不同品種豬PVALB 基因多態(tài)性及其在肌肉組織的表達(dá)差異分析

韓雨晴，薄素雪，嚴(yán)飛飛，段夢琪，強(qiáng)巴央宗，商 鵬

（1.西藏農(nóng)牧學(xué)院 動物科學(xué)學(xué)院，西藏 林芝 860000；2.西藏特色農(nóng)牧資源研發(fā)省部共建協(xié)同創(chuàng)新中心，西藏 林芝 860000）

骨骼肌的生長發(fā)育對于畜禽生長發(fā)育有著重要的影響。骨骼肌是機(jī)體重要的運(yùn)動和能量代謝組織，對于維持機(jī)體代謝平衡和穩(wěn)態(tài)起到重要作用[1]。骨骼肌是一種高度異質(zhì)的組織，主要是由骨骼肌細(xì)胞、周圍結(jié)締組織以及神經(jīng)組織構(gòu)成[2]。在哺乳動物中骨骼肌約占機(jī)體質(zhì)量的三分之一，是機(jī)體新陳代謝、運(yùn)動及調(diào)節(jié)體溫的重要組織[3]。

小白蛋白（Parvalbumin，PVALB）是一種分子質(zhì)量為0～12 ku 的球狀α-螺旋小蛋白[4]，屬于EFHand 家族，是一種鈣轉(zhuǎn)運(yùn)體/穿梭蛋白[5]，1973 年，PVALB首次從鯉魚肌肉中分離出來[4]。PVALB 蛋白主要調(diào)控肌肉松弛的過程，在大腦、骨骼肌、心肌、甲狀旁腺和腎臟中表達(dá)量顯著高于其他器官組織[6‐7]。EF-Hand 家族蛋白質(zhì)的特征是具有保守的螺旋-環(huán)-螺旋結(jié)構(gòu)單元，該類蛋白質(zhì)由Ca2+螯合環(huán)橋接的α-螺旋組成[8]。EF-Hand家族蛋白質(zhì)參與許多關(guān)鍵細(xì)胞過程的調(diào)節(jié)，包括基因轉(zhuǎn)錄、蛋白質(zhì)磷酸化、核苷酸代謝和離子轉(zhuǎn)運(yùn)[9]。而PVALB 存在于快速收縮和快速松弛的骨骼肌纖維中，并且與兩棲動物和魚類的肌肉松弛速度呈正相關(guān)[10‐11]。AYUSO等[12]采用Transcriptome 技術(shù)對純種伊比利亞豬和杜洛克雜交豬（IBDU）進(jìn)行差異表達(dá)基因篩選，發(fā)現(xiàn)PVALB基因與豬的骨骼肌生長發(fā)育相關(guān)，并對豬生長性狀產(chǎn)生明顯影響。

藏豬是中國高原地區(qū)特有的小型地方品種，耐低氧，抗高寒，遺傳多樣性豐富，肉質(zhì)風(fēng)味獨(dú)特[13]；而大約克豬是著名的瘦肉型豬種，具有生長速度快、飼料利用率高和瘦肉率高等特點(diǎn)[14]。鑒于此，對藏豬和大約克豬的PVALB基因進(jìn)行單核苷酸多態(tài)性（SNP）及組織表達(dá)差異分析，探究PVALB基因?qū)Σ刎i肌肉組織生長發(fā)育的影響，旨在為藏豬的分子育種研究提供參考。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料

采集西藏農(nóng)牧學(xué)院實(shí)習(xí)牧場[西藏林芝地區(qū)（海拔約2 900 m）]飼養(yǎng)的180 日齡藏豬（TP）和林芝宇高生態(tài)農(nóng)業(yè)開發(fā)有限公司養(yǎng)殖基地[西藏林芝地區(qū)（海拔約2 900 m）]飼養(yǎng)的180 日齡大約克豬（YP）耳組織進(jìn)行基因組DNA 的提取。共采集66 份（藏豬36 頭，大約克豬30 頭）耳組織樣品，放入裝有75%乙醇的離心管中，于-20 ℃冰箱保存。選取同期飼養(yǎng)至30 日齡、90 日齡及180 日齡且生長情況相近的藏豬、大約克豬各8頭進(jìn)行屠宰，分別取其腿肌和背最長肌組織，剪黃豆大小放入裝有RNA 保存液的凍存管中，置于液氮中快速冷凍，用于組織總RNA 的提取。

1.2 DNA、RNA的提取以及cDNA制備

豬耳組織樣品用苯酚氯仿抽提法提取總DNA，提取完成后使用RNase-Free ddH2O 溶解，再使用1%瓊脂糖凝膠電泳和Nano Drop 2000 分光光度計(jì)檢測DNA 質(zhì)量和濃度，將可用于后續(xù)試驗(yàn)的DNA于-20 ℃保存。

腿肌及背最長肌組織用RNAiso Plus 試劑法提取組織RNA，提取完成后用RNase-Free ddH2O 溶解，再使用1%瓊脂糖凝膠電泳和Nano Drop 2000分光光度計(jì)檢測RNA 質(zhì)量和濃度，所提取好的RNA于-80 ℃保存。

cDNA 制備根據(jù)快速反轉(zhuǎn)錄試劑盒（KR180123）說明書進(jìn)行。gDNA 去除反應(yīng)體系：5×gDNA Buffer 2 μL，總RNA 根據(jù)比例計(jì)算出用量，RNase-Free ddH2O 補(bǔ)足至10 μL。反轉(zhuǎn)錄體系：上述gDNA 去除及應(yīng)體 系10 μL、10×Fast RT Buffer 2μL、RT Enzyme Mix 1 μL、FQ-RT Primer Mix 2μL，RNase-Free ddH2O 補(bǔ)足至10 μL。反轉(zhuǎn)錄結(jié)束后-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 SNP篩選引物設(shè)計(jì)與合成

登錄GenBank 網(wǎng)站（htttp://www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank），下載豬PVALB基因（登錄號：NC_010447.5）起始密碼子上游2 000 bp 區(qū)域的DNA 序列，采用Primer Premier 5.0 軟件設(shè)計(jì)5′UTR 的引物（表1），引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。引物合成后用RNase-Free ddH2O 溶解，于4 ℃保存。

表1 PVALB基因5′UTR SNP篩選引物信息Tab.1 The primer information for SNP screening of PVALB gene 5′UTR

1.4 PVALB基因PCR擴(kuò)增

以提取的藏豬和大約克豬耳組織DNA 為模板，擴(kuò)增PVALB基因的5′UTR 區(qū)域。PCR 反應(yīng)體系：2×TaqPCR Master Mix Ⅱ10 μL、RNase-Free ddH2O 8μL、上/下游引物0.5μL、DNA 模板1μL，共20μL。PCR 反應(yīng)程序：95 ℃預(yù)變性5 min；95 ℃變性30 s，59.6 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，進(jìn)行38 個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸4 min，4 ℃保存。

最后將PCR 產(chǎn)物使用1%瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳，經(jīng)檢驗(yàn)合格后的PCR 產(chǎn)物送至生工生物工程（上海）股份有限公司測序。

1.5 SNP基因頻率、基因型頻率與轉(zhuǎn)錄因子預(yù)測

混池測序分析基因的單核苷酸多態(tài)性，篩選出SNP 突變位點(diǎn)后，根據(jù)篩選的突變位點(diǎn)擴(kuò)大個(gè)體進(jìn)行個(gè)體測序。使用Excel 分別計(jì)算各個(gè)SNP 位點(diǎn)的基因型頻率以及等位基因頻率。用JASPAR 在線網(wǎng)站（htttp://jaspar.binf.ku.dk/）進(jìn)行SNP 位點(diǎn)突變前后轉(zhuǎn)錄因子預(yù)測。

1.6 實(shí)時(shí)熒光定量PCR（RT-qPCR）引物設(shè)計(jì)與合成

登錄GenBank 網(wǎng)站（htttp：//www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank）下載豬PVALB基因的mRNA 序列，選用β-actin作為內(nèi)參基因，利用Primer Premier 5.0 軟件設(shè)計(jì)引物（表2），由生工生物工程（上海）有限公司合成。引物合成后用RNase-Free ddH2O 溶解，于4 ℃保存。

表2 PVALB基因?qū)崟r(shí)熒光定量PCR引物信息Tab.2 The primer information for real?time fluorescence quantitative PCR of PVALB gene

1.7 實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測

選取檢驗(yàn)合格的PVALB基因cDNA 為模板，選取β-actin基因?yàn)閮?nèi)參基因，每個(gè)個(gè)體樣品各設(shè)置3個(gè)重復(fù)。采用20 μL 的反應(yīng)體系對PVALB和β-actin進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR 擴(kuò)增。采用Livak 法計(jì)算PVALB基因在組織中的相對表達(dá)量。

1.8 數(shù)據(jù)處理

運(yùn)用Excel 軟件計(jì)算各個(gè)突變位點(diǎn)的基因頻率和基因型頻率，使用卡方檢驗(yàn)對PVALB基因的基因型頻率和基因頻率進(jìn)行差異顯著性分析；利用Sigma plot 軟件對PVALB基因相對表達(dá)量進(jìn)行雙因素（品種和組織）分析，以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差作圖，并利用SPSS 25.0 軟件對PVALB基因表達(dá)量進(jìn)行差異顯著性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 藏豬和大約克豬PVALB基因PCR擴(kuò)增結(jié)果

提取藏豬和大約克豬的DNA、RNA 條帶清晰，無雜帶、拖尾情況，同時(shí)無蛋白質(zhì)污染，使用Nano Drop 2000 檢測DNA、RNA 質(zhì)量，OD260/280和OD260/230值均在1.8～2.0，可滿足后續(xù)要求。以提取的DNA為模板進(jìn)行PVALB基因的5′UTR 擴(kuò)增，可見清晰的目的條帶，大小為840 bp（圖1），與目的條帶大小相符。

圖1 藏豬和大約克豬PVALB基因PCR擴(kuò)增結(jié)果Fig.1 PCR amplification results of PVALB gene fromTibetan and Yorkshire pigs

2.2 藏豬和大約克豬PVALB基因SNP篩選與轉(zhuǎn)錄因子預(yù)測

通過測序比對（圖2），發(fā)現(xiàn)PVALB基因5′UTR共有2個(gè)突變位點(diǎn)，分別標(biāo)記為G1659C、C1269T。

圖2 藏豬和大約克豬PVALB基因SNP篩選Fig.2 SNP screening of PVALB gene in Tibetan and Yorkshire pigs

基因型頻率、基因頻率及卡方檢驗(yàn)結(jié)果如表3所示。在藏豬中，突變位點(diǎn)G1659C 存在GG、GC、CC 型，C 基因?yàn)閮?yōu)勢等位基因；在大約克豬中存在GG、GC、CC 型，G 基因?yàn)閮?yōu)勢等位基因。在突變位點(diǎn)C1269T 中，藏豬和大約克豬均存在CC、CT、TT型，C基因?yàn)閮?yōu)勢等位基因。

表3 藏豬和大約克豬PVALB基因SNP位點(diǎn)基因型頻率及卡方檢驗(yàn)Tab.3 Genotypic frequency and chi?square test of SNP locus of PVALB gene in Tibetan and Yorkshire pigs

PVALB基因2 個(gè)突變位點(diǎn)（G1659C 和C1269T）均符合哈迪-溫伯格（Hardy-Weinberg）平衡（P? 0.05）。在藏豬和大約克豬中，G1659C（χ2=6.667，P=0.0357）和C1269T（χ2=7.862，P=0.020）突變位點(diǎn)均存在顯著差異（P?0.05）。

本試驗(yàn)對PVALB基因的SNP 位點(diǎn)進(jìn)行轉(zhuǎn)錄因子預(yù)測，PVALB基因G1659C 位點(diǎn)突變后NRF2 轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)消失，并出現(xiàn)了新的轉(zhuǎn)錄因子NR1D1結(jié)合位點(diǎn)。C1269T 位點(diǎn)突變后NCOR1 轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)消失并出現(xiàn)了新的轉(zhuǎn)錄因子OTX2結(jié)合位點(diǎn)。

2.3 藏豬和大約克豬PVALB基因在不同肌肉組織中的相對表達(dá)量

利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR 技術(shù)對PVALB基因在藏豬和大約克豬腿肌、背最長肌中的表達(dá)水平進(jìn)行檢測，結(jié)果如圖3 所示。從圖3 可以看出，在腿肌中90 日齡時(shí)PVALB基因表達(dá)量最高，30、180 日齡次之；在背最長肌組織中180 日齡時(shí)PVALB基因表達(dá)量最高，30、90日齡次之。在腿肌和背最長肌這2個(gè)組織中，PVALB基因的表達(dá)量大約克豬顯著（P<0.05）或極顯著（P<0.01）高于藏豬。

圖3 藏豬和大約克豬PVALB基因在腿?。╝）和背最長?。╞）中的表達(dá)量Fig.3 Expression levels of PVALB gene of Tibetan and Yorkshire pigs in leg muscle（a）and longissimus dorsi muscle（b）

3 結(jié)論與討論

PVALB 是肌肉組織生長發(fā)育、調(diào)節(jié)機(jī)體代謝平衡的重要蛋白質(zhì)，是關(guān)鍵細(xì)胞過程的重要成分[15]。LIAN 等[16]研究結(jié)果表明，Ca2+通過決定鈣蛋白酶活性在肌肉生長中起關(guān)鍵作用，并通過減少Ca2+與原肌球蛋白-肌鈣蛋白復(fù)合物的結(jié)合來促進(jìn)肌肉的生長發(fā)育。本研究在PVALB基因起始密碼子上游2 000 bp 區(qū)域中發(fā)現(xiàn)突變位點(diǎn)G1659C 和C1269T，2個(gè)突變位點(diǎn)基因型頻率和基因頻率在藏豬和大約克豬中存在顯著差異。通過對2 個(gè)突變位點(diǎn)進(jìn)行轉(zhuǎn)錄因子功能預(yù)測，發(fā)現(xiàn)新增的轉(zhuǎn)錄因子大多與組織代謝、生長發(fā)育、細(xì)胞分化密切相關(guān)，如轉(zhuǎn)錄因子NR1D1 是核受體超家族中的一員，該基因在哺乳動物的骨骼肌、大腦和肝中表達(dá)，參與肌肉生長和細(xì)胞分化等生理過程[17‐19]；轉(zhuǎn)錄因子OTX2是一種含有同源結(jié)構(gòu)域的轉(zhuǎn)錄因子，參與細(xì)胞增殖、分化、凋亡等過程，在YUE 等[20]的研究中，利用RNA-seq 技術(shù)證實(shí)OTX2 調(diào)控豬胚胎肌肉生長發(fā)育過程。綜上，G1659C 和C1269T 位點(diǎn)可能與豬肌肉的生長發(fā)育相關(guān)。

本研究通過對藏豬和大約克豬的背最長肌和腿肌進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR 檢測，發(fā)現(xiàn)PVALB基因在90 日齡腿肌中的表達(dá)量最高，PVALB基因mRNA表達(dá)量在藏豬和大約克豬中均位于最高水平，該時(shí)間節(jié)點(diǎn)屬于豬的快速生長階段，說明PVALB基因在促進(jìn)豬肌肉快速生長發(fā)育中起到重要作用；在背最長肌中，PVALB基因表達(dá)量在整個(gè)生長發(fā)育階段中處于上升趨勢，與機(jī)體生長發(fā)育規(guī)律趨勢一致，且在180 日齡處于最高水平，說明PVALB基因?qū)Σ刎i和大約克豬肌肉生長發(fā)育具有正調(diào)控作用。且有研究顯示，禁食30 d 處理后，魚肌肉中PVALB基因的表達(dá)量降低，表明該基因與肌肉的生長發(fā)育呈正相關(guān)[21]。由此推測PVALB基因?yàn)樨i生長發(fā)育關(guān)鍵上調(diào)基因。

綜上，本研究發(fā)現(xiàn)PVALB基因5′UTR 區(qū)域存在2 個(gè)SNP 位點(diǎn)G1659C 和C1269T，該位點(diǎn)突變前后消失和新增的轉(zhuǎn)錄因子均與肌肉生長發(fā)育相關(guān)，PVALB基因在不同日齡大約克豬背最長肌和腿肌中mRNA 相對表達(dá)量均顯著或極顯著高于藏豬，結(jié)合SNP結(jié)果和RT-qPCR 結(jié)果推測，PVALB基因有促進(jìn)豬肌肉生長發(fā)育的功能，可作為骨骼肌早期發(fā)育和肉質(zhì)性狀研究新的候選基因，為后續(xù)闡明其在豬生長發(fā)育中的分子作用機(jī)制提供了理論依據(jù)。