鵝掌瘋醋劑對(duì)抗白色念珠菌及其早期生物膜的體外實(shí)驗(yàn)研究

林 琳,劉濤峰

(1.安徽中醫(yī)藥大學(xué)研究生院,安徽 合肥 230012;2.安徽中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院皮膚科,安徽 合肥 230031)

鵝掌風(fēng),好發(fā)于手掌,因風(fēng)毒或濕邪侵于皮膚所致,反復(fù)發(fā)作后皮膚增厚,枯槁干裂,宛如鵝掌[1],西醫(yī)稱(chēng)為“手癬”;若發(fā)于足部則稱(chēng)為“足癬”,中醫(yī)稱(chēng)為“腳濕氣”。該病主要是由紅色毛癬菌、須癬毛癬菌等癬菌引起,但近年來(lái)白色念珠菌及其他酵母樣真菌的感染率逐漸上升[2]。該病常伴瘙癢,搔抓后加劇,西醫(yī)常用唑類(lèi)藥物治療,效果顯著,但容易復(fù)發(fā),嚴(yán)重影響患者身心健康和正常生活。

鵝掌瘋醋劑,又名鵝掌風(fēng)醋浸劑,是安徽中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院院內(nèi)制劑(注冊(cè)號(hào):Z20050075),臨床應(yīng)用已近30年,是皮膚科常用于治療手足癬的外用抗真菌藥。研究[3]表明,鵝掌瘋醋劑對(duì)多種細(xì)菌及真菌具有良好的抑制作用,但其機(jī)制不詳。本研究選用白色念珠菌為實(shí)驗(yàn)對(duì)象,探討鵝掌瘋醋劑在體外對(duì)白色念珠菌及早期生物膜的抑制作用及其機(jī)制,為鵝掌瘋醋劑在臨床上治療真菌性疾病提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料

1.1 菌株 白色念珠菌SC5314由安徽中醫(yī)藥大學(xué)中西醫(yī)結(jié)合學(xué)院汪長(zhǎng)中教授惠贈(zèng)。

1.2 藥物與試劑 鵝掌瘋醋劑由安徽中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院制劑中心提供。酵母浸出粉胨葡萄糖(yeast extract peptone dextrose medium, YPD)培養(yǎng)基和沙氏葡萄糖液體(Sabourauddextrose broth, SDB)培養(yǎng)基均由杭州百思生物技術(shù)有限公司生產(chǎn)。瓊脂粉:北京鴻潤(rùn)寶順科技有限公司;磷酸鹽緩沖溶液(phosphate buffer saline, PBS):太原市羅塞塔石生物技術(shù)有限公司;戊二醛:上海遠(yuǎn)慕生物科技有限公司;鋨酸:上海哈靈生物科技有限公司;醋酸雙氧鈾:西安鼎天化工有限公司;檸檬酸鉛:德國(guó)默克化工技術(shù)有限公司;營(yíng)養(yǎng)肉湯:中山市百微生物技術(shù)有限公司;甘露醇:天津市登峰化學(xué)試劑廠;KH2PO4:國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司;細(xì)胞計(jì)數(shù)試劑盒-8(cell counting kit-8, CCK-8):福州飛凈生物科技有限公司。

沙氏瓊脂(sabourauds, SDA)培養(yǎng)基:取配好的SDB培養(yǎng)基1 000 mL,加入瓊脂粉20 g,高壓滅菌后倒板備用。

Spider固體培養(yǎng)基:稱(chēng)取營(yíng)養(yǎng)肉湯10 g、甘露醇10 g、2 g的KH2PO4、瓊脂粉20 g,溶解于少量的蒸餾水中,并調(diào)節(jié)pH值為7后定容至1 000 mL,高壓滅菌后置于4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 儀器 高速離心機(jī)(型號(hào)JW-3021HR):安徽嘉文儀器裝備有限公司;紫外分光光度計(jì)(型號(hào)photoLab 7600):德國(guó)WTW;光學(xué)顯微鏡(型號(hào)IX-71):日本奧林巴斯有限公司;多功能酶標(biāo)儀:美國(guó)賽默飛世爾科技公司;掃描電子顯微鏡(型號(hào)GeminiSEM 500):德國(guó)蔡司公司;透射電子顯微鏡(型號(hào)JEM-2100F):日本電子株式會(huì)社。

2 方法

2.1 白色念珠菌菌懸液的配制 挑取白色念珠菌于SDA培養(yǎng)基中活化后,取較大菌落接種到SDB培養(yǎng)基中,置于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中,120 r/min震蕩培養(yǎng)24 h。用血細(xì)胞計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)確定菌懸液濃度范圍,并調(diào)整孢子菌懸液的濃度至(1～5)×106CFU/mL。

2.2 微量稀釋法測(cè)量鵝掌瘋醋劑對(duì)白色念珠菌的最小抑菌濃度(minimum inhibitory concentration, MIC) 參照美國(guó)臨床和實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)協(xié)會(huì)標(biāo)準(zhǔn)[4],采用微量稀釋法測(cè)量鵝掌瘋醋劑對(duì)白色念珠菌的MIC,對(duì)應(yīng)稀釋倍數(shù)分別為原液濃度的1/2、1/4、1/8、1/16、1/32、1/64、1/128、1/256、1/512、1/1 024。

2.3 細(xì)胞外紫外物質(zhì)吸收的變化 實(shí)驗(yàn)組取制備好的白色念珠菌菌懸液3 mL與鵝掌瘋醋劑(MIC)3 mL混合,對(duì)照組取白色念珠菌菌懸液3 mL不作處理,培養(yǎng)10 min后離心,取上清液,立即用紫外分光光度計(jì)測(cè)定波長(zhǎng)為260 nm下的吸光度值[5]。

2.4 掃描電子顯微鏡觀察白色念珠菌表面結(jié)構(gòu) 實(shí)驗(yàn)組取制備好的白色念珠菌菌懸液3 mL與鵝掌瘋醋劑(MIC)3 mL混合,對(duì)照組取白色念珠菌菌懸液3 mL不作處理,培養(yǎng)10 min后離心,洗滌3次,棄上清液,用2.5%戊二醛固定過(guò)夜后洗滌3次,乙醇梯度脫水,鍍金后通過(guò)掃描電子顯微鏡觀察拍照[6]。

2.5 透射電子顯微鏡觀察白色念珠菌超微結(jié)構(gòu) 實(shí)驗(yàn)組取制備好的白色念珠菌菌懸液3 mL與鵝掌瘋醋劑(MIC)3 mL混合,對(duì)照組白色念珠菌菌懸液3 mL不作處理,培養(yǎng)10 min后離心洗滌3次,棄上清液,用2.5%戊二醛固定過(guò)夜后洗滌3次,并用1%鋨酸固定2 h后洗滌3次,乙醇梯度脫水,環(huán)氧樹(shù)脂包埋切片,以鈾鉛雙染色在透射電子顯微鏡下觀察拍照[7]。

2.6 CCK-8試驗(yàn)測(cè)定白色念珠菌生物被膜形成早期黏附性 取100 μL制備好的菌懸液接種于96孔板中,37 ℃培養(yǎng),分別培養(yǎng)1、2、3、4 h后吸棄培養(yǎng)基及未黏附菌,PBS洗滌3次,實(shí)驗(yàn)組加入鵝掌瘋醋劑(MIC)100 μL,對(duì)照組白色念珠菌菌懸液不作處理,37 ℃培養(yǎng)24 h,在各孔中加入CCK-8溶液,避光培養(yǎng)箱37 ℃孵育2 h,450 nm處檢測(cè)吸光度值,每組設(shè)8個(gè)復(fù)孔[8-9]。

2.7 芽管形成試驗(yàn)觀察白色念珠菌芽管形成的情況 實(shí)驗(yàn)組取制備好的白色念珠菌菌懸液3 mL與鵝掌瘋醋劑(MIC)3 mL混合,對(duì)照組取白色念珠菌菌懸液3 mL不作處理,培養(yǎng)10 min后,各取100 μL涂布于Spider固體培養(yǎng)基,37 ℃培養(yǎng)24 h,光學(xué)顯微鏡觀察菌絲生成情況并拍照[10]。

3 結(jié)果

3.1 鵝掌瘋醋劑對(duì)白色念珠菌的MIC 鵝掌瘋醋劑對(duì)白色念珠菌的MIC為藥物原濃度的1/16,提示其具有一定的抗真菌能力。

3.2 鵝掌瘋醋劑對(duì)白色念珠菌細(xì)胞外紫外物質(zhì)吸收的影響 對(duì)照組測(cè)得白色念珠菌細(xì)胞外的紫外吸收物質(zhì)含量為(3.727±0.002),實(shí)驗(yàn)組測(cè)得白色念珠菌細(xì)胞外的紫外吸收物質(zhì)含量為(5.155±0.011),與對(duì)照組比較,實(shí)驗(yàn)組白色念珠菌細(xì)胞外的紫外吸收物質(zhì)顯著升高(P<0.05)。

3.3 鵝掌瘋醋劑對(duì)白色念珠菌表面結(jié)構(gòu)的影響 利用掃描電子顯微鏡觀察白色念珠菌的表面結(jié)構(gòu),結(jié)果發(fā)現(xiàn),對(duì)照組白色念珠菌細(xì)胞呈現(xiàn)圓形或橢圓形,菌體飽滿,細(xì)胞表面光滑。經(jīng)過(guò)鵝掌瘋醋劑處理的白色念珠菌部分菌體細(xì)胞表面粗糙、皺縮、萎陷、細(xì)胞質(zhì)內(nèi)容物滲漏,很難發(fā)現(xiàn)形態(tài)正常的菌體細(xì)胞。見(jiàn)圖1。

注:A.對(duì)照組;B.實(shí)驗(yàn)組圖1 掃描電子顯微鏡觀察鵝掌瘋醋劑對(duì)白色念珠菌表面結(jié)構(gòu)的影響(×10 000倍)

3.4 鵝掌瘋醋劑對(duì)白色念珠菌超微結(jié)構(gòu)的影響 對(duì)照組白色念珠菌有正常完整的細(xì)胞結(jié)構(gòu),呈圓形或橢圓形,細(xì)胞壁、細(xì)胞膜光滑,層次完整清晰,細(xì)胞內(nèi)其他部分密度均勻。經(jīng)過(guò)鵝掌瘋醋劑處理的菌體損傷比較重,視野中異常的真菌居多,受到損傷細(xì)胞的細(xì)胞壁受損,呈現(xiàn)扭曲和不規(guī)則的形狀,細(xì)胞膜被破壞,細(xì)胞核破裂,細(xì)胞器溶解,細(xì)胞質(zhì)成碎渣樣。見(jiàn)圖2。

注:A.對(duì)照組;B.實(shí)驗(yàn)組圖2 透射電子顯微鏡觀察鵝掌瘋醋劑對(duì)白色念珠菌超微結(jié)構(gòu)的影響(×20 000倍)

3.5 鵝掌瘋醋劑對(duì)白色念珠菌生物被膜形成早期黏附性的影響 對(duì)照組相當(dāng)于CCK-8試驗(yàn)中的空白組,默認(rèn)其早期黏附性為0。與對(duì)照組比較,實(shí)驗(yàn)組白色念珠菌早期(1、2、3、4 h)生物膜的黏附率均明顯受到抑制(P<0.05),且與其他3個(gè)時(shí)間點(diǎn)比較,鵝掌瘋醋劑對(duì)培養(yǎng)了1 h的生物膜的抑制作用最弱。見(jiàn)圖3。

注:與1 h組比較,*P<0.05圖3 鵝掌瘋醋劑對(duì)白色念珠菌早期(1、2、3、4 h)生物膜組織表面黏附率的影響

3.6 鵝掌瘋醋劑對(duì)白色念珠菌芽管形成的影響 光學(xué)顯微鏡觀察顯示,對(duì)照組白色念珠菌為大量的酵母相細(xì)胞和菌絲相細(xì)胞,菌絲交織,密度高;實(shí)驗(yàn)組白色念珠菌大部分是酵母相細(xì)胞,僅有少量菌絲期細(xì)胞,且菌體密度明顯降低。見(jiàn)圖4。

注:A.對(duì)照組;B.實(shí)驗(yàn)組圖4 光學(xué)顯微鏡觀察鵝掌瘋醋劑對(duì)白色念珠菌芽管形成的影響(10×10倍)

4 討論

鵝掌風(fēng)名稱(chēng)首見(jiàn)于明代沈之問(wèn)《解圍元藪》[11]。中醫(yī)認(rèn)為其多因感受風(fēng)毒,凝結(jié)皮膚,氣血失養(yǎng)所致,發(fā)為風(fēng)濕毒聚證,用祛風(fēng)除濕、殺蟲(chóng)止癢治法;或久病化燥傷陰,肌膚失去陰血濡養(yǎng)而干燥、脫屑,甚則皸裂,發(fā)為血虛風(fēng)燥證[12],用養(yǎng)血潤(rùn)燥、祛風(fēng)止癢治法[13]。該病病位雖在皮膚,卻內(nèi)連臟腑,累及心、脾胃、腎,如《醫(yī)宗金鑒·外科心法要訣·鵝掌風(fēng)》所言:“此證生于掌心……余毒未盡,又兼血燥,復(fù)受風(fēng)毒,凝滯而成。”

鵝掌瘋醋劑的主要成分為土荊皮、百部、大黃、苦參、黃柏、川椒。該制劑具有清熱解毒、殺蟲(chóng)止癢、軟堅(jiān)潤(rùn)燥的功效,一般為外用,主要用于鵝掌風(fēng)的治療[14]。使用方法為將患處充分浸泡在藥液中至少10 min,10 d為1個(gè)療程。土荊皮有祛風(fēng)除濕、殺蟲(chóng)止癢之功,其有機(jī)酸、乙醇浸膏及苯浸膏對(duì)常見(jiàn)的10種致病真菌均有一定的抗菌作用[15]。百部有潤(rùn)肺下氣止咳、殺蟲(chóng)滅虱之功,現(xiàn)代藥理實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明其能抗病原微生物[16],抗寄生蟲(chóng)等。

念珠菌對(duì)抗真菌藥物的特異性靶點(diǎn)相對(duì)于其他真菌類(lèi)較少,實(shí)驗(yàn)證明目前抗真菌藥物的作用于白色念珠菌的靶點(diǎn)來(lái)說(shuō)主要有以下3個(gè)方面:抑制細(xì)胞膜成分麥角甾醇合成,為三唑類(lèi)藥物和多烯類(lèi)藥物的作用;抑制細(xì)胞壁成分β-1,3-葡聚糖合成,為棘白菌素類(lèi)藥物的作用;抑制核酸合成[17]。

正常情況下,只有直徑不超過(guò)1 nm的小分子可以通過(guò)真菌細(xì)胞壁的微孔。當(dāng)菌體結(jié)構(gòu)遭到了藥物作用的損壞,細(xì)胞通透性改變,細(xì)胞內(nèi)具有紫外吸收特性的大分子物質(zhì)也由細(xì)胞內(nèi)泄露到細(xì)胞外[18]?；ń?、土荊皮和黃連等單味中藥具有黃酮類(lèi)、生物堿類(lèi)、有機(jī)酸類(lèi)、皂苷類(lèi)和揮發(fā)油類(lèi)化合物等主要活性成分,能夠有效抑制白色念珠菌活性[19],原因可能與其能夠破壞真菌菌體的膜結(jié)構(gòu),改變菌體滲透性有關(guān)[20-21]。本研究發(fā)現(xiàn),鵝掌瘋醋劑能破壞白色念珠菌的細(xì)胞壁或細(xì)胞膜,影響菌體滲透性,使細(xì)胞內(nèi)容物漏出,導(dǎo)致白色念珠菌的死亡。

電子顯微鏡觀察顯示,鵝掌瘋醋劑對(duì)白色念珠菌的生長(zhǎng)有明顯的抑制作用,且觀察發(fā)現(xiàn)菌體的細(xì)胞壁、細(xì)胞膜破損,細(xì)胞質(zhì)產(chǎn)生凝聚,細(xì)胞核破裂,細(xì)胞器溶解,且細(xì)胞表面還有一層電子密度高的絮狀物質(zhì),可能是細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)外泄,表明鵝掌瘋醋劑可以破壞念珠菌的菌體結(jié)構(gòu)。而這種破壞菌體結(jié)構(gòu)的抗菌方式,與傳統(tǒng)的抗真菌藥物不同,故不易引起耐藥性[22]。研究[23-24]發(fā)現(xiàn),復(fù)方中藥藥方厚樸煎劑和三黃苦參湯對(duì)真菌的體外抗菌方式均可能與破壞菌體結(jié)構(gòu)有關(guān)。

念珠菌黏附宿主表面的能力是感染期間成功定殖和持久的先決條件[25]。CCK-8是一種高靈敏度、非放射性的比色法,可用于細(xì)胞增殖測(cè)定、細(xì)胞毒性測(cè)定、腫瘤藥敏試驗(yàn)等實(shí)驗(yàn),較傳統(tǒng)MTT法更有優(yōu)勢(shì)[26]。CCK-8法檢測(cè)發(fā)現(xiàn),鵝掌瘋醋劑浸泡白色念珠菌生物被膜細(xì)胞后,白色念珠菌表面黏附性明顯降低,說(shuō)明鵝掌瘋醋劑可以降低生物被膜的黏附性,從而抑制早期生物膜的形成,降低白色念珠菌對(duì)宿主的定殖能力,減少感染宿主的機(jī)會(huì)。與其他3個(gè)時(shí)間點(diǎn)比較,鵝掌瘋醋劑對(duì)培養(yǎng)了1 h的白色念珠菌早期生物膜表面黏附性抑制率較低,可能與白色念珠菌在生長(zhǎng)周期的早期生長(zhǎng)速度更快有關(guān),后期抑制率逐漸升高并趨于平穩(wěn)。

白色念珠菌的形態(tài)轉(zhuǎn)化是病原體感染宿主機(jī)制的核心,酵母相細(xì)胞參與附著和傳播,而菌絲相使念珠菌更具侵入性,能更有效地滲透和附著在宿主組織上[18],并形成成熟的生物膜以逃避宿主免疫細(xì)胞的吞噬,這對(duì)宿主感染的致病機(jī)制至關(guān)重要[27-28]。酵母相細(xì)胞黏附在宿主表面,菌絲大量生產(chǎn),并且分泌細(xì)胞外基質(zhì),最終形成結(jié)構(gòu)致密的成熟網(wǎng)狀生物膜[29]。念珠菌成熟的生物膜的形成會(huì)增加其對(duì)抗真菌藥物的耐藥性,造成了念珠菌病患者較高的死亡率,目前針對(duì)念珠菌生物膜的藥物的敏感性仍然很低[29]。本研究通過(guò)光學(xué)顯微鏡觀察到鵝掌瘋醋劑能夠抑制白色念珠菌菌絲形成,降低芽管的形成能力,抑制白色念珠菌的形態(tài)轉(zhuǎn)化,并能有效抑制早期生物被膜的生成。

綜上所述,鵝掌瘋醋劑對(duì)白色念珠菌MIC值為藥物原濃度的1/16,有一定的抗真菌能力,其作用機(jī)制可能是通過(guò)改變菌體滲透性,破壞菌體的正常結(jié)構(gòu),抑制生物被膜早期黏附性和芽管的形成而有效抑制生物被膜的生成,從而發(fā)揮抗真菌的作用。