～138區(qū)域的氨基酸疏水性較強, 其中, 疏水性最強的氨基酸在第132位, 分值為1.422; 親水性較強的氨基酸集中分布在9～22區(qū)域、 34～35區(qū)域、 42～69區(qū)域、 71～77區(qū)域、 90～122區(qū)域、 139～152區(qū)域、 154～164區(qū)域, 其中親水性最強的氨基酸在第96位, 分值為-3.522． 通過PSIPRED v3.3和Robetta在線網(wǎng)站對蛋白的二級(圖2b)、 三級結(jié)構(gòu)進行預測(圖2c), 其中, 蛋白結(jié)構(gòu)中無規(guī)則卷曲所占比例最大, 為58.4%, β折疊占31.5%, α螺旋占10.1%．

圖2 BmHsp19.1蛋白

2.3 BmHsp19.1進化分析

利用Mega X軟件對20種不同物種的小分子熱激蛋白構(gòu)建系統(tǒng)進化樹, 結(jié)果顯示, 選用的物種形成脊椎動物和無脊椎動物兩個大的分支, 其中家蠶和野桑蠶的親緣關(guān)系最近, 然后再與其他鱗翅目昆蟲聚在一起(圖3)．

圖3 sHsps系統(tǒng)發(fā)育進化樹

2.4 BmHsp19.1基因在蠶卵中的表達分析

為了調(diào)查家蠶BmHsp19.1基因在滯育卵、 非滯育卵、 高濃度氧氣處理的滯育卵和HCl處理的滯育卵中的表達情況, 采用qRT-PCR方法對其蠶卵進行分析(圖4)． 結(jié)果表明:BmHsp19.1基因在滯育卵和非滯育卵產(chǎn)后0～2 d的表達量較小, 差異不大; 滯育卵的表達量在產(chǎn)后3～7 d上調(diào), 顯著高于非滯育卵． 在滯育卵、 高氧處理組和HCl處理組的比較中,BmHsp19.1基因的表達量也是在滯育卵中產(chǎn)后3 d開始上調(diào), 顯著高于其余處理組, 并持續(xù)到產(chǎn)后7 d． 說明BmHsp19.1基因主要在蠶卵進入滯育過程的后期高量表達, 暗示該基因可能在進入滯育過程中起到了很重要的作用．

***表示p< 0.001, 差異有統(tǒng)計學意義．圖4 家蠶BmHsp19.1基因在不同發(fā)育狀態(tài)蠶卵中的表達量分析

3 討論

本研究中我們聚焦可能與滯育有關(guān)的Hsps家族蛋白, 這類蛋白通常在昆蟲經(jīng)歷高溫、 寒冷、 缺氧等外界不利條件時產(chǎn)生并發(fā)揮作用, 其中Hsp60, Hsp70和Hsp90的分子量較大, 依賴于ATP發(fā)揮作用; 而sHsps家族蛋白, 其分子量介于12～43 kDa之間, 通常在30 kDa以下, 蛋白有保守的二級結(jié)構(gòu)和蛋白結(jié)構(gòu)域, 不依賴ATP發(fā)揮作用[8,12]． 本文中鑒定的BmHsp19.1基因, 其蛋白分子量為19.06 kDa, 具有典型的Hsp20功能結(jié)構(gòu)域, 屬于小分子熱激蛋白家族．

滯育是昆蟲經(jīng)歷的一個特殊的生理環(huán)境, 是生命活動由旺盛到幾乎停滯的過程[13]． 由于呼吸的減弱生物會進入到一個生理性缺氧的狀態(tài), 這與外界條件缺氧環(huán)境很相似． 已有研究發(fā)現(xiàn), 蟋蟀(Allonemobiussocius)在卵滯育時具有代謝減少64%的特征,Hsp20.7和Hsp90的mRNA表達量相對于非滯育的卵減少, 而Hsp70的mRNA表達量沒有變化[14-15]． 苜蓿切葉蜂(Megachilerotundata)滯育蛹中Hsp70的表達量明顯上調(diào), 但Hsc70和Hsp90表達量的變化很小[16]． 有意思的是, 果蠅成蟲在缺氧過程中會上調(diào)至少4個Hsps基因, 包括Hsp23,Hsp67Bc,Hsp68和Hsp40, 其中Hsp23對缺氧最敏感[17]． 受缺氧影響的肥須麻蠅(Sarcophagacrassipalpis)成蟲增加了Hsps基因的表達:Hsp70對缺氧反應最迅速, 并且表現(xiàn)出最大的表達, 其次是sHsps基因(Hsp18,Hsp23和Hsp25), 然后是Hsp40和Hsp60[18]． 從中可以看出, 無論是滯育還是缺氧環(huán)境, 熱激蛋白都做出了壓力反應, 其中小熱激蛋白表現(xiàn)為普遍上調(diào)．

家蠶在胚胎早期進入滯育, 以滯育卵的形式度過寒冷的冬季． 科研工作者通過組學的方法對家蠶中的Hsps進行了廣泛的鑒定[6, 19-20], 其中與家蠶滯育相關(guān)的Hsps有Hsp60,Hsp70,DnaJ,Hsp83,Hsp90,sHsps有Hsp12.2-like,Hsp19.1,Hsp19.9,Hsp20.1,Hsp20.4,Hsp20.8,Hsp23.7． 由于滯育過程中能量代謝被抑制, 產(chǎn)生的ATP顯著下降, 此時不依賴于ATP的sHsps在滯育過程中大量積累． 有研究表明Hsp12.2-like,Hsp19.5在滯育卵中上調(diào)表達[6,21], 本研究中的BmHsp19.1基因在家蠶滯育進入過程中也呈現(xiàn)出上調(diào)表達的趨勢． 這些sHsps與細胞中存儲的蛋白質(zhì)結(jié)合, 可以起到防止蛋白不可逆變性的保護作用, 這是細胞在滯育期間抵御壓力引起的蛋白質(zhì)損失的首要反應[22-23]． sHsps反應迅速還在于其可以通過轉(zhuǎn)錄后修飾, 如磷酸化等來調(diào)節(jié)蛋白活性, 無需從頭合成蛋白． 在這方面研究最廣泛的例子是人類Hsp27, 其N末端區(qū)域內(nèi)有3個磷酸化位點(Ser-15, Ser-78和Ser-82), 通過絲裂原活化蛋白激酶級聯(lián)調(diào)控進行修飾[12,24], 而本研究中BmHsp19.1預測的磷酸酸化位點多達5個(T-29, S-56, T-79, S-117和S-143), 暗示該蛋白可能通過蛋白修飾活化進而發(fā)揮功能． 有研究表明sHsps在正常和應激條件下, 細胞內(nèi)定位是不同的[25-26], 而該蛋白在不同條件下的亞細胞定位, 有待進一步實驗證實．

綜上所述, 本研究成功地對BmHsp19.1基因進行了鑒定和在蠶卵中的表達分析, 該結(jié)果豐富了家蠶Hsps基因家族的研究信息, 下一步將獲取較純的BmHsp19.1蛋白, 作為研究滯育卵和非滯育卵差異的候選基因, 后續(xù)可采用RNAi干擾或基因編輯的方法對其開展功能研究．