SPRY4遺傳多態(tài)性與中國(guó)漢族人群青少年特發(fā)性脊柱側(cè)凸相關(guān)：一項(xiàng)單中心回顧性研究

吳增玉，張躍川，彭 越，吳 南，邱貴興，莊乾宇，仉建國(guó)

中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院北京協(xié)和醫(yī)院骨科，北京100730

青少年特發(fā)性脊柱側(cè)凸(adolescent idiopathic scoliosis，AIS)是一種以脊柱三維畸形為主要特征的骨科疾病，多發(fā)生于10～18歲青少年，其約占所有脊柱側(cè)凸的90%，影響1%～3%青少年的身心健康[1-2]。該病具有一定的遺傳傾向性，但具體病因未明，且存在明顯的Carter效應(yīng)，女性發(fā)生率約為男性的2～10倍，可能與多基因遺傳模式相關(guān)，男性需更大的遺傳負(fù)荷才會(huì)發(fā)病[3]。

SPRY4基因?qū)儆诳删幋a富含半胱氨酸和脯氨酸蛋白質(zhì)家族的成員之一，具有調(diào)控生長(zhǎng)發(fā)育的作用。本團(tuán)隊(duì)前期研究發(fā)現(xiàn)，AIS患者骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(mesenchymal stem cells，MSCs)中SPRY4水平顯著下調(diào)，敲低SPRY4或SPRY4表達(dá)缺失可損害MSCs向成骨細(xì)胞分化，導(dǎo)致骨骼發(fā)育異常，可能為AIS的誘發(fā)因素[4]。此外，本研究團(tuán)隊(duì)在AIS患者M(jìn)SCs中發(fā)現(xiàn)54個(gè)既往未被識(shí)別的差異性表達(dá)的微RNA(microRNA，miRNA)，其可通過多種信號(hào)通路調(diào)控MSCs分化[5]。由于SPRY4基因單核苷酸多態(tài)性(single nucleotide polymorphism，SNP)亦可影響MSCs分化，推測(cè)其可能通過與miRNA相結(jié)合，進(jìn)而發(fā)揮影響MSCs分化、促進(jìn)AIS發(fā)病的效應(yīng)。miRNA主要與3′非編碼區(qū)(3′untranslated region，3′UTR)結(jié)合[6]，此區(qū)域不僅可在調(diào)節(jié) mRNA 定位方面發(fā)揮重要作用[7]，同時(shí)是調(diào)控 mRNA 穩(wěn)定性、正確時(shí)空翻譯的重要結(jié)構(gòu)[8]，有助于揭示人類疾病和進(jìn)化的因果關(guān)系[9]。本研究針對(duì)3′UTR區(qū)域位點(diǎn)，首次探究了中國(guó)漢族人群SPRY4基因多態(tài)性與AIS的相關(guān)性，以期為AIS病因?qū)W研究提供新的證據(jù)。

1 資料與方法

1.1 研究對(duì)象

本研究為回顧性分析，研究對(duì)象為2017年12月—2021年12月北京協(xié)和醫(yī)院AIS患者及健康受試者。AIS患者納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)依據(jù)臨床表現(xiàn)及正側(cè)位X線片確診為AIS且Cobb角>20°；(2)發(fā)病年齡為10～18歲；(3)中國(guó)北方地區(qū)(黃河以北的區(qū)域，如河北省、山東省、山西省、北京市和天津市等)漢族人群。排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)合并其他原因?qū)е碌募怪危?2)影像學(xué)資料不完整；(3)合并影響骨骼發(fā)育的慢性疾病。

健康受試者納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)體檢健康，無研究相關(guān)疾??；(2)中國(guó)北方地區(qū)漢族人群；(3)按照年齡、性別與AIS患者進(jìn)行1∶1匹配。排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)全脊柱X線片、MRI等影像學(xué)資料不完整者；(2)合并影響骨骼發(fā)育的慢性疾病。

本研究已通過北京協(xié)和醫(yī)院倫理審查委員會(huì)審批(審批號(hào)：JS-3403)，并豁免患者知情同意。

1.2 研究方法

收集AIS患者的AIS分型及AIS患者與健康受試者年齡/性別信息、SPRY4基因測(cè)序結(jié)果。AIS主流的手術(shù)分型包括King分型、Lenke分型及PUMC分型，其中以PUMC分型的可信度和可重復(fù)性最佳，且適合脊柱三維矯形，其將AIS分為Ⅰ型(單彎)、Ⅱ型(雙彎)和Ⅲ型(三彎)[10]。本研究根據(jù)全脊柱X線片，記錄AIS患者的PUMC分型。

SPRY4基因檢測(cè)方法：(1)樣本收集：采集空腹外周靜脈血2 mL置于EDTA抗凝管中，-80 ℃保存?zhèn)溆谩?2)基因組提取及測(cè)序：采用酚-氯仿抽提法提取全基因組DNA，并溶于TE緩沖液?；蚪MDNA經(jīng)Nano Drop分光光度計(jì)測(cè)定純度和濃度后，采用全基因組測(cè)序方法對(duì)SPRY4基因rs3797053、rs10040443位點(diǎn)SNP進(jìn)行分型檢測(cè)，記錄各位點(diǎn)等位基因頻率、基因型、遺傳模式等，所有測(cè)序工作均由深圳華大基因科技有限公司完成。

1.3 樣本量估算

本研究為病例對(duì)照研究，以C等位基因頻率作為主要觀測(cè)指標(biāo)進(jìn)行樣本量估算。檢索國(guó)家生物技術(shù)信息中心數(shù)據(jù)庫(https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/snp/？term=)后發(fā)現(xiàn)，AIS患者rs10040443位點(diǎn)等位基因C的頻率為8.4%，而健康人群僅為5%，在檢驗(yàn)水準(zhǔn)a=0.05，把握度為90%，樣本比例為1∶1的情況下，經(jīng)計(jì)算兩組所需最低樣本均為97例。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 25.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。等位基因頻率、基因型、PUMC分型等計(jì)數(shù)資料以頻數(shù)(百分?jǐn)?shù))表示，組間比較采用卡方檢驗(yàn)或Fisher精確概率法。采用卡方檢驗(yàn)進(jìn)行Hardy Weinberg遺傳平衡檢驗(yàn)。采用多因素Logistic回歸法分析SPRY4基因rs3797053、rs10040443位點(diǎn)SNP與AIS的關(guān)聯(lián)性。以P<0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 一般臨床資料

共入選符合納入與排除標(biāo)準(zhǔn)的AIS 患者97例，健康受試者100名。健康受試者中，男性15例，女性85例；平均年齡(14.48±1.13)歲；SPRY4基因rs3797053、rs10040443位點(diǎn)均符合Hardy Weinberg遺傳平衡定律(P均>0.05)，提示各位點(diǎn)基因分布處于平衡狀態(tài)，樣本具有代表性。AIS 患者中，男性13例，女性84例；平均年齡(14.45±1.11)歲；rs10040443基因型頻率分布偏離Hardy Weinberg遺傳平衡定律，提示與疾病易感性存在關(guān)聯(lián)。

2.2 SPRY4基因rs3797053、rs10040443位點(diǎn)基因型及等位基因分布與AIS的關(guān)聯(lián)性

AIS患者rs10040443位點(diǎn)等位基因C及CC基因型頻率均高于健康受試者(P均<0.05)，rs3797053位點(diǎn)等位基因頻率及基因型分布與健康受試者均無顯著差異(P均>0.05)，見表1。

表1 AIS患者與健康受試者SPRY4基因rs3797053、rs10040443位點(diǎn)基因型及等位基因分布比較[n(%)]

進(jìn)一步采用多因素Logistic回歸分析校正性別因素后發(fā)現(xiàn)，在各種遺傳模式下，rs3797053位點(diǎn)多態(tài)性與AIS均無明顯關(guān)聯(lián)性(表2)；在共顯性、隱性及加性遺傳模式下，rs10040443位點(diǎn)多態(tài)性與AIS存在關(guān)聯(lián)性，其CC基因型可增加AIS發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)(表3)。

表2 校正性別因素后，SPRY4基因rs3797053位點(diǎn)與AIS的關(guān)聯(lián)性分析[n(%)]

表3 校正性別因素后，SPRY4基因rs10040443位點(diǎn)與AIS的關(guān)聯(lián)性分析[n(%)]

2.3 AIS患者SPRY4基因rs3797053、rs10040443位點(diǎn)基因型與性別及PUMC分型的關(guān)聯(lián)性

AIS患者中，SPRY4基因rs3797053位點(diǎn)基因型分布與性別、PUMC分型均無明顯關(guān)聯(lián)性(P均>0.05)；rs10040443位點(diǎn)基因型分布與性別亦無明顯相關(guān)(P>0.999)，但與PUMC分型具有一定關(guān)聯(lián)性(P<0.001)，CT+TT基因型患者中PUMC Ⅱ型的比例顯著高于CC基因型患者(66.67% 比0，P<0.001)，見表4。

表4 不同性別、PUMC分型AIS患者SPRY4基因rs3797053、rs10040443位點(diǎn)基因型分布比較[n(%)]

3 討論

本研究基于病例對(duì)照設(shè)計(jì)，首次探究了中國(guó)北方漢族人群SPRY4基因多態(tài)性與AIS的相關(guān)性，結(jié)果發(fā)現(xiàn)AIS患者SPRY4基因rs10040443位點(diǎn)等位基因C及CC基因型頻率均較健康受試者升高；校正性別因素后，rs10040443位點(diǎn)在共顯性、隱性及加性遺傳模式下均與AIS具有關(guān)聯(lián)性，該位點(diǎn)CC基因型與AIS發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)增加有關(guān)。在SPRY4基因多態(tài)性與性別、AIS臨床表型相關(guān)性的分析中發(fā)現(xiàn)，rs10040443位點(diǎn)基因型與PUMC分型亦存在一定關(guān)聯(lián)性，提示SPRY4基因rs10040443位點(diǎn)可能參與了AIS發(fā)病，為該病的病因?qū)W研究提供了新思路。

SPRY可通過特異性抑制成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(fibroblast growth factor，F(xiàn)GF)受體、表皮生長(zhǎng)因子(epidermal growth factor，EGF)受體和血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(vascular endothlial growth factor，VEGF)受體活性，在人類胚胎干細(xì)胞增殖與存活的調(diào)控中發(fā)揮重要作用。目前已知的SPRY家族由SPRY1、SPRY2、SPRY3及SPRY4組成[11-13]，其中SPRY1 和 SPRY2 編碼蛋白是晶狀體囊泡分離和角膜分化的必需物質(zhì)，SPRY3參與絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase，MAPK)通路的負(fù)性調(diào)控[14]。SPRY4基因位于5q31.3，由5個(gè)外顯子組成，其編碼蛋白為受體轉(zhuǎn)導(dǎo)的MAPK信號(hào)通路抑制劑，并可破壞活性單體GTP結(jié)合蛋白(GTP-rat sarcoma，GTP-RAS)的形成。研究顯示，SPRY4 是人類胚胎干細(xì)胞中表達(dá)最高的兩個(gè)Sprouty 家族成員之一[15-18]。在不同類型細(xì)胞中，SPRY4調(diào)控生長(zhǎng)因子信號(hào)的應(yīng)答效應(yīng)存在差異[19]。Li等[20]研究發(fā)現(xiàn)，SPRY4在體內(nèi)與體外對(duì)人脂肪源性間充質(zhì)干細(xì)胞(human adipose tissue derived mesenchymal stem cells，hAMSCs)的脂肪形成均有促進(jìn)作用。與之不同，沉默C57BL/6小鼠骨髓中SPRY4表達(dá)可阻斷脂肪堆積，該現(xiàn)象或可解釋AIS患者體脂率普遍較低的原因[21]。由于肌肉和脂肪含量增加分別可將脊柱側(cè)凸發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)降低20%和13%[22]，而SPRY4蛋白可調(diào)控脂肪形成，故推測(cè)其與AIS具有一定相關(guān)性。此外，成骨細(xì)胞和軟骨細(xì)胞分化功能障礙可能是AIS的促進(jìn)因素，敲低健康人群軟骨細(xì)胞中SPRY4基因可引起軟骨細(xì)胞肥大、衰老、活性降低，并促進(jìn)活性氧和細(xì)胞外基質(zhì)表達(dá)，進(jìn)而導(dǎo)致脊柱兩側(cè)軟骨生長(zhǎng)板生長(zhǎng)速度不一致，誘發(fā)AIS[23]。

既往文獻(xiàn)已證實(shí)，3′UTR區(qū)域可與miRNA相結(jié)合發(fā)揮骨骼生長(zhǎng)發(fā)育調(diào)控作用。如Song等[24]研究發(fā)現(xiàn)，rs4148941位點(diǎn)(A等位基因)轉(zhuǎn)錄物與miR-513a-5p的相互作用可能與腰椎間盤退變具有一定關(guān)聯(lián)性。FGF2的3′UTR區(qū)域中存在與中國(guó)人群骨礦物質(zhì)密度相關(guān)的位點(diǎn)，且其功能受miR-196a-3p的調(diào)節(jié)[25]。檢索文獻(xiàn)未發(fā)現(xiàn)SPRY4基因多態(tài)性與AIS關(guān)聯(lián)性的相關(guān)研究。本研究以rs3797053與rs10040443位點(diǎn)為切入點(diǎn)，首次在中國(guó)漢族人群中探究了SPRY4 基因多態(tài)性與AIS的關(guān)聯(lián)性。此兩個(gè)位點(diǎn)均位于3′UTR區(qū)域，且次要等位基因頻率均大于5%。單因素分析顯示，rs3797053位點(diǎn)等位基因頻率及基因型分布在AIS患者與健康受試者之間無顯著差異，AIS患者rs10040443位點(diǎn)等位基因C及CC基因型頻率高于健康受試者，提示rs10040443位點(diǎn)可能與AIS發(fā)病具有相關(guān)性；校正混雜因素后此種相關(guān)性仍存在，認(rèn)為rs10040443位點(diǎn)CC基因型可能增加AIS發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)。

準(zhǔn)確的AIS分型是制訂臨床治療決策的前提和基礎(chǔ)。AIS 主要包括三大分型系統(tǒng)，即King 分型、Lenke分型及PUMC分型，其中PUMC分型更適合指導(dǎo)AIS患者進(jìn)行三維矯形[26]。本研究發(fā)現(xiàn)AIS患者SPRY4基因rs10040443位點(diǎn)CC+TT基因型與PUMC Ⅱ型具有一定關(guān)聯(lián)性，CC+TT基因型的AIS患者更可能表現(xiàn)為PUMC Ⅱ型。由于AIS由多個(gè)基因調(diào)控且受多個(gè)環(huán)節(jié)、多種因素的影響，這可能從理論層面解釋了AIS患者存在不同程度畸形的原因。

本研究局限性：(1)雖然初步認(rèn)為SPRY4基因rs10040443位點(diǎn)多態(tài)性與AIS具有相關(guān)性，但目前尚缺乏足夠的分子機(jī)制研究證據(jù)，二者是否具有因果關(guān)系尚需進(jìn)一步驗(yàn)證。(2)AIS患兒在10～18歲期間，其脊柱畸形分型呈現(xiàn)為動(dòng)態(tài)演變的狀態(tài)，本研究PUMC分型僅為其中一個(gè)時(shí)間點(diǎn)的靜態(tài)影像結(jié)果，以致研究結(jié)果可能存在偏倚。(3)本文研究對(duì)象均為中國(guó)北方漢族人群，結(jié)果外推需謹(jǐn)慎。

綜上所述，SPRY4基因rs10040443位點(diǎn)多態(tài)性可能與中國(guó)北方地區(qū)漢族人群AIS具有相關(guān)性，該位點(diǎn)CC基因型可能為AIS的危險(xiǎn)因素。此外，CT+TT基因型與PUMC Ⅱ型亦具有一定相關(guān)性，若AIS患者基因檢測(cè)結(jié)果為CT+TT基因型，則其后期進(jìn)展為PUMC Ⅱ型的風(fēng)險(xiǎn)增加，該基因位點(diǎn)有望成為預(yù)測(cè)AIS進(jìn)展情況的參考指標(biāo)，并輔助臨床進(jìn)行早期干預(yù)。本研究結(jié)果有助于明確SPRY4基因多態(tài)性與中國(guó)漢族人群 AIS 易感性的關(guān)系，為該病的病因?qū)W研究提供了新思路，并為臨床干預(yù)提供了依據(jù)。

作者貢獻(xiàn)：吳增玉負(fù)責(zé)研究設(shè)計(jì)、數(shù)據(jù)收集與整理、統(tǒng)計(jì)分析、論文撰寫；張躍川負(fù)責(zé)文獻(xiàn)檢索；彭越負(fù)責(zé)倫理材料收集；吳南負(fù)責(zé)測(cè)序數(shù)據(jù)及倫理材料收集；邱貴興、莊乾宇、仉建國(guó)負(fù)責(zé)研究設(shè)計(jì)、研究指導(dǎo)、論文修訂。

利益沖突：所有作者均聲明不存在利益沖突