白藜蘆醇對(duì)糖尿病大鼠晶狀體混濁的防治作用及其機(jī)制

葛曉芳 朱大強(qiáng) 劉亞東 羅納麗

鄭州大學(xué)第二附屬醫(yī)院眼科,鄭州 450000

糖尿病性白內(nèi)障是一種常見的代謝性白內(nèi)障,在糖尿病眼病患者中發(fā)生率僅次于視網(wǎng)膜病變,且具有較高致盲率[1-2]。糖尿病性白內(nèi)障發(fā)生和發(fā)展過程中,氧化應(yīng)激所致細(xì)胞外基質(zhì)聚集發(fā)揮重要作用,可誘導(dǎo)晶狀體上皮細(xì)胞(lens epithelial cells,LECs)凋亡,造成晶狀體混濁[3-4]。白藜蘆醇是一種非黃酮類多酚化合物,屬于抗氧化劑,通過抑制體內(nèi)過量自由基,激活機(jī)體抗氧化酶系統(tǒng),發(fā)揮抗氧化作用。研究發(fā)現(xiàn),白藜蘆醇能抑制PM2.5誘導(dǎo)的細(xì)胞內(nèi)活性氧生成及細(xì)胞凋亡[5],推測(cè)其在抑制細(xì)胞氧化應(yīng)激和細(xì)胞凋亡中發(fā)揮重要作用。還有報(bào)道顯示,白藜蘆醇可抑制高糖環(huán)境下的視網(wǎng)膜細(xì)胞凋亡,但作用機(jī)制尚不明確[6]。目前,關(guān)于白藜蘆醇是否能夠防治糖尿病性白內(nèi)障的相關(guān)研究較少。本研究擬探討白藜蘆醇對(duì)糖尿病大鼠晶狀體混濁的防治作用及其機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 選取50只8周齡SPF級(jí)健康雄性SD大鼠,體質(zhì)量300～320 g,均購(gòu)自中國(guó)醫(yī)藥研究開發(fā)中心有限公司[許可證號(hào):SYXK(京)2019-0051]。實(shí)驗(yàn)前經(jīng)托吡卡胺滴眼液擴(kuò)瞳、裂隙燈顯微鏡檢查顯示晶狀體透明,尾靜脈采血檢測(cè)血糖<6.7 mmol/L。適應(yīng)性飼養(yǎng)7 d,常規(guī)飼料,自由飲水,12 h/12 h晝夜周期照明,溫度22～24 ℃,濕度為55%。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用和喂養(yǎng)遵循“3R”原則。本研究經(jīng)鄭州大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會(huì)審核批準(zhǔn)(批文號(hào):IACYC2019-02)。

1.1.2主要試劑及儀器 白藜蘆醇(純度>99%)、鏈脲佐菌素(streptozotoein,STZ)(純度>98%)(美國(guó)Sigma公司);格列齊特(天津華津制藥有限公司);托吡卡胺滴眼液(武漢五景藥業(yè)有限公司);BCA試劑盒;BCA試劑盒(美國(guó)BioVision公司);兔抗大鼠核因子E2相關(guān)因子2(nuclear factor E2-related factor 2,Nrf2)、兔抗大鼠血紅素氧合酶1(heme oxygenase-1,HO-1)抗體、山羊抗兔二抗IgG(北京博奧森生物技術(shù)有限公司);過氧化物歧化酶1(superoxide dismutase 1,SOD1)、SOD2、SOD3、谷胱甘肽過氧化物酶1(glutathione peroxidase 1,GPX1)酶聯(lián)免疫吸附法(enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)試劑盒(上海雅吉生物科技有限公司);空腹胰島素ELISA試劑盒(上海邦景實(shí)業(yè)有限公司);蘇木精-伊紅染色試劑盒(上海邁基生物技術(shù)有限公司)。SLICPS 2000型裂隙燈顯微鏡圖像分析系統(tǒng)(中國(guó)中醫(yī)研究院眼科醫(yī)院、蘇州醫(yī)療器械總廠);Multiskan型酶標(biāo)儀(美國(guó)賽默飛世爾公司);GelDoc 2000凝膠成像系統(tǒng)(美國(guó)Bio-Rad公司);Mias-2000真彩色病理顯微圖像分析系統(tǒng)(成都川大智勝軟件股份有限公司)。

1.2 方法

1.2.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組及干預(yù) 采用隨機(jī)體重排序法將大鼠分為空白對(duì)照組、模型組、格列齊特組、低劑量白藜蘆醇組和高劑量白藜蘆醇組,每組各10只。其中模型組、格列齊特組、低劑量白藜蘆醇組和高劑量白藜蘆醇組均建立大鼠糖尿病性白內(nèi)障模型;建模成功后第3天開始給藥,空白對(duì)照組和模型組以生理鹽水灌胃,格列齊特組以2 mg/(kg·d)格列齊特混懸液灌胃,低、高劑量白藜蘆醇組分別以20 mg/(kg·d)、40 mg/(kg·d)白藜蘆醇灌胃,給藥量均為10 ml/kg,1次/d,連續(xù)4周。用藥期間動(dòng)物自由飲水、進(jìn)食,不給予胰島素及其他降糖藥物。給藥結(jié)束后第2天進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.2.2大鼠糖尿病性白內(nèi)障模型的制備 以0.1 mmol/L無菌枸櫞酸鈉緩沖液(4 ℃,pH 4.2)將STZ配備成質(zhì)量分?jǐn)?shù)2%溶液,大鼠禁食12 h,以2% STZ溶液60 mg/kg一次性腹腔內(nèi)注射[7]。建模成功標(biāo)準(zhǔn):造模后3 d,大鼠晶狀體混濁程度為早期、中期,尾靜脈血檢測(cè)血糖≥16.7 mmol/L。剔除不符合標(biāo)準(zhǔn)大鼠,造模成功36只,每組各9只。

1.2.3大鼠空腹血糖濃度測(cè)定 大鼠禁食12 h,取3 ml大鼠尾靜脈血,滴在血糖試紙上,準(zhǔn)確反應(yīng)5 s,采用血糖儀比色、記錄,檢測(cè)空腹血糖濃度。

1.2.4ELISA法檢測(cè)大鼠空腹血清胰島素水平 取30 μl大鼠腹主動(dòng)脈血,室溫下靜置2～4 h。4 ℃條件下,離心半徑10 cm,12 000 r/min離心10 min,取上清液。按照空腹胰島素ELISA試劑盒使用說明書檢測(cè)。分別將5 μl標(biāo)準(zhǔn)品、待測(cè)樣品加入各孔,室溫下振蕩1 min。各孔分別加入45 μl一抗工作液,封閉,室溫下振蕩2 h,4 ℃過夜;洗滌液清洗,濾紙上印干,反復(fù)6次。各孔分別加入100 μl酶標(biāo)抗體工作液,封閉,37 ℃干燥箱內(nèi)干燥10 min;洗滌液清洗,濾紙上印干,反復(fù)6次。各孔分別加入100 μl底物工作液,37 ℃干燥箱暗處反應(yīng)15 min。各孔分別加入100 μl終止液,反應(yīng)10 min,在20 min內(nèi)觀察酶標(biāo)儀450 nm處各孔吸光度(absorbance,A)值。以A值為縱坐標(biāo),以標(biāo)準(zhǔn)液濃度為橫坐標(biāo),創(chuàng)建濃度標(biāo)準(zhǔn)曲線,按照A值計(jì)算樣本濃度。

1.2.5ELISA法檢測(cè)血清氧化應(yīng)激反應(yīng)因子SOD1、SOD2、SOD3、GPX1含量 完成空腹血糖檢測(cè)后,取30 μl大鼠腹主動(dòng)脈血,室溫下靜置2～4 h。4 ℃條件下,離心半徑6 cm,3 500 r/min離心15 min,取上清液。嚴(yán)格按照SOD1、SOD2、SOD3、GPX1試劑盒使用說明書操作。分別設(shè)空白孔、標(biāo)準(zhǔn)孔、待測(cè)樣品孔。酶標(biāo)包被板上加50 μl標(biāo)準(zhǔn)品,先后將40 μl樣品稀釋液、10 μl待測(cè)樣品加入待測(cè)樣品孔,混勻,封板膜封閉,37 ℃溫育30 min。揭開封板膜,棄去液體,甩干,洗滌液洗滌,重復(fù)5次,拍干;除空白孔外,各孔均分別加入50 μl酶標(biāo)試劑,封板膜封閉,37 ℃溫育30 min。揭開封板膜,棄去液體,甩干,洗滌液洗滌,重復(fù)5次,拍干;各孔依次加入顯色劑A 50 μl、顯色劑B 50 μl,振蕩混勻,37 ℃避光顯色,共15 min。各孔加入50 μl終止液,反應(yīng)10 min,在20 min內(nèi)檢測(cè)酶標(biāo)儀450 nm波長(zhǎng)處A值。以A值為縱坐標(biāo),以標(biāo)準(zhǔn)誤的濃度為橫坐標(biāo)創(chuàng)建標(biāo)準(zhǔn)曲線,按照樣品A值計(jì)算樣本濃度。

1.2.6晶狀體混濁程度檢測(cè)及分期 分別在治療前(建模成功后)、治療后采用托吡卡胺滴眼液點(diǎn)眼擴(kuò)瞳,質(zhì)量分?jǐn)?shù)2%戊巴比妥鈉50 mg/kg(0.25 ml/100 g)腹腔內(nèi)注射麻醉,采用裂隙燈顯微鏡圖像分析系統(tǒng)分析大鼠晶狀體混濁程度,裂隙寬度為0.2 mm,光帶攝入角度為35°,放大30倍。每隔2周檢測(cè)1次,共8周。晶狀體混濁分期標(biāo)準(zhǔn)[8]:晶狀體透明為0期;晶狀體瞳孔區(qū)透明,周邊皮質(zhì)存在少量囊泡為Ⅰ期;晶狀體周邊皮質(zhì)囊泡增多、融合,少量擴(kuò)展到瞳孔區(qū)皮質(zhì),核區(qū)發(fā)生輕度絮狀混濁為Ⅱ期;晶狀體瞳孔區(qū)皮質(zhì)出現(xiàn)大量囊泡,核混濁區(qū)加重為Ⅲ期;晶狀體完全混濁為Ⅳ期。0期為正常,Ⅰ期為早期白內(nèi)障,Ⅱ期為中期白內(nèi)障,Ⅲ期為成熟期白內(nèi)障,Ⅳ期為過熟期白內(nèi)障。同時(shí)在治療后24 h進(jìn)行眼前節(jié)照相,以裂隙燈顯微鏡彌散光照明法檢查,獲得清晰圖像后拍照。

1.2.7獲取晶狀體組織 各組大鼠完成以上檢測(cè)后均以斷頸法處死,摘取右側(cè)眼球,去除懸韌帶和玻璃體,獲取晶狀體組織,沿中軸平分為3份,其中1份置于液氮保存,以備檢測(cè)蛋白表達(dá);另2份置于質(zhì)量分?jǐn)?shù)4%多聚甲醛中固定,以備檢測(cè)晶狀體細(xì)胞形態(tài)、上皮細(xì)胞凋亡。每份晶狀體組織所含樣本量均包括空白對(duì)照組10只及模型組、格列齊特組、低劑量白藜蘆醇組、高劑量白藜蘆醇組各9只。

1.2.8蘇木精-伊紅染色法觀察晶狀體細(xì)胞形態(tài) 取1份4%多聚甲醛中固定的晶狀體組織,流水沖洗,常規(guī)梯度乙醇脫水,二甲苯透明,石蠟包埋,4 μm厚切片,置于載玻片上。脫蠟,行蘇木精-伊紅染色,二甲苯透明,中性樹膠封片。光學(xué)顯微鏡下觀察,200倍視野下各標(biāo)本隨機(jī)選取5個(gè)視野,采用病理顯微圖像分析系統(tǒng)對(duì)大鼠晶狀體細(xì)胞進(jìn)行形態(tài)學(xué)分析。

1.2.9TUNEL法測(cè)定LECs凋亡 取1份4%多聚甲醛中固定的晶狀體組織,石蠟包埋,5 μm厚切片。嚴(yán)格按照TUNEL試劑盒使用說明書進(jìn)行操作,對(duì)大鼠LECs凋亡情況進(jìn)行檢測(cè)。光學(xué)顯微鏡下觀察,200倍視野下隨機(jī)選擇4個(gè)視野計(jì)數(shù)凋亡細(xì)胞數(shù)及全部細(xì)胞數(shù)。凋亡細(xì)胞核呈棕黃色染色,細(xì)胞凋亡率=凋亡細(xì)胞數(shù)/總細(xì)胞數(shù)×100%。

1.2.10Western blot法測(cè)定晶狀體中Nrf2、HO-1蛋白相對(duì)表達(dá)量 取1份液氮保存的晶狀體組織,置于1～2 ml勻漿器,組織塊以剪刀剪碎,裂解30 min。4 ℃條件下,離心半徑7 cm,12 000 r/min離心5 min,取上清液。BCA試劑盒內(nèi)A液、B液按照50∶1混合,37 ℃避光孵育30 min,檢測(cè)蛋白濃度。加入5倍蛋白上樣緩沖液,沸水浴10 min變性。質(zhì)量分?jǐn)?shù)10%聚丙烯酰胺凝膠電泳,轉(zhuǎn)印到PVDF微孔膜,室溫下置于脫脂牛奶中在搖床上封閉2 h。兔抗大鼠Nrf2、HO-1一抗(1∶1 000)以封閉液稀釋,PVDF膜浸泡在一抗孵育液內(nèi),4 ℃孵育過夜。加入山羊抗兔二抗IgG(1∶5 000),37 ℃條件下?lián)u床孵育2 h。采用TBST洗滌PVDF膜,晾干、ECL顯色、掃描膠片,采用Band-Scan軟件分析灰度值,以β-actin作為內(nèi)參。目標(biāo)蛋白相對(duì)表達(dá)量=目標(biāo)蛋白條帶灰度值/β-actin蛋白條帶灰度值。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠空腹血糖濃度及空腹胰島素水平比較

空白對(duì)照組、模型組、格列齊特組、低劑量白藜蘆醇組、高劑量白藜蘆醇組大鼠空腹血糖濃度及空腹胰島素水平總體比較,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=148.731、134.154,均P<0.001)。與模型組比較,空白對(duì)照組、格列齊特組、低劑量白藜蘆醇組、高劑量白藜蘆醇組空腹血糖、空腹胰島素水平降低,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.05);與格列齊特組比較,低劑量白藜蘆醇組空腹血糖、空腹胰島素水平升高,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.05);與低劑量白藜蘆醇組比較,高劑量白藜蘆醇組空腹血糖、空腹胰島素水平降低,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.05);格列齊特組與高劑量白藜蘆醇組比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P>0.05)(表1)。

表1 各組大鼠空腹血糖、空腹胰島素水平比較(x±s)Table 1 Comparison of fasting blood glucose and fasting insulin levels of rats among different groups (x±s)組別樣本量空腹血糖(mmol/L)空腹胰島素[mmol/(L·min)]空白對(duì)照組105.52±1.0222.05±2.26模型組918.25±1.51a44.01±2.32a格列齊特組9 7.96±1.05ab 25.05±2.62ab低劑量白藜蘆醇組910.02±1.35abc35.15±2.55abc高劑量白藜蘆醇組98.08±1.11abd26.14±2.01abdF值148.731134.154P值<0.001<0.001 注:與空白對(duì)照組比較,aP<0.05;與模型組比較,bP<0.05;與格列齊特組比較,cP<0.05;與低劑量白藜蘆醇組比較,dP<0.05(單因素方差分析,LSD-t檢驗(yàn)) Note:Compared with blank control group,aP<0.05;compared with model group,bP<0.05;compared with gliclazide group,cP<0.05;compared with low-dose resveratrol group,dP<0.05 (One-way ANOVA,LSD-t test)

表2 各組大鼠SOD1、SOD2、SOD3、GPX1濃度比較(x±s,μmol/L)Table 2 Comparison of SOD1,SOD2,SOD3 and GPX1 concentrations among different groups (x±s,μmol/L)組別樣本量SOD1SOD2SOD3GPX1空白對(duì)照組101.17±0.081.41±0.091.27±0.080.97±0.07模型組90.78±0.06a0.88±0.08a0.82±0.05a0.65±0.05a格列齊特組90.98±0.07ab1.21±0.07ab1.14±0.05ab0.89±0.05ab低劑量白藜蘆醇組90.88±0.07abc0.95±0.08abc0.89±0.04abc0.79±0.04abc高劑量白藜蘆醇組91.01±0.05abd1.22±0.08abd1.13±0.06abd0.88±0.05abdF值45.09368.05097.19448.510P值<0.001<0.001<0.001<0.001 注:與空白對(duì)照組比較,aP<0.05;與模型組比較,bP<0.05;與格列齊特組比較,cP<0.05;與低劑量白藜蘆醇組比較,dP<0.05(單因素方差分析,LSD-t檢驗(yàn)) SOD:過氧化物歧化酶;GPX:谷胱甘肽過氧化物酶 Note:Compared with blank control group,aP<0.05;compared with model group,bP<0.05;compared with gliclazide group,cP<0.05;compared with low-dose resveratrol group,dP<0.05 (One-way ANOVA,LSD-t test) SOD:superoxide dismutase;GPX:glutathione peroxidase

2.2 各組大鼠血清氧化應(yīng)激反應(yīng)相關(guān)因子濃度比較

空白對(duì)照組、模型組、格列齊特組、低劑量白藜蘆醇組、高劑量白藜蘆醇組大鼠血清SOD1、SOD2、SOD3、GPX1濃度總體比較,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=45.093、68.050、97.194、48.510,均P<0.001)。與模型組比較,空白對(duì)照組、格列齊特組、低劑量白藜蘆醇組、高劑量白藜蘆醇組SOD1、SOD2、SOD3、GPX1濃度升高,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.05);與格列齊特組比較,低劑量白藜蘆醇組SOD1、SOD2、SOD3、GPX1濃度降低,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.05);與低劑量白藜蘆醇組比較,高劑量白藜蘆醇組SOD1、SOD2、SOD3、GPX1濃度升高,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.05);格列齊特組與高劑量白藜蘆醇組比較,差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)(表2)。

2.3 各組大鼠晶狀體混濁程度比較

眼前節(jié)照相檢查顯示,空白對(duì)照組未見晶狀體混濁。模型組、格列齊特組、低劑量白藜蘆醇組、高劑量白藜蘆醇組均出現(xiàn)不同程度晶狀體混濁?？瞻讓?duì)照組、模型組、格列齊特組、低劑量白藜蘆醇組、高劑量白藜蘆醇組大鼠治療前不同晶狀體混濁程度占比總體比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(H=0.233,P=0.628)。治療后不同晶狀體混濁程度占比總體比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(H=7.514,P<0.001),其中模型組晶狀體混濁程度較空白對(duì)照組嚴(yán)重;與模型組比較,格列齊特組、低劑量白藜蘆醇組、高劑量白藜蘆醇組晶狀體混濁程度減輕,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.05);與格列齊特組比較,低劑量白藜蘆醇組晶狀體混濁程度加重,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);與低劑量白藜蘆醇組比較,高劑量白藜蘆醇組晶狀體混濁程度減輕,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);格列齊特組與高劑量白藜蘆醇組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。與治療前相比,格列齊特組、低劑量白藜蘆醇組、高劑量白藜蘆醇組治療后晶狀體混濁程度均減輕,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.05)(圖1,表3)。

圖1 各組大鼠眼前節(jié)圖像分析 空白對(duì)照組未出現(xiàn)晶狀體混濁;模型組晶狀體混濁程度較明顯;格列齊特組、低劑量白藜蘆醇組、高劑量白藜蘆醇組晶狀體混濁程度均較模型組明顯改善,其中高劑量白藜蘆醇組改善更顯著 A:空白對(duì)照組 B:模型組 C:格列齊特組 D:低劑量白藜蘆醇組 E:高劑量白藜蘆醇組

2.4 各組大鼠晶狀體細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化

蘇木精-伊紅染色結(jié)果顯示,空白對(duì)照組大鼠晶狀體細(xì)胞形態(tài)無異常變化。模型組大鼠LECs排列紊亂,細(xì)胞核縮小,染色不均勻,后囊區(qū)晶狀體纖維細(xì)胞存在未被降解的細(xì)胞器。與模型組比較,格列齊特組、低劑量白藜蘆醇組、高劑量白藜蘆醇組晶狀體細(xì)胞及亞細(xì)胞器異常改變減輕,其中格列齊特組、高劑量白藜蘆醇組異常情況更輕微(圖2)。

圖2 各組大鼠晶狀體細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化比較(HE ×200,標(biāo)尺=20 μm) 空白對(duì)照組LECs均勻分布,形態(tài)規(guī)則,細(xì)胞核呈橢圓形,染色均勻,纖維細(xì)胞無異常;模型組LECs排列紊亂,形態(tài)呈柱狀或扁平狀,細(xì)胞核縮小,染色不均勻,后囊區(qū)晶狀體纖維細(xì)胞存在未被降解細(xì)胞器;格列齊特組、高劑量白藜蘆醇組LECs排列較整齊,細(xì)胞質(zhì)內(nèi)空泡減少,細(xì)胞器減少;低劑量白藜蘆醇組LECs排列稍紊亂,存在少量胞質(zhì)內(nèi)空泡,后囊區(qū)晶狀體纖維細(xì)胞存在未被降解細(xì)胞器 A:空白對(duì)照組 B:模型組 C:格列齊特組 D:低劑量白藜蘆醇組 E:高劑量白藜蘆醇組

表3 各組大鼠治療前后不同晶狀體混濁程度占比比較[n(%)]Table 3 Comparison of percentage of different grades of rat lens opacity before and after treatment among various groups [n(%)]組別樣本量治療前治療后0期Ⅰ期Ⅱ期0期Ⅰ期Ⅱ期空白對(duì)照組1010(100.00)0(0.00)0(0.00)10(100.00)0(0.00)0(0.00)模型組90(0.00)6(66.67)3(33.33)0(0.00)a6(66.67)a3(33.33)a格列齊特組90(0.00)7(77.78)2(22.22)7(77.78)b2(22.22)be0(0.00)be低劑量白藜蘆醇組90(0.00)7(77.78)2(22.22)2(22.22)bc4(44.44)bce3(33.33)bce高劑量白藜蘆醇組90(0.00)6(66.67)3(33.33)6(66.67)bd3(33.33)bde0(0.00)bdeH值0.2337.514P值0.628<0.001 注:與各自空白對(duì)照組比較,aP<0.05;與各自模型組比較,bP<0.05;與各自格列齊特組比較,cP<0.05;與各自低劑量白藜蘆醇組比較,dP<0.05;與本組治療前比較,eP<0.05(Kruskal-Wallis H檢驗(yàn),Mann-Whitney U檢驗(yàn)) Note:Compared with respective blank control group,aP<0.05;compared with respective model group,bP<0.05;compared with respective gliclazide group,cP<0.05;compared with respective low-dose resveratrol group,dP<0.05;compared with before treatment within groups,eP<0.05 (Kruskal-Wallis H test,Mann-Whitney U test)

2.5 各組大鼠LECs凋亡率比較

空白對(duì)照組鮮見凋亡細(xì)胞。模型組凋亡細(xì)胞增多,多見棕褐色凋亡細(xì)胞核。與模型組比較,格列齊特組、低劑量白藜蘆醇組、高劑量白藜蘆醇組凋亡細(xì)胞逐漸減少,其中格列齊特組、高劑量白藜蘆醇組減少更明顯?？瞻讓?duì)照組、模型組、格列齊特組、低劑量白藜蘆醇組、高劑量白藜蘆醇組大鼠LECs凋亡率總體比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=711.151,P<0.001)。與模型組比較,空白對(duì)照組、格列齊特組、低劑量白藜蘆醇組、高劑量白藜蘆醇組LECs凋亡率降低,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.05);與格列齊特組比較,低劑量白藜蘆醇組LECs凋亡率升高,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);與低劑量白藜蘆醇組比較,高劑量白藜蘆醇組LECs凋亡降低,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);格列齊特組與高劑量白藜蘆醇組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)(圖3,表4)。

圖3 各組大鼠LECs凋亡情況比較(TUNEL ×200,標(biāo)尺=50 μm) 空白對(duì)照組鮮見凋亡細(xì)胞,LECs核多呈藍(lán)色;模型組凋亡細(xì)胞增多,凋亡細(xì)胞核呈棕褐色;格列齊特組、高劑量白藜蘆醇組凋亡細(xì)胞數(shù)較模型組明顯減少,且少于低劑量白藜蘆醇組 A:空白對(duì)照組 B:模型組 C:格列齊特組 D:低劑量白藜蘆醇組 E:高劑量白藜蘆醇組

表4 各組大鼠LECs凋亡率比較(x±s,%)Table 4 Comparison of apoptosis rate of rat LECs among various groups (x±s,%)組別樣本量細(xì)胞凋亡率空白對(duì)照組100.18±0.14模型組97.25±0.17a格列齊特組94.11±0.17ab低劑量白藜蘆醇組96.02±0.16abc高劑量白藜蘆醇組94.13±0.19abdF值711.151P值<0.001 注:與空白對(duì)照組比較,aP<0.05;與模型組比較,bP<0.05;與格列齊特組比較,cP<0.05;與低劑量白藜蘆醇組比較,dP<0.05(單因素方差分析,LSD-t檢驗(yàn)) LECs:晶狀體上皮細(xì)胞 Note:Compared with blank control group,aP<0.05;compared with model group,bP<0.05;compared with gliclazide group,cP<0.05;compared with low-dose resveratrol group,dP<0.05 (One-way ANOVA,LSD-t test) LECs:lens epithelial cells

2.6 各組大鼠晶狀體Nrf2、HO-1蛋白相對(duì)表達(dá)量比較

空白對(duì)照組Nrf2、HO-1蛋白條帶強(qiáng)度較高;與空白對(duì)照組比較,模型組Nrf2、HO-1蛋白條帶強(qiáng)度明顯降低;與模型組比較,格列齊特組、低劑量白藜蘆醇組、高劑量白藜蘆醇組Nrf2、HO-1蛋白條帶強(qiáng)度有所回升,其中格列齊特組、高劑量白藜蘆醇組Nrf2、HO-1蛋白條帶強(qiáng)度回升更明顯(圖4)?？瞻讓?duì)照組、模型組、格列齊特組、低劑量白藜蘆醇組、高劑量白藜蘆醇組大鼠Nrf2、HO-1蛋白相對(duì)表達(dá)量總體比較,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=39.325、62.354,均P<0.001);其中與模型組比較,空白對(duì)照組、格列齊特組、低劑量白藜蘆醇組、高劑量白藜蘆醇組Nrf2、HO-1蛋白相對(duì)表達(dá)量升高,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.05);與格列齊特組比較,低劑量白藜蘆醇組Nrf2、HO-1蛋白相對(duì)表達(dá)量降低,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.05);與低劑量白藜蘆醇組比較,高劑量白藜蘆醇組Nrf2、HO-1蛋白相對(duì)表達(dá)量升高,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.05);格列齊特組與高劑量白藜蘆醇組比較,差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)(表5)。

圖4 各組Nrf2、HO-1蛋白表達(dá)電泳圖 1:空白對(duì)照組;2:模型組;3:格列齊特組;4:低劑量白藜蘆醇組;5:高劑量白藜蘆醇組 Nrf:核因子E2相關(guān)因子;HO:血紅素氧合酶;β-actin:β-肌動(dòng)蛋白

表5 各組大鼠晶狀體Nrf2、HO-1蛋白相對(duì)表達(dá)量比較(x±s)Table 5 Comparison of relative expressions of Nrf2 and HO-1 proteins in rat lens among various groups (x±s)組別樣本量Nrf2HO-1空白對(duì)照組100.78±0.110.72±0.09模型組90.21±0.10a0.18±0.08a格列齊特組90.38±0.10ab0.35±0.08ab低劑量白藜蘆醇組90.30±0.11abc0.28±0.07abc高劑量白藜蘆醇組90.39±0.12abcd0.36±0.08abcdF值39.32562.354P值<0.001<0.001 注:與空白對(duì)照組比較,aP<0.05;與模型組比較,bP<0.05;與格列齊特組比較,cP<0.05;與低劑量白藜蘆醇組比較,dP<0.05(單因素方差分析,LSD-t檢驗(yàn)) Nrf:核因子E2相關(guān)因子;HO:血紅素氧合酶 Note:Compared with blank control group,aP<0.05;compared with model group,bP<0.05;compared with gliclazide groups,cP<0.05;compared with low-dose resveratrol group,dP<0.05 (One-way ANOVA,LSD-t test) Nrf:nuclear factor E2-related factor;HO:heme oxygennase

3 討論

臨床不同分期糖尿病性白內(nèi)障的治療方法存在差異,其中早中期以藥物治療為主,晚期則需行手術(shù)治療。雖然近年來白內(nèi)障手術(shù)取得一定進(jìn)展,但部分糖尿病性白內(nèi)障患者視力恢復(fù)效果欠佳,且手術(shù)可能引發(fā)虹膜粘連、黃斑囊樣水腫等并發(fā)癥,故需加強(qiáng)糖尿病性白內(nèi)障的早期防治,探尋可延緩或控制早中期糖尿病性白內(nèi)障病情的方法。近年來,糖尿病性白內(nèi)障與氧化應(yīng)激損傷的關(guān)系逐漸成為眼科臨床研究熱點(diǎn),抗氧化劑的作用逐漸受到關(guān)注[9]。

白藜蘆醇是一種天然抗氧化劑,主要提取自白藜蘆,屬于含多羥基芪類結(jié)構(gòu)的非黃酮類多酚化合物,具有清除氧自由基、抗氧化、抗炎、抗凋亡等作用[10]。研究表明,白藜蘆醇可通過上調(diào)內(nèi)皮細(xì)胞一氧化氮合酶表達(dá),刺激其活性,增加一氧化氮生成,且能抑制內(nèi)皮素-1合成,減輕氧化應(yīng)激反應(yīng),在糖尿病治療中有一定作用[11]。相關(guān)報(bào)道還顯示,白藜蘆醇可控制糖尿病動(dòng)物的血糖水平,改善全身葡萄糖代謝[12]。格列齊特是一種常見磺脲類降糖藥物,其給藥后在體內(nèi)的釋放曲線與糖尿病患者血糖晝夜周期性波動(dòng)匹配,降糖作用溫和,且可抑制血小板聚集,減輕氧化應(yīng)激反應(yīng),緩解糖尿病并發(fā)癥,故本研究以格列齊特作為對(duì)照藥物。本研究發(fā)現(xiàn),高劑量白藜蘆醇治療后模型鼠空腹血糖、空腹胰島素及SOD1、SOD2、SOD3、GPX1水平降低,晶狀體混濁程度減輕,細(xì)胞及亞細(xì)胞器異常情況更輕微,與格列齊特組效果相符,這說明高劑量白藜蘆醇可控制糖尿病模型大鼠血糖,減輕氧化應(yīng)激反應(yīng)和晶狀體混濁程度,具有與格列齊特相似的效果。LECs為晶狀體代謝最活躍部位,在維持晶狀體透明度中作用顯著。有研究證實(shí),LECs凋亡是除先天性白內(nèi)障外所有白內(nèi)障發(fā)病的細(xì)胞學(xué)基礎(chǔ)[13]。本研究發(fā)現(xiàn),高劑量白藜蘆醇應(yīng)用后大鼠LECs凋亡率降低,與格列齊特組相一致,這說明高劑量白藜蘆醇可抑制LECs凋亡,獲得與格列齊特相似效果。張劍等[14]的研究也證實(shí),白藜蘆醇可抑制糖尿病性白內(nèi)障大鼠脂質(zhì)過氧化反應(yīng),減輕氧化應(yīng)激損傷,延緩晶狀體病理改變發(fā)生,與本研究結(jié)果一致。

機(jī)體出現(xiàn)氧化應(yīng)激損傷時(shí)可形成一系列復(fù)雜的氧化應(yīng)激應(yīng)答系統(tǒng)。Nrf2是機(jī)體各器官細(xì)胞抗氧化損傷關(guān)鍵因子之一,可誘導(dǎo)抗氧化保護(hù)蛋白酶表達(dá),調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)氧化還原反應(yīng)[15]。Nrf2受外界氧化應(yīng)激因子刺激后,可通過與抗氧化反應(yīng)元件ARE作用,促進(jìn)抗氧化蛋白HO-1表達(dá),在2型糖尿病治療中發(fā)揮重要作用[16]。HO-1能促使血紅蛋白分子進(jìn)一步降解成等摩爾的自由鐵、膽綠素、一氧化氮,從而減輕氧化應(yīng)激損傷,抑制細(xì)胞凋亡[17]。相關(guān)報(bào)道也顯示,調(diào)節(jié)Nrf2/HO-1信號(hào)通路可抑制糖尿病小鼠肝臟氧化應(yīng)激損傷[18]。還有研究發(fā)現(xiàn),白藜蘆醇能通過對(duì)細(xì)胞內(nèi)Nrf2表達(dá)進(jìn)行調(diào)節(jié),保護(hù)糖尿病所致細(xì)胞損傷,減輕氧化應(yīng)激反應(yīng)[19]。以上結(jié)果表明,誘導(dǎo)Nrf2、HO-1表達(dá)可減輕糖尿病氧化應(yīng)激反應(yīng)。本研究結(jié)果顯示,經(jīng)白藜蘆醇處理后大鼠Nrf2、HO-1表達(dá)均上調(diào),且呈劑量依賴性,提示高劑量白藜蘆醇減輕早中期糖尿病性白內(nèi)障大鼠氧化應(yīng)激反應(yīng)的作用可能是通過調(diào)節(jié)Nrf2/HO-1信號(hào)通路實(shí)現(xiàn)的。

綜上所述,本研究表明白藜蘆醇可減輕糖尿病大鼠晶狀體混濁,其作用機(jī)制可能與調(diào)節(jié)Nrf2/HO-1信號(hào)通路,發(fā)揮抗氧化應(yīng)激作用有關(guān),但是否存在其他調(diào)控機(jī)制仍有待進(jìn)一步分析。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突

作者貢獻(xiàn)聲明葛曉芳:設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)、實(shí)施研究、分析/解釋數(shù)據(jù)、文獻(xiàn)檢索及整理、論文撰寫及修改;朱大強(qiáng)、羅納麗:設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)、文獻(xiàn)檢索及整理;劉亞東:設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)、對(duì)文章知識(shí)性內(nèi)容的審閱和智力性內(nèi)容的修改及定稿