TPGS 修飾的載胰島素脂質(zhì)體眼用制劑的制備及其在兔眼的離體角膜滲透與藥代動力學(xué)

張 丹，杜之渝

重慶醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院1眼科，2超聲分子影像重慶市重點實驗室，重慶400010

角膜是屈光系統(tǒng)的重要組成部分，對于正常的視覺形成起著重要作用［1］。嚴(yán)重的角膜疾病會極大的損害視力健康甚至致盲，目前針對難治性角膜疾病治療較多選用傳統(tǒng)滴眼液對角膜進行抗炎、抗感染、促修復(fù)等處理。傳統(tǒng)滴眼液作為目前治療患者角膜疾病的首選劑型，由于眼部解剖學(xué)、生理學(xué)的限制，使得其在眼部生物利用度較低（<5%），治療效果不佳，給眼部疾病治療帶來了巨大困難［2,3］，且頻繁使用皮質(zhì)類固醇滴眼液進行抗炎時，還可能造成眼壓升高并產(chǎn)生角膜毒性［4,5］，因此尋求一種安全、有效、減少用藥頻率及副作用的眼部新型制劑具有重要意義。

胰島素（INS）是重要的代謝調(diào)節(jié)激素，研究證明胰島素還是潛在的抗氧化劑具有抗炎、抗凋亡、促進神經(jīng)修復(fù)的重要生物學(xué)作用［6-8］。相關(guān)研究已證明局部應(yīng)用胰島素于角膜可加快損傷角膜上皮的愈合、刺激培養(yǎng)的神經(jīng)元再生及神經(jīng)元的突觸分化和成熟［9,10］。但由于其穩(wěn)定性差、分子量大，不易通過眼部屏障等性質(zhì)，該藥目前在眼科應(yīng)用受限［11］。脂質(zhì)體作為一種新型納米眼部藥物載體它生物相容性好、穿透性強、角膜滲透性好，其特有屬性在運載藥物治療眼部疾病時與傳統(tǒng)眼藥制劑相比具有很大的優(yōu)勢［12-14］。TPGS安全無毒、具有兩親性結(jié)構(gòu)，由維生素E琥珀酸酯（VES）與聚乙二醇（PEG）1000 通過酯化反應(yīng)制得，它可以作為滲透促進劑、乳化劑修飾脂質(zhì)體，增加藥物在組織的滲透性、增強載藥系統(tǒng)的穩(wěn)定性［15,16］，但在修飾胰島素脂質(zhì)體眼用制劑方面的研究尚無報道。在本研究中我們選用胰島素作為目標(biāo)藥物，采用TPGS作為表面活性劑，制備出TPGS修飾的胰島素脂質(zhì)體（T-LPs/INS），考察相關(guān)的表征、角膜滲透性能，觀察在局部兔眼組織的濃度變化，進行眼部藥代動力學(xué)特征分析，評價其眼部相對生物利用度，為胰島素臨床治療角膜疾病的應(yīng)用提供初步理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材料

酶標(biāo)儀（Bio-Rad）、熒光倒置顯微鏡（Olympus）、3000SSA 型激光粒徑電位分析儀（Malvern Instruments）、紫外分光光度計（Shimadzu）、旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（上海亞榮生化儀器廠）、聲震儀（Sonics）、低溫高速離心機（Sigma）、人胰島素（Sigma）、大豆軟磷脂（純度>99%，上海麥克林生化科技有限公司）、膽固醇（上海艾偉拓醫(yī)藥科技有限公司）、TPGS（上海阿拉丁生化科技股份有限公司）、酶聯(lián)免疫吸附試驗試劑盒（泉州睿信科技有限公司）、磷酸鹽緩沖液（武漢賽維爾生物公司）、尼羅紅（上海阿拉丁生化科技股份有限公司）、DMED/F12培養(yǎng)液（Gibco）、胎牛血清（Gibco）、1%青霉素/鏈霉素（Gibco）。

1.2 脂質(zhì)體制備及表征

1.2.1 脂質(zhì)體制備 采用逆向蒸發(fā)法［17,18］制備脂質(zhì)體，按一定比例稱量一份大豆軟磷脂、膽固醇，溶于加入一定量TPGS的7 mL乙醚，待固體完全溶解后加入溶于PBS的處方量的胰島素原料藥，在室溫及一定功率下進行超聲30 min，得到水包油（W/O）型乳劑，接著置于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀上進行減壓蒸發(fā)2 h，待有機溶劑完全蒸發(fā)后即得到胰島素脂質(zhì)體混懸液初液，將其移至離心管并在60 w功率、超5 s/空s，冰浴條件下進行聲震5 min得到淡藍(lán)色澄清透明的T-LPs/INS。

1.2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線建立與包封率測定 精密稱量胰島素標(biāo)準(zhǔn)品至5 mL容量瓶中稀釋至刻度，搖勻得10 mg/mL的胰島素標(biāo)準(zhǔn)液M0。分別從M0中移取0.125、0.250、0.375、0.500 mL于5 mL容量瓶中，定容至刻度，搖晃均勻后，測其吸光度A214nm，用胰島素濃度（C）對其A214nm進行回歸得出回歸方程即得到胰島素的標(biāo)準(zhǔn)曲線。采用破乳法對T-LPs/INS包封率、載藥率進行計算，公式如下：包封率=W1/W2 100%（W1為包封中藥物的質(zhì)量，W2 為體系中藥物的投入量）；載藥率=W1/W3 100%（W1為包封中藥物的質(zhì)量，W3為體系中脂質(zhì)體的總量）。

1.2.3 粒徑和zeta大小測定 使用激光粒徑電位分析儀測定脂質(zhì)體的粒徑與zeta電位。測定樣品前對脂質(zhì)體樣品溶液進行稀釋，每個樣品測定3次。

1.2.4 生物透射電鏡測定 采用生物透射電鏡對脂質(zhì)體形態(tài)進行分析。將脂質(zhì)體樣品置于銅網(wǎng)進行負(fù)染處理，待干燥后進行上機觀察拍攝。

1.3 細(xì)胞實驗

1.3.1 細(xì)胞培養(yǎng) 將人角膜上皮細(xì)胞（HCECs）培養(yǎng)在配有10%胎牛血清、1%青霉素/鏈霉素的DMEM/F12培養(yǎng)基中，并置于37 ℃且含有5%CO2空氣的加濕培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。指數(shù)期生長的細(xì)胞用于體外細(xì)胞毒性實驗。

1.3.2 體外細(xì)胞毒性 將HCECs鋪于96孔板過夜孵育24 h，加入稀釋的待測藥物，每組設(shè)置6個復(fù)孔。孵育24小時后棄去孔內(nèi)液體，接著每孔加入預(yù)配置好的110 μL培養(yǎng)基（CCK8∶培養(yǎng)基=1∶10），置于孵箱30 min，用酶標(biāo)儀測定在吸光度A450nm，并按照以下公式計算細(xì)胞活力（%）：[（A450nm實驗-A450nm空白）]/[（A450nm對照-A450nm空白）]100%。

將HCECs接種于12孔板，分別加入無血清稀釋的脂質(zhì)體空球（T-lip，2000 μg/mL）、胰島素溶液（200 μg/mL），T-LPs/INS（200 μg/mL）共孵育24 h 后，用PBS 沖洗3次，在各孔加入預(yù)先配置好的Ca-AM/PI雙染色試劑并孵育20 min后，熒光顯微鏡下觀察各組細(xì)胞的存活/死亡情況。

1.4 熒光示蹤兔眼表滯留研究

采用隨機數(shù)字表法將實驗兔分為2組，每組3只兔6眼。對照組：以預(yù)先配置的熒光素鈉稀釋液50 μL滴眼，連續(xù)3次間隔5 min/次；實驗組：以熒光素鈉標(biāo)記的T-LPs/INS 50 μL滴眼，連續(xù)3次滴眼間隔5 min/次。各組以最后1次滴眼的時間點開始計時，選取適合的時間節(jié)點在鈷藍(lán)光下拍照記錄實驗組和對照組兔眼表熒光的消除情況。

1.5 兔角膜滲透研究

以隨機數(shù)字表法將實驗兔分組2組，每組3只兔6眼。對照組：尼羅紅稀釋液50 μL滴眼，連續(xù)3次每次間隔5 min；實驗組：尼羅紅標(biāo)記的T-LPs/INS 50 μL滴眼，連續(xù)3次每次間隔5 min。各組滴眼后在45 min后用生理鹽水沖洗結(jié)膜囊，取下眼角膜進行染色、切片，倒置熒光顯微鏡下觀察對比實驗組與對照組切片，評估藥物在角膜組織各層的滲透性。

1.6 局部眼藥代動力學(xué)

1.6.1 實驗兔分組 健康并排除眼部疾患的新西蘭兔（重慶醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心提供，實驗動物使用許可證號SYXK2022-0016，動物倫理審批號為2022年科倫審第179號）48 只，雌雄隨機，體質(zhì)量2.5～3 kg。采用隨機數(shù)字表法分為實驗組、對照組，每組24 只兔48 眼，其中每組設(shè)置8 個時間點，每個時間點3 只兔6 只眼。

1.6.2 給藥以及眼部樣品采集處理、酶聯(lián)免疫吸附實驗檢測 用微量加樣器向?qū)φ战M兔眼注入50 μL預(yù)先配置的胰島素滴眼液、實驗組兔眼注入50 μL T-LPs/INS，使其輕輕閉合雙瞼眨眼數(shù)次后，任其自由活動。分別于滴眼后的0.1、0.25、0.75、1、2、2.5、4.5、6 h于耳緣靜脈處注射過量5%戊巴比妥鈉處死，生理鹽水充分沖洗眼球，采用微量注射器于角鞏膜緣處進針迅速取出房水，采用已消毒好的眼科器械迅速摘除眼球，分離角膜、晶狀體、玻璃體等組織，在濾紙吸干后精密稱量，所有樣品處理后于-80 ℃冰箱冷凍保存。

人胰島素酶聯(lián)免疫吸附實驗試劑盒置于室溫復(fù)溫1 h，嚴(yán)格按照試劑盒說明書操作進行組織藥物濃度檢測。采用酶標(biāo)儀在450 nm波長處測定各孔的A450nm，繪制出標(biāo)準(zhǔn)品的標(biāo)準(zhǔn)曲線并根據(jù)曲線方程計算各組樣品中胰島素藥品的濃度。

1.7 統(tǒng)計學(xué)方法分析

數(shù)據(jù)采用Graphpad prism 8進行統(tǒng)計分析，計量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示。應(yīng)用DAS2軟件擬合分析各組兔眼不同部位中胰島素的達峰時間（Tmax）、最大藥物濃度（Cmax）、及藥物濃度-時間曲線下面積（AUC0-t）、平均駐留時間（MRT0-t）、藥物半衰期（T?）等藥代動力學(xué)參數(shù)。兩組間數(shù)據(jù)差異分析采用獨立樣本t檢驗，多組間差異分析采用單因素方差分析，P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 脂質(zhì)體納米粒表征

用胰島素濃度對其A214nm進行回歸得出回歸方程（圖1A）即得到胰島素的標(biāo)準(zhǔn)曲線Y=0.0154X+0.0932，R2=0.9997，結(jié)果表明胰島素在25～100 μg/mL之間線性關(guān)系良好。脂質(zhì)體納米粒粒徑為107.0±2.951 nm，Zeta電位為（-6.93±0.505）mV。生物透射電鏡（圖1C）可以看到，包覆胰島素的脂質(zhì)體成圓球狀，表面平伏光滑，質(zhì)地均勻，顆粒間無明顯粘連。

圖1 胰島素濃度吸光度曲線及T-LPs/INS的表征檢測結(jié)果Fig. 1 Characterization of the prepared T-LPs/INS particles.A:A calibration curve of insulin for quantitation of its loading efficiency(absorbance at 214 nm).B:Size distribution of T-LPs/INS.C:TEM of T-LPs/INS.D:Zeta potential of T-LPs/INS.

2.2 脂質(zhì)體體外細(xì)胞毒性

CCK8結(jié)果表明（圖2），在一定濃度下，不同濃度的游離的脂質(zhì)體胰島素（T-lip）對細(xì)胞活力的影響沒有明顯差異（P>0.05）；胰島素在200 μg/mL濃度范圍內(nèi)，細(xì)存活率與對照組無明顯差異，當(dāng)胰島素濃度繼續(xù)增大后細(xì)胞活力明顯下降與對照組對比有較大差異（P<0.001）；在一定濃度范圍內(nèi)T-LPs/INS對于細(xì)胞存活率與對照組無明顯差異，超過這個范圍后，細(xì)胞活力下降顯著，與對照組相比差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.001）?；?死染色圖像中（圖3），綠色熒光細(xì)胞表示活細(xì)胞，其大量存在也表明胰島素?zé)o論是游離在溶液中還是載于脂質(zhì)體中對HCECs來說都是安全的。

圖2 HCECs與不同濃度游離的脂質(zhì)體（T-lip）、INS、T-LPs/INS共孵育24 h后的細(xì)胞活力Fig. 2 Viability of HCECs treated with free T-lip,insulin solution and T-LPs/INS at different concentrations for 24 h(***P<0.001).

圖3 脂質(zhì)體（T-lip，2000 μg/mL）、胰島素溶液（200 μg/mL），T-LPs/INS（200 μg/mL）與HCECs共孵育24 h后細(xì)胞的活/死染色圖像Fig. 3 Live/dead staining of HCECs treated for 24 h with T-lip(2000 μg/mL),insulin solution(200 μg/mL),T-LPs/INS(200 μg/mL)(Ca-AM/PI staining,original magnification:×100).

2.3 局部兔眼熒光滯留示蹤

如圖4A為給藥后不同時間段內(nèi)手持裂隙燈顯微鏡在鈷藍(lán)光下眼部熒光滯留的情況。在給新西蘭兔點眼后，隨著兔子淚液的更新及眨眼，藥物會被迅速消除，部分滴眼液會隨著眼角流出，在對照組中可以觀察到10 min左右檢測到微量熒光，實驗組在給藥后30～40 min 仍然可檢測到熒光?？梢灾庇^的看出T-LPs/INS滴眼液在眼部滯留能力強于INS滴眼液。

圖4 各組在兔眼眼表滯留性的熒光示蹤圖像及分析Fig. 4 Fluorescent tracer images showing ocular surface retention of insulin in rabbit eyes (A,fluorescein sodium staining,×1)and fluorescence area analysis curves(B)in each group.

2.4 兔角膜滲透性示蹤

尼羅紅標(biāo)記的T-LPs/INS與尼羅紅稀釋液分別滴入兔眼結(jié)膜囊不同時間后進行處理做成角膜冰凍切后皆在熒光顯微鏡下觀察到熒光顯色，圖5A為滴眼后45 min，對照組與實驗組角膜熒光積累量的示蹤對比。開始主要集中在角膜上皮層面，隨著時間的推移，TLPs/INS開始逐漸向角膜基質(zhì)層滲透并不斷累積，而對照組則停留在淺層角膜上皮組織。

圖5 各組在兔眼角膜的冰凍切片圖像及分析Fig. 5 Frozen section images of the cornea(A,Nile red and DAPI staining,×200) and fluorescence penetration area (B) in each group(****P<0.0001 vs INS).

2.5 局部兔眼藥代動力學(xué)

滴眼后，實驗組兔眼角膜中INS藥物濃度于1 h達到峰值，之后隨時間的推移呈逐步下降的趨勢，對照組兔眼中角膜INS 藥物濃度則隨著時間推移呈現(xiàn)逐步下降的趨勢（圖6）。點藥后0.1、0.25、0.75、1、2 h兩組兔眼角膜組織INS濃度相比較，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.01）；在點眼后2.5、4.5、6 h對照組兔眼角膜中的INS濃度低至無法檢測。

圖6 滴眼后不同時間各組兔眼角膜中胰島素濃度變化Fig. 6 Changes in insulin concentration in the cornea in each group at different times after eye dropping (Data are shown as Mean±SD,n=3).

通過藥代動力學(xué)軟件分析，各組藥代動力學(xué)參數(shù)如表1所示。實驗組單次點眼后角膜藥代動力學(xué)參數(shù)Tmax為1 h，Cmax為52.137 mIU/g，實驗組的T?為1.306 h約為對照組T?的2倍、AUC0-t是138.189 mIU/g*h約為對照組的13倍、MRT0-t為2.117 h約為對照組的3倍，藥代動力學(xué)參數(shù)擬合分析發(fā)現(xiàn)實驗組角膜INS濃度變化符合二室模型，對照組則符合一室模型。

表1 各組兔眼角膜中胰島素藥代動力學(xué)參數(shù)Tab.1 Pharmacokinetic parameters of insulin in rabbit cornea in T-LPs/INS and insulin groups

滴眼后，實驗組與對照組兔眼房水中INS藥物濃度均在0.75 h達到峰值，之后隨著時間的推移，兔眼房水中的INS藥物濃度呈現(xiàn)逐漸下降的趨勢（圖7）。點藥后0.1 h兩組兔眼房水組織INS濃度相比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05），點眼后0.25、0.75、1、2 h兩組兔眼房水INS濃度相比較，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.01）；在點眼后2.5、4.5、6 h 對照組兔眼房水中的INS 濃度低至無法檢測。

圖7 滴眼后不同時間各組兔眼房水中胰島素濃度變化Fig. 7 Changes in insulin concentration in the aqueous humor of rabbits in each group at different times after eye dropping(Mean±SD,n=3).

通過藥代動力學(xué)軟件分析，各組藥代動力學(xué)參數(shù)如下表2。實驗組與對照組單次點眼后兔眼房水Cmax分別為12.160 mIU/mL、2.454 mIU/mL，可以看出實驗組比對照組提高了4倍；實驗組兔眼房水的藥物T?為1.746 h，與對照組為相比提高了2倍；實驗組與對照組兔眼房水的AUC0-t分別為27.491 mIU/mL*h、2.883 mIU/mL*h，與對照組相比實驗組的AUC0-t約提高了9倍；實驗組房水的MRT0-t為2.062 h約是對照組的2倍。通過藥代動力學(xué)參數(shù)擬合分析得出實驗組兔眼房水INS濃度變化符合二室模型，對照組則符合一室模型。

表2 各組兔眼房水中胰島素藥代動力學(xué)參數(shù)Tab.2 Pharmacokinetic parameters of insulin in rabbit aqueous humor of various groups

3 討論

本研究以逆向蒸發(fā)法制備出TPGS修飾的載胰島素脂質(zhì)體，并考察了T-LPs/INS的表征、體外安全性及在兔眼角膜的滲透性及局部藥代動力學(xué)。從表征的結(jié)果來看，其粒徑適中性質(zhì)穩(wěn)定，微觀形態(tài)呈均勻分布的圓形，與Peng等［19,20］結(jié)果一致。安全性對新型眼部制劑的潛在應(yīng)用至關(guān)重要，脂質(zhì)體作為近年來新興的藥物載體，相關(guān)研究表明脂質(zhì)體包被藥物之后降低藥物對眼部組織的刺激，可減輕眼部各組織的毒副作用［21-23］，而在本研究中我們也通過多項實驗初步評估驗證了T-LPs/INS的安全性，活/死細(xì)胞實驗中顯示經(jīng)過藥物共孵育后，HCECs仍然大量存活并且活力良好。細(xì)胞毒性實驗研究中我們發(fā)現(xiàn)T-LPs/INS的安全濃度可達到200 μg/mL（約對應(yīng)于6 IU/mL），而Cruz-Cazarim［24］研究中胰島素治療干眼綜合征模型下角膜損傷的有效濃度為35 μg/mL（對應(yīng)于1 IU/mL），因此我們認(rèn)為本實驗制備的T-LPs/INS是相對安全的，可適用于局部滴眼實驗。

載藥系統(tǒng)給藥能到達特定細(xì)胞累積被其有效攝取利用才能起到作用。藥物通過被動擴散、主動擴散等方式滲透角膜，而角膜由5層結(jié)構(gòu)組成：上皮層、前彈力層、基質(zhì)層、后彈力層、內(nèi)皮層，呈現(xiàn)特有的脂溶性-水溶性-脂溶性夾心結(jié)構(gòu)，藥物滲透角膜過程中，角膜上皮的緊密連接是影響藥物吸收的重要屏障［25,26］。我們可以直觀的觀察到T-LPs/INS滴眼液滲透進入角膜深層的藥物濃度相對更高，具有良好的促進藥物在角膜滲透吸收的作用，這也將保證藥物能夠到達角膜各層并被角膜細(xì)胞有效攝取發(fā)揮作用。藥物眼表滯留研究中，由于TLPs/INS具有緩釋性能，相較于單純的胰島素滴眼液其在眼表滯留特性更好，這將會使得T-LPs/INS能較好的克服傳統(tǒng)局部滴眼液由于快速流失、利用率低導(dǎo)致的缺陷并降低頻繁滴眼所帶來的副作用。在眼部藥動學(xué)研究中，藥代動力學(xué)分析結(jié)果顯示，T-LPs/INS滴眼液與胰島素滴眼液對兔眼進行點眼后測量不同時間點的角膜、房水中胰島素藥物的濃度，幾乎都是使用T-LPs/INS滴眼的組中相對更高。對數(shù)據(jù)進行藥代學(xué)擬合分析，實驗組與對照組兔在單次點眼后角膜的T?分別為1.306 h、0.661 h，房水的T?分別為1.746 h、0.537 h，實驗組角膜的T?約為對照組的2倍、房水的T?約為對照組的3倍，說明脂質(zhì)體納米載藥系統(tǒng)可以延長藥物半衰期［27］，可通過減少用藥頻率進而減少藥物不良反應(yīng)及提高患者順應(yīng)性；兩組兔在單次點眼后角膜的AUC0-t分別為138.189 mIU/g*h、10.637 mIU/g*h，房水的AUC0-t分別為27.491 mIU/mL*h、2.883 mIU/L*h，與對照組相比，實驗組角膜的AUC0-t增加了12倍、房水的AUC0-t增加了9倍，這說明T-LPs/INS促進了藥物在眼部吸收與滯留，呈現(xiàn)出明顯的緩釋作用與長效性［28］。在給藥時由于眼局部結(jié)構(gòu)的多重屏障［29,30］單純的胰島素滴眼液局部點眼后的藥物的角膜滲透性較差，在角膜累積量也甚微，在眼部應(yīng)用生物利用率極低，這也很難達到有效的治愈角膜疾病的效果，而我們的研究中實驗組角膜與房水的藥物濃度與對照組相對比有顯著提高，這也說明TLPs/INS減少了藥物流失、提高了在角膜中藥物濃度的維持時間，使得藥物在角膜組織的累計相對提高。角膜與房水藥物濃度對比明顯累積量較大，這表明T-LPs/INS延緩藥物進入房水，也說明藥物從脂質(zhì)體中緩釋主要通過作用于角膜吸收而發(fā)揮治療效果，這提示TPGS修飾的胰島素脂質(zhì)體滴眼液對基本角膜損傷甚至角膜深層結(jié)構(gòu)抗炎、抗凋亡等的作用可能達到相對理想的效果，這也與Alkholief等［31,32］結(jié)果一致。藥代動力學(xué)參數(shù)擬合分析得出實驗組兔眼角膜、房水INS濃度變化符合二室模型，對照組則符合一室模型，單純藥物進入組織時很快分布并達到平衡，而以修飾的脂質(zhì)體包裹藥物后進入組織，我們推測脂質(zhì)體包裹藥物后由于對藥物的緩釋作用，使得藥物轉(zhuǎn)運分布的速率不一致，同時使藥物代謝動力學(xué)參數(shù)也出現(xiàn)明顯改變。

綜上所述T-LPs/INS相對單純胰島素滴眼液有效性會更好。同時由于其生物利用度提高，可以減少給藥頻率，更有利于增加患者依從性，這為進一步使用胰島素治療角膜疾病的應(yīng)用及臨床研究提供初步理論基礎(chǔ)，但本實驗研究仍存在局限性，檢測不同時間點的兔眼虹膜、晶體等眼部組織中藥物濃度時，由于藥物濃度極低，未能完全檢測出；并未設(shè)計檢測血液樣品藥物濃度，盡管由于血-眼屏障的存在，通過局部給藥進入全身循環(huán)的量甚微，今后應(yīng)注意完善實驗檢測方法及數(shù)據(jù)分析。