血管內(nèi)皮生長因子促后囊膜混濁形成機制研究進展

閆慧超 綜述 鮑永珍 審校

北京大學人民醫(yī)院眼科 北京大學人民醫(yī)院眼視光中心 北京大學人民醫(yī)院眼病與視光醫(yī)學研究所 視網(wǎng)膜脈絡膜疾病診治研究北京市重點實驗室 北京大學醫(yī)學部眼視光學院,北京 100044

后囊膜混濁(posterior capsule opacification,PCO)是白內(nèi)障囊外摘除手術(shù)及人工晶狀體植入術(shù)后常見的遠期并發(fā)癥,也是白內(nèi)障術(shù)后繼發(fā)視力下降的主要原因[1]。據(jù)統(tǒng)計,白內(nèi)障囊外摘除術(shù)后1年約10%的患者發(fā)生PCO,術(shù)后2年增至20%～30%[2-3];成人術(shù)后2～5年P(guān)CO發(fā)生率為30%～50%,兒童發(fā)生率近100%[4]。由此可見,PCO增加了臨床和社會經(jīng)濟負擔。目前對于PCO的發(fā)病機制仍未完全闡明,晶狀體上皮細胞(lens epithelial cells,LECs)的增生、遷移、上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial-mesenchymal transition,EMT)被認為是PCO的主要病理過程[5]。眾多細胞因子被證實參與此過程[6];血管內(nèi)皮生長因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)可以促進血管內(nèi)皮細胞生長、增生、遷移;研究發(fā)現(xiàn)VEGF廣泛參與了眼部結(jié)構(gòu)發(fā)育的生理過程及增生性疾病的病理過程,如年齡相關(guān)性黃斑變性、糖尿病視網(wǎng)膜病變、角膜及虹膜新生血管形成、青光眼濾過手術(shù)后瘢痕形成等[7-8];近年來,亦有研究表明VEGF在PCO發(fā)生和發(fā)展中有一定作用[9]。針對VEGF及其受體,研究者開發(fā)了相關(guān)靶向藥物,目前臨床上使用的藥物包括貝伐單抗、雷珠單抗、阿柏西普等[8,10-11]。一系列臨床研究表明了這些眼部抗VEGF藥物的有效性和安全性[12-15],抗VEGF藥物在眼科臨床的廣泛應用使更多患者受益,藥物的適應證也被逐漸拓寬[8]。對于VEGF在PCO中作用的探討可以為PCO的預防提供新思路,抗VEGF藥物的“老藥新用”或許能為患者節(jié)約成本,減輕臨床及社會負擔。本文就VEGF在PCO發(fā)病機制中的作用研究進展進行綜述。

1 VEGF概述

1.1 VEGF的起源

VEGF又稱為血管通透因子(vascular permeability factor,VPF)。自1913年Carrel首次描述了組織提取物可以促進體外細胞增生以來,新生血管的生成便成為眾多疾病領域的研究熱點[16]。隨著人們對腫瘤認識的不斷加深,科學家們觀察到腫瘤的生長大多伴隨著血管的增加;1983年,Harold等從豚鼠腫瘤細胞中分離純化并且鑒定了一種蛋白質(zhì),并將其命名為VPF,這種因子可以引起血管通透性增加,誘導血管滲漏,但其對于促進細胞有絲分裂的作用卻仍未明確。1989年,Ferrara實驗室發(fā)現(xiàn)牛垂體濾泡細胞分泌一種可以促進內(nèi)皮細胞有絲分裂的肝素結(jié)合蛋白,并將其命名為VEGF,后稱VEGF-A。同年Ferrara等報告了VEGF的cDNA克隆,包括VEGF121、VEGF165、VEGF189。1990年Keck等則描述了VPF的cDNA克隆,其編碼肽與VEGF189相同,從而證明了VEGF與VPF是同一種分子[17]。1992年de Vries等發(fā)現(xiàn)了內(nèi)皮細胞上VEGF的高親和力結(jié)合受體Fms樣酪氨酸激酶受體(Fms-like tyrosine kinase,FLT),后稱VEGF受體1(vascular endothelial growth factor receptor-1,VEGFR-1),并發(fā)現(xiàn)FLT屬于FMS家族,具有酪氨酸激酶活性;后續(xù)多項研究先后發(fā)現(xiàn)了包括VEGFR-2、VEGFR-3在內(nèi)的多個VEGF受體及VEGF家族其他成員(VEGF-B、VEGF-C、VEGF-D)[16-18]。

1.2 VEGF的功能

VEGF家族與不同亞型的VEGFR結(jié)合,通過不同信號通路,參與血管生成、胚胎發(fā)育、骨骼生長、造血、生殖、淋巴管生成等重要生理過程;也參與炎癥、腫瘤等病理過程[19]。現(xiàn)已確定VEGFR-2是信號傳導的主要受體,VEGFR-2與VEGF-A結(jié)合后導致受體二聚化和自磷酸化,激活了涉及增生、絲狀伸展、趨化、EMT等多個下游信號級聯(lián)反應[20],參與內(nèi)皮細胞的存活、增生、遷移,促進新生血管的形成及調(diào)節(jié)血管內(nèi)皮的通透性等病理生理過程。氧分壓在VEGF mRNA表達中起重要作用,低氧環(huán)境促進VEGF mRNA表達[19];缺氧誘導因子(hypoxia inducible factor,HIF)是由α-和β-亞基組成的異二聚體,VEGF是HIF-1α靶作用位點。常氧條件下,存在于細胞質(zhì)中的脯氨酰羥化酶(prolyl hydroxylase,PHD)使HIF-1α中的脯氨酸殘基羥化,從而使其通過泛素連接酶復合物降解。在低氧情況下,PHD被抑制,導致HIF-1α被保留,隨后可發(fā)生核異位;HIF-1α異位結(jié)合到各種基因(包括VEGF)的DNA和啟動轉(zhuǎn)錄的低氧反應原件上,在血管生成,細胞增生、存活、凋亡,紅細胞生成,腫瘤及纖維化疾病的EMT等過程中發(fā)揮作用[21-23]。

1.3 VEGF與EMT

EMT是誘導細胞運動并促進傷口愈合和胚胎發(fā)育存活的過程,是纖維化、慢性炎癥、腫瘤轉(zhuǎn)移的關(guān)鍵機制[24]。典型的EMT包括上皮形態(tài)的改變,如紡錘形態(tài)的獲得,上皮標志物(如E-鈣黏蛋白)的丟失,α-平滑肌動蛋白、β-連環(huán)蛋白的重新定位,間充質(zhì)標志物(N-鈣黏蛋白和波形蛋白)的表達及基質(zhì)金屬蛋白酶(matrix metalloproteinase,MMP)活性的增加等[25]。在EMT過程中,排列規(guī)整的上皮細胞失去與相鄰細胞的附著,伴隨細胞形態(tài)的改變及運動能力的增加。具有Smad家族蛋白激活能力的轉(zhuǎn)化生長因子β/轉(zhuǎn)化生長因子β受體(transforming growth factor-β/transforming growth factor-β recpetor,TGF-β/TβR)Ⅰ/Ⅱ信號是公認的組織重構(gòu)和纖維化中EMT的主要誘因[26]。此外,VEGF家族在EMT過程中也起到了重要作用。Yang等[27]發(fā)現(xiàn)VEGF在胰腺癌中可促進EMT,增加腫瘤細胞的遷移。VEGFR-1激活導致腫瘤細胞出現(xiàn)類似的EMT反應,包括細胞極性喪失、細胞分離增加等改變。Gonzalez-Moreno等[22]和Mak等[28]研究表明,VEGF可以促進EMT進程,VEGF處理后的細胞表現(xiàn)出梭形形態(tài)、E-鈣黏蛋白減少、N-鈣黏蛋白增加等一系列EMT特征表現(xiàn)。此外,Mak等[28]研究發(fā)現(xiàn),VEGF除了能夠促進新生血管形成之外,也能夠通過自分泌方式將這些細胞的形態(tài)轉(zhuǎn)變?yōu)榍忠u性增強的成纖維樣細胞,從而促進EMT進程。此外,VEGF可以通過影響Smad通路,例如VEGF介導的Smad7下調(diào),進而促進TGF-β在EMT進程中發(fā)揮作用[29]。因此,VEGF除了具有促進新生血管生成的作用外,也可以促進非新生血管生成的EMT過程。

2 VEGF在眼組織中的作用

VEGF在眼組織作用中的研究,最初大多集中在視網(wǎng)膜血管的發(fā)育及視網(wǎng)膜血管性疾病的病理過程中,如糖尿病視網(wǎng)膜病變、視網(wǎng)膜靜脈阻塞(retinal vein occlusion,RVO)等[19,30]。VEGF被證明是視網(wǎng)膜血管發(fā)育及缺血/低氧調(diào)節(jié)的驅(qū)動力,視網(wǎng)膜微循環(huán)缺血缺氧可導致眼部VEGF水平升高[18]。除視網(wǎng)膜新生血管外,亦有針對脈絡膜新生血管、角膜新生血管、虹膜新生血管等的研究[7,31-32];抑制VEGF可以有效抑制上述組織新生血管的形成;反之,上調(diào)VEGF水平可以導致這些組織新生血管的生成[30]。以上研究結(jié)果表明,VEGF在視網(wǎng)膜之外的眼組織病理性血管生成中也起到重要作用。此外,在干眼、翼狀胬肉、青光眼濾過術(shù)后瘢痕形成的發(fā)病機制中,VEGF也表現(xiàn)出促進炎癥反應、細胞增生及纖維化的重要作用[8,33]。目前,抗VEGF藥物的主要適應證為年齡相關(guān)性黃斑變性、糖尿病性黃斑水腫、RVO、新生血管性青光眼、早產(chǎn)兒視網(wǎng)膜病變等的治療[18,34];其也被應用于預防角膜新生血管形成及青光眼濾過手術(shù)后瘢痕的形成[32,35]。許多臨床研究已證明抗VEGF藥物應用于眼部的安全性和有效性,目前抗VEGF藥物已在眼科臨床治療中被廣泛使用[8,18,36]。

3 VEGF在PCO中的作用機制

晶狀體具有基底膜結(jié)構(gòu),即晶狀體囊膜,位于其外表面。白內(nèi)障摘除術(shù)可將位于晶狀體囊膜內(nèi)的大部分LECs去除,但任何剩余細胞可在前囊以及先前無細胞的后囊裸露區(qū)增生、遷移,并通過EMT轉(zhuǎn)化為肌成纖維細胞,肌成纖維細胞分泌過多細胞外基質(zhì)(extracellular matrix,ECM),引起囊袋混濁及皺縮,從而導致 PCO的發(fā)生及發(fā)展[37]。PCO主要有纖維化和再生2種形式,其中纖維化即從上皮到肌成纖維細胞表型的過度增生、基質(zhì)收縮、基質(zhì)沉積和細胞轉(zhuǎn)分化;再生為纖維細胞進一步分化,產(chǎn)生Elschnig珠和Soemmerring環(huán)。PCO的纖維化與再生均對視力有不同程度影響。當后囊膜混濁程度較輕時,對視力影響小;當混濁影響視軸區(qū)時,視力下降明顯[38]。此外,囊袋的收縮、前囊膜纖維化程度等也可對視力造成不同程度影響[1,38]。目前,對PCO的發(fā)病機制尚無定論,多種細胞因子被證實參與PCO的病理過程,包括TGF-β、VEGF、成纖維細胞生長因子(fibroblast growth factor,FGF)、表皮生長因子(epidermal growth factor,EGF)等[6,9,39-40]。

3.1 晶狀體中的VEGF

哺乳動物晶狀體在整個生命周期的大部分時間沒有血管。而晶狀體在發(fā)育早期被毛細血管叢包繞,覆蓋晶狀體前面的血管網(wǎng)源于虹膜基質(zhì)的脈管系統(tǒng),晶狀體后方的毛細血管網(wǎng)源于玻璃體動脈。在小鼠的胚胎晶狀體中可檢測到VEGF-A mRNA的表達,這些VEGF-A大多來自于胎兒的晶狀體脈管系統(tǒng),胚胎晚期VEGF-A水平降低,晶狀體周圍毛細血管網(wǎng)退化。Garcia等[41]認為胚胎期晶狀體產(chǎn)生的VEGF-A促進了晶狀體的發(fā)育,與正常晶狀體相比,缺少VEGF-A刺激的晶狀體較小。Garcia等[41]將小鼠Vegfa基因靶向敲除后發(fā)現(xiàn),與野生型相比,VegfaCKO小鼠的晶狀體在胚胎發(fā)育期無法擁有完整的脈管系統(tǒng),產(chǎn)后晶狀體形態(tài)較小;且隨年齡增長,VegfaCKO小鼠的晶狀體可出現(xiàn)不同程度的核混濁。有趣的是,除了房水循環(huán)所帶來的VEGF外,成年人的LECs及纖維細胞中也檢測到了VEGF-A mRNA及VEGFR-2的表達。成年晶狀體內(nèi)VEGF-A的表達可能與晶狀體的異常結(jié)構(gòu)有關(guān),晶狀體成形后,與其他具有結(jié)締組織的血管不同,其與血管供應分離,并且可能長期處于缺氧環(huán)境中[9,41-42]。研究表明,正常情況下成年人晶狀體前表面氧分壓約為14 mmHg(1 mmHg=0.133 kPa),后表面氧分壓為8～10 mmHg,遠低于身體其他組織及眼表氧分壓[43]。缺氧環(huán)境誘導晶狀體內(nèi)部(包括纖維細胞及上皮細胞)產(chǎn)生VEGF-A,并且,前房的低氧環(huán)境也可以誘導LECs產(chǎn)生VEGF-A。晶狀體含有豐富的糖酵解酶,可以從糖酵解中獲得大量ATP;LECs和纖維細胞也含有豐富的葡萄糖轉(zhuǎn)運蛋白,這種代謝機制很可能是由于晶狀體的缺氧環(huán)境而形成的;同時,這種代謝機制也為促使VEGF-A產(chǎn)生的缺氧環(huán)境做了很好的證明。晶狀體周圍的低氧環(huán)境對于其保持透明度和調(diào)節(jié)生長至關(guān)重要。在表面無血管系統(tǒng)的完整晶狀體中,VEGF及其受體在晶狀體中的功能很可能是互相結(jié)合以防止外源性VEGF的侵入對晶狀體本身造成更大的傷害[41-43]。

3.2 VEGF直接促進PCO發(fā)展

近年來研究發(fā)現(xiàn),VEGF可直接影響PCO的發(fā)展進程,Dawes等[44]在對不同年齡組白內(nèi)障患者術(shù)后PCO發(fā)生率差異比較的研究中對比了不同年齡組患者的囊袋在離體培養(yǎng)條件下細胞因子水平的差異,結(jié)果發(fā)現(xiàn)60歲以上患者的囊袋培養(yǎng)中白細胞介素(interleukin,IL)-10、IL-12、IL-13和VEGF在術(shù)后2 d即顯著升高。Eldred等[9]在探索細胞因子對PCO的作用時對囊袋中27種細胞因子進行了檢測,也檢測到VEGF水平的升高;在晶狀體的囊袋中也檢測到了可與VEGF結(jié)合的受體(尤其是VEGFR-2的表達)以及供VEGF儲存的硫酸乙酰肝素蛋白多糖;特別是VEGF被發(fā)現(xiàn)可通過LECs的自分泌機制調(diào)節(jié)細胞的存活、增生、EMT等過程。VEGFR抑制劑阿昔替尼可抑制體外囊袋系統(tǒng)PCO的進程。此外,TGF、FGF、EGF等其他生長因子及炎性介質(zhì),如IL-1α、IL-6等被發(fā)現(xiàn)均可上調(diào)VEGF mRNA表達[19];白內(nèi)障術(shù)后炎癥反應使細胞因子水平升高,各因子之間不斷相互作用,提高了VEGF水平,也加速了PCO進程[19,44-45]。

3.3 VEGF與TGF-β2協(xié)同參與PCO進程

TGF-β2是PCO過程的起始因子。TGF-β2在體內(nèi)以激活和無活性2種形式存在,ELISA檢測顯示人眼房水中總TGF-β2和活性TGF-β2水平為0.491～1.480 ng/ml和0.182～0.283 ng/ml,白內(nèi)障手術(shù)可以使活性TGF-β2水平迅速升高[46];活化后的TGF-β2與細胞膜上TβRⅡ結(jié)合,TβRⅡ與配體結(jié)合,募集并磷酸化TGFβRⅠ,TGFβRⅠ活化后磷酸化Smad2/Smad3,磷酸化后的Smad2/3與Smad4結(jié)合形成Smad4復合體,從而進入細胞核內(nèi)誘導基因轉(zhuǎn)錄,介導LECs的增生、遷移,以及ECM的產(chǎn)生[47];另有研究證明,TGF-β2可通過PI3K途徑、MAPK途徑、ERK途徑、Notch等非經(jīng)典途徑介導這一過程[48-50]。TGF-β2作用通路復雜,因此VEGF可以通過參與其不同作用環(huán)節(jié),協(xié)同促進PCO發(fā)展。

3.3.1TGF-β2通過MMP作用裂解ECM,促使VEGF釋放 MMP屬于Metzincin蛋白酶家族,通過蛋白水解過程水解蛋白質(zhì)的肽鍵,參與眾多正常生理過程(如胚胎發(fā)育和傷口愈合)及病理過程(如腫瘤形成、纖維化等)[51]。MMP可以降解ECM中的各種蛋白成分,打破組織學屏障,促進細胞遷移[52]。在一項有關(guān)MMP對PCO形成影響的離體研究中發(fā)現(xiàn),LECs遷移過程伴隨著MMP-2、MMP-9含量的升高,MMP抑制劑可有效降低MMP-2、MMP-9的含量,從而抑制細胞的遷移和囊袋的收縮[53]。此外,MMP被證實在TGF-β2介導的白內(nèi)障術(shù)后LECs遷移和EMT過程中也有重要作用;正常情況下,晶狀體中MMP含量很低,白內(nèi)障術(shù)后TGF-β2水平升高導致晶狀體內(nèi)MMP-2、MMP-9激活,表達上調(diào),活化后的MMP能夠裂解ECM中的有效成分(晶狀體中主要為Ⅳ型膠原蛋白)。ECM被公認存儲有大量無活性TGF-β2和VEGF等細胞因子,ECM裂解后,大量細胞因子被釋放;VEGF被釋放后,可與其受體結(jié)合,繼續(xù)促進LECs的增生、遷移、EMT等過程[9,52]。此外,有研究表明蛋白酶體抑制劑可在體外條件下調(diào)節(jié)MMP-2、MMP-9活性,從而抑制由TGF-β2介導的細胞基質(zhì)收縮,減少LECs的增生、遷移、EMT過程[2];外科創(chuàng)傷引起的細胞因子升高一般在術(shù)后幾個月內(nèi)恢復正常水平,而PCO是白內(nèi)障術(shù)后遠期并發(fā)癥,短期內(nèi)細胞因子的升高不足以促進遠期PCO的發(fā)展,因此LECs需要長期維持活性,不斷增生、遷移、發(fā)生EMT才可能形成PCO,這有賴于TGF-β2、VEGF及其他細胞因子的自分泌及旁分泌機制[46]。ECM被裂解后的細胞因子或許維持了白內(nèi)障術(shù)后長期細胞因子的水平,這也許可以解釋短期炎癥反應與PCO之間的關(guān)系。

3.3.2TGF-β2通過上調(diào)HIF-1α促進VEGF介導的EMT McMahon等[54]在對TGF-β與HIF-1α的關(guān)系研究中發(fā)現(xiàn),當用TGF-β刺激肝癌細胞系HepG2和纖維肉瘤細胞系HT1010時,可以促進HIF-1α的核聚集,且刺激時長與HIF-1α表達量在16 h內(nèi)呈正相關(guān)。Basu等[55]在對腎纖維化疾病的研究中發(fā)現(xiàn),TGF-β在常氧或缺氧條件下均可通過Smad途徑刺激腎小管上皮細胞中HIF-1α的表達;Nahomi等[21]在對PCO進行研究時發(fā)現(xiàn),采用TGF-β2處理人類LECs后,24 h內(nèi)HIF-1α上調(diào),并伴有VEGF-A升高。Siegfried等[56]在對白內(nèi)障術(shù)后患者眼部氧含量的研究中發(fā)現(xiàn),白內(nèi)障手術(shù)會使晶狀體前后表面氧分壓升高。晶狀體表面氧分壓的升高將會導致HIF-1α降解,但是升高的TGF-β2同時會引起HIF-1α上調(diào),上調(diào)后的HIF-α可以通過與VEGF的相互作用,啟動VEGF介導的EMT過程[21]。

3.3.3VEGF通過對TGF-β2信號通路中Smad7的抑制作用介導EMT Smad7是Smad蛋白家族中重要的負性調(diào)節(jié)因子,Smad7可在Smad相關(guān)信號傳導通路中干擾TGF-β信號;Smad7可與Smad4競爭,抑制Smad復合物的形成,從而影響TGF-β功能的進一步發(fā)揮[57]。Saika等[37]首先發(fā)現(xiàn)Smad7轉(zhuǎn)基因技術(shù)可以抑制小鼠角膜瘢痕化進程,隨后發(fā)現(xiàn)上調(diào)Smad7可以抑制PCO模型小鼠LECs的EMT過程。VEGF可以通過下調(diào)Smad7,促進TGF-β在EMT進程中發(fā)揮作用。因此VEGF可以通過干擾Smad7對于TGF-β的抑制作用,從而促進TGF-β2介導的EMT過程。

綜上所述,VEGF除了在常見眼部病理性新生血管疾病中有重要作用外,在LECs的增生、遷移、EMT等病理過程中也發(fā)揮了重要作用;VEGF被證實通過不同信號轉(zhuǎn)導通路和作用機制直接或間接(與TGF-β2的協(xié)同作用)促進PCO的形成。目前,抗VEGF藥物是唯一廣泛應用于眼科增生性病變、針對細胞因子的生物靶向藥物,關(guān)注和研究VEGF在PCO發(fā)生和發(fā)展中的作用對PCO的早期預防及臨床中白內(nèi)障術(shù)后抗VEGF藥物的使用等均有潛在的臨床價值。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突