Vaspin通過AMPK/mTOR自噬信號通路影響2型糖尿病大鼠胰島β細胞功能

魏姣姣，劉師偉，段瑞雪，李 楠，王江娜

1山西醫(yī)科大學第九臨床醫(yī)學院，太原 030009 2山西白求恩醫(yī)院(山西醫(yī)學科學院 同濟山西醫(yī)院)山西醫(yī)科大學第三醫(yī)院內(nèi)分泌科，太原 030032 3華中科技大學同濟醫(yī)學院附屬同濟醫(yī)院內(nèi)分泌科，武漢 430030 4山西醫(yī)科大學研究生學院，太原 030001

糖尿病是最常見的代謝綜合征之一，近年來其患病率呈逐年上升趨勢，預計至2040年全球糖尿病患者人數(shù)將高達6.4億，給社會帶來極大的疾病負擔[1]。2型糖尿病(type 2 diabetes mellitus，T2DM)是糖尿病的最主要形式，除胰島素抵抗外，胰島β細胞衰竭(包括胰島β細胞數(shù)量減少和胰島β細胞功能障礙)亦是其發(fā)病的主要原因[2]，其中胰島β細胞功能障礙是T2DM發(fā)病的核心環(huán)節(jié)。因此，T2DM的理想治療策略是在降低血糖的同時保護胰島β細胞功能。

自噬是維持細胞穩(wěn)態(tài)的一種保護性機制，在維持胰島β細胞數(shù)量和功能方面起重要作用[3]。自噬受多種信號通路的調(diào)控，腺苷酸活化蛋白激酶(adenosine monophosphate activated protein kinase，AMPK)/哺乳動物雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin，mTOR)通路是其中較為重要的通路之一[4]，對胰島β細胞的功能維持尤其重要[5]。內(nèi)臟脂肪特異性絲氨酸蛋白酶抑制劑(visceral adipose tissue-derived serpin，Vaspin)是一種脂肪細胞因子[6]，具有調(diào)節(jié)胰島素敏感性、糖耐量、減少食欲和抗動脈粥樣硬化的作用[7-9]。研究發(fā)現(xiàn)，Vaspin可促進胰島素分泌，改善胰島β細胞功能[10]。在心肌細胞中，Vaspin可通過AMPK/mTOR通路激活自噬，改善缺血再灌注心肌細胞損傷[11]，但Vaspin能否通過AMPK/mTOR通路調(diào)節(jié)自噬，進而改善胰島β細胞功能尚未明確。本研究以高脂高糖聯(lián)合鏈脲佐菌素(streptozotocin，STZ)誘導的方式制備T2DM大鼠模型，探究Vaspin改善T2DM大鼠胰島β細胞功能的機制及具體信號通路，以期為T2DM的干預提供新思路。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

SPF級8周齡 Sprague-Dawley(SD)雄性大鼠40只，體質(zhì)量180～200 g，購自北京斯貝福動物技術有限公司，動物合格證號為SCXK(京)2019-0010。大鼠飼養(yǎng)于山西醫(yī)科大學動物實驗中心，室溫22～26 ℃，相對濕度40%～60%，明暗周期12 h，保持通風換氣，定期更換墊料。

本研究已通過山西醫(yī)科大學實驗動物倫理審查委員會審批(審批號：SYDL2022015)。

1.2 方法

1.2.1 試劑

主要試劑包括：重組人Vaspin蛋白(美國Phoenix公司)，STZ(美國Sigma公司)，血糖試紙(上海萊弗仕康醫(yī)療器材有限公司)，大鼠胰島素酶聯(lián)免疫吸附檢測試劑盒(上海西唐生物科技有限公司)，甘油三酯(triglyceride，TG)、總膽固醇(total cholesterol，TC)檢測試劑盒(南京建成生物工程研究所)，兔抗鼠源性β-actin、AMPK、磷酸化AMPK(phosphorylated AMPK，p-AMPK)、mTOR、磷酸化mTOR(phosphorylated mTOR，p-mTOR)、LC3、P62、胰島素抗體(美國Cell Signaling Technology公司)，HRP-標記的山羊抗兔抗體、凝膠配制試劑盒、蛋白提取試劑盒、BCA 蛋白定量試劑盒及免疫組化檢測試劑盒(武漢博士德生物工程公司)，ECL試劑盒(美國Affinity公司)。

1.2.2 造模、分組及干預

SD大鼠適應性飼養(yǎng)1周后，隨機分為正常對照組(n=10)和高糖高脂組(n=30)，分別給予標準飼料或高脂高糖飼料。飼養(yǎng)5周后，高脂高糖組大鼠腹腔注射STZ 35 mg/kg，3 d后取鼠尾靜脈血檢測，隨機血糖>16.7 mmol/L視為T2DM造模成功[12]，造模不成功者剔除實驗。取20只造模成功的大鼠，隨機分為T2DM組(n=10)、Vaspin組(n=10)。Vaspin組每日腹腔注射Vaspin 960 ng/kg，連續(xù)干預8周[13]；T2DM組與正常對照組均腹腔注射等劑量生理鹽水。

1.3 觀察指標

記錄造模前、干預前、干預4周和干預8周時3組大鼠體質(zhì)量和空腹血糖(fasting blood-glucose，F(xiàn)BG)。干預8周時，進行如下測定：

1.3.1 代謝指標

取大鼠空腹靜脈血，檢測空腹胰島素(fasting insulin，F(xiàn)INS)、TC及TG。

1.3.2 糖耐量及胰島素敏感性

(1)腹腔葡萄糖耐量試驗(intraperitoneal glucose tolerance test，IPGTT)：大鼠(n=6)禁食過夜后，腹腔注射20%葡萄糖2 g/kg，于注射0 min、30 min、60 min、90 min、120 min時取靜脈血測定血糖變化，采用梯形法則計算血糖曲線下面積(area under the curve，AUC)，評估糖耐量變化。(2)腹腔胰島素耐量試驗(intraperitoneal insulin tolerance test，IPITT)：于IPGTT 1周后進行。大鼠禁食過夜后，腹腔注射速效胰島素2 U/kg，于注射0 min、30 min、60 min、90 min、120 min取靜脈血測定血糖值，并計算AUC，評估大鼠胰島素敏感性變化。

1.3.3 胰島β細胞功能

采用高葡萄糖鉗夾試驗評估大鼠胰島β細胞功能。大鼠(n=3)禁食過夜后(每組余4只大鼠中，因發(fā)生死亡或操作不當均剔除1只大鼠)，采用異氟烷吸入麻醉。麻醉成功后進行頸動脈、股靜脈置管，靜置30 min后于頸動脈插管的三通管處取血，測血糖水平；經(jīng)股靜脈插管處注入20%葡萄糖200 mg/kg(1 min內(nèi)輸注完畢)，微量泵持續(xù)輸入20%葡萄糖(持續(xù)120 min)，每5 min檢測1次血糖，根據(jù)血糖水平調(diào)整葡萄糖輸注速率(glucose infusion rate，GIR)，使血糖水平維持在基礎水平+7.9 mmol/L附近；血糖達穩(wěn)態(tài)后，連續(xù)取3個時間點GIR均值作為穩(wěn)態(tài)時的GIR。分別于輸注葡萄糖0 min、5 min、10 min、60 min、90 min、120 min時，分別取頸動脈處血樣200 μL檢測血清胰島素水平；第一時相胰島素分泌量為0 min、5 min、10 min胰島素水平之和，第二時相胰島素分泌量為60 min、90 min、120 min胰島素水平的均值。根據(jù)穩(wěn)態(tài)時GIR及第一、二時相胰島素分泌量，評估胰島β細胞功能[14]。

1.3.4 組織病理學檢查

高葡萄糖鉗夾試驗結束后處死大鼠，取胰尾組織，4%甲醛溶液固定；經(jīng)逐級脫水、浸蠟、包埋、切片后進行HE染色，光鏡下觀察大鼠胰腺組織形態(tài)。

1.3.5 胰島素及自噬相關蛋白P62、LC3表達測定

采用免疫組化法測定3組胰腺組織胰島素、P62、LC3表達水平。取石蠟包埋的胰腺組織切片，依次進行3～5 μm連續(xù)切片、脫蠟、梯度乙醇水化、抗原修復，山羊血清封閉30 min；滴加經(jīng)PBS稀釋(1∶200)的胰島素、LC3及P62抗體，4 ℃孵育過夜；PBS清洗3次，滴加相應的二抗，37 ℃孵育30 min；切片依次經(jīng)DAB顯色、蘇木精復染、脫水、透明、封片，于顯微鏡下觀察。采用IPP 6.0軟件檢測陽性組織平均光密度值(average optical density，AOD)，AOD越大表示蛋白表達量越高。

1.3.6 AMPK/mTOR信號通路相關蛋白表達測定

采用Western blot法測定各蛋白表達水平。首先按照試劑盒說明書中的操作步驟提取大鼠胰腺組織中的總蛋白，然后采用BCA法測定蛋白濃度并調(diào)整濃度為20 g/L；取蛋白樣品，按體積比4∶1與5×蛋白上樣緩沖液混合，100 ℃加熱5 min使蛋白變性；通過SDS-PAGE電泳促進蛋白分離，采用濕轉法將凝膠上的蛋白電轉至PVDF膜，5% BSA或5%脫脂奶粉封閉1 h；加入AMPK、p-AMPK、mTOR、p-mTOR、P62、微管相關蛋白1輕鏈3(microtubule associated protein1 light chain3，LC3)Ⅰ、LC3 Ⅱ等特異性一抗(1∶1000)和HRP-標記的羊抗兔抗體(1∶5000)，經(jīng)ECL發(fā)光顯影，采用Image J軟件分析各蛋白相對表達水平，并計算p-AMPK/AMPK、p-mTOR/mTOR、LC3 Ⅱ/LC3 Ⅰ比值。

1.4 統(tǒng)計學處理

采用SPSS 25.0軟件進行統(tǒng)計學分析。體質(zhì)量、FBG、FINS、TC、TG等符合正態(tài)分布的計量資料以均數(shù)±標準差表示，組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 Vaspin對大鼠體質(zhì)量及血糖水平的影響

3組大鼠造模前體質(zhì)量、FBG均無統(tǒng)計學差異(P均>0.05)。與正常對照組比較，T2DM組與Vaspin組干預前、干預4周、干預8周時體質(zhì)量均下降，F(xiàn)BG均升高(P均<0.05)；與T2DM組比較，Vaspin組干預4周時大鼠體質(zhì)量及FBG無統(tǒng)計學差異(P均>0.05)，干預8周時大鼠體質(zhì)量增高，F(xiàn)BG下降(P均<0.05)，提示Vaspin可降低T2DM大鼠血糖，提高體質(zhì)量(表1)。

表1 3組大鼠不同時間點體質(zhì)量、FBG比較

2.2 Vaspin對大鼠胰島素及脂質(zhì)的影響

與正常對照組比較，T2DM組、Vaspin組干預8周時FINS均降低，TC、TG均升高(P均<0.05)；與T2DM組比較，Vaspin組干預8周時FINS升高，TC、TG降低(P均<0.05)，提示Vaspin可改善T2DM大鼠脂質(zhì)代謝，增加胰島素分泌量(表2)。

表2 3組大鼠干預8周時FINS、TC、TG水平比較

圖1 3組大鼠糖耐量及胰島素敏感性比較(n=6)

2.3 Vaspin對大鼠糖耐量及胰島素敏感性的影響

與正常對照組比較，T2DM組干預8周時的血糖AUC顯著升高[IPGTT：(53.10±5.19)mmol/(L·h)比 (13.70±2.19)mmol/(L·h)，P<0.001；IPITT：(37.22±3.60)mmol/(L·h)比 (6.48±1.12)mmol/(L·h)，P<0.001]，Vaspin組大鼠血糖AUC雖高于正常對照組，但顯著低于T2DM組[IPGTT：(42.76±4.81)mmol/(L·h)比(53.10±5.19)mmol/(L·h)，P=0.001；IPITT：(25.84±10.07)mmol/(L·h)比(37.22±3.60)mmol/(L·h)，P=0.006]，提示Vaspin可改善T2DM大鼠糖耐量及胰島素敏感性(圖1)。

2.4 Vaspin對大鼠胰島β細胞功能的影響

高葡萄糖鉗夾試驗是評估胰島β細胞功能的金標準，結果顯示，與正常對照組比較，T2DM組大鼠穩(wěn)態(tài)時GIR值[(7.23±1.47)mg/(kg·min)比 (25.92±1.61)mg/(kg·min)，P<0.001]、第一時相[(1.24±0.18)μg/L 比 (3.17±0.25)μg/L，P<0.001]及第二時相[(0.46±0.09)μg/L 比 (1.14±0.07)μg/L，P<0.001]胰島素分泌量均降低；Vaspin組GIR值、第一時相及第二時相胰島素分泌量雖亦低于正常對照組，但各指標均較T2DM組升高[GIR：(12.55±1.47)mg/(kg·min)比 (7.23±1.47)mg/(kg·min)，P=0.005；第一時相胰島素分泌量：(2.31±0.20)μg/L比(1.24±0.18)μg/L，P=0.001；第二時相胰島素分泌量：(0.72±0.04)μg/L比(0.46±0.09)μg/L，P=0.003]，表明Vaspin可改善T2DM大鼠胰島β細胞功能(圖2)。

2.5 Vaspin對大鼠胰腺組織病理學形態(tài)的影響

正常對照組大鼠胰腺組織中胰島面積正常、形態(tài)結構完整、呈橢圓形，胰島細胞排列均勻、整齊，形態(tài)規(guī)則，細胞核呈圓形且大致位于細胞中央，細胞質(zhì)呈粉色，細胞核為深紫色。與正常對照組比較，T2DM組大鼠胰島面積明顯減少，胰島結構明顯被破壞，細胞分布不均勻、形狀不規(guī)則，間質(zhì)增多；與T2DM組比較，Vaspin組大鼠胰島形態(tài)有不同程度改善，大部分胰島細胞形態(tài)規(guī)則，細胞核形態(tài)恢復，提示Vaspin可明顯減輕T2DM大鼠胰島形態(tài)與結構損傷(圖3)。

2.6 Vaspin對大鼠胰腺組織中胰島素及自噬相關蛋白表達的影響

免疫組化結果顯示，與正常對照組比較，T2DM組大鼠胰腺組織中胰島素表達水平降低(AOD：0.030±0.020比0.151±0.003，P=0.001)，P62(AOD：0.046±0.010比0.009±0.003，P=0.000)、LC3蛋白(AOD：0.073±0.017比0.035±0.022，P=0.028)水平升高；與T2DM組比較，Vaspin組大鼠胰腺組織中胰島素(AOD：0.095±0.037比0.030±0.020，P=0.015)、LC3蛋白(AOD：0.172±0.005比 0.073±0.017，P=0.000)表達水平升高，P62蛋白表達水平降低(AOD：0.002±0.001比0.046±0.010，P=0.000)，表明Vaspin可激活自噬、改善自噬活性，進一步表明其可改善胰島β細胞功能(圖4)。

圖2 3組大鼠高葡萄糖鉗夾試驗結果比較(n=3)

2.7 Vaspin激活大鼠胰腺組織中自噬的信號通路

Western blot結果顯示，與正常對照組比較，T2DM組大鼠胰腺組織p-AMPK/AMPK比值、LC3Ⅱ/LC3Ⅰ比值及P62蛋白水平升高，p-mTOR/mTOR比值降低(P均<0.05)；與T2DM組比較，Vaspin組p-AMPK/AMPK比值及LC3Ⅱ/LC3Ⅰ比值升高，p-mTOR/mTOR比值及P62蛋白水平降低(P均<0.05)，提示Vaspin可通過AMPK/mTOR信號通路激活T2DM大鼠胰島β細胞自噬(圖5，表3)。

圖3 3組大鼠胰腺組織病理圖(HE，×400，n=3)

圖4 3組大鼠胰腺組織胰島素、P62、LC3蛋白表達免疫組化圖(n=3)

圖5 3組大鼠胰腺組織AMPK/mTOR信號通路活性及自噬相關蛋白表達凝膠電泳圖(n=3)

表3 3組大鼠干預8周時p-AMPK/AMPK、p-mTOR/mTOR、LC3Ⅱ/LC3Ⅰ、P62水平比較

3 討論

胰島β細胞功能衰竭是T2DM發(fā)生發(fā)展的重要病理機制[15]，改善胰島β細胞功能障礙是該疾病防治的重要手段。Vaspin已被證實對胰島β細胞具有保護作用，但其能否通過影響自噬發(fā)揮作用，以及調(diào)控自噬的信號通路尚未明確。本研究以T2DM大鼠模型為研究對象，探究Vaspin改善T2DM大鼠胰島β細胞功能的具體作用機制。血液學檢測結果顯示，與T2DM組比較，Vaspin組干預8周時FINS升高，F(xiàn)BG、IPGTT與IPITT血糖AUC均降低，提示Vaspin可降低血糖，促進胰島素分泌并增加胰島素敏感性；對胰腺組織病理學與胰島β細胞功能檢查后發(fā)現(xiàn)，與T2DM組比較，Vaspin組胰島β細胞損傷減輕，第一、二時相胰島素分泌量均升高，進一步明確了Vaspin對胰島β細胞具有保護作用；對大鼠胰腺組織中自噬蛋白及相關信號通路活性檢測后發(fā)現(xiàn)，與T2DM組比較，Vaspin組大鼠胰腺組織中胰島素表達水平、p-AMPK/AMPK比值及LC3Ⅱ/LC3Ⅰ比值均升高，p-mTOR/mTOR比值及P62蛋白水平均降低，說明Vaspin干預后大鼠自噬能力增高，自噬相關通路AMPK/mTOR呈活化狀態(tài)。結合以上結果初步判定，Vaspin可通過上調(diào)AMPK/mTOR信號通路活性，增強自噬，進而發(fā)揮保護胰島β細胞、改善T2DM病情的藥理作用。

3.1 Vaspin可改善代謝指標及胰島β細胞功能

Vaspin屬于脂肪因子，與多種代謝紊亂直接或間接相關。Kloting等[16]在不同糖耐量人群的研究中發(fā)現(xiàn)，血清Vaspin濃度增加與肥胖、胰島素抵抗及T2DM代謝參數(shù)變化相關。Nicholson等[17]、Nakatsuka等[18]基于動物實驗和T2DM人群研究發(fā)現(xiàn)，Vaspin可增加胰島素敏感性、改善糖耐量、降低血糖，調(diào)節(jié)脂質(zhì)代謝。本研究結果顯示，經(jīng)Vaspin干預后，T2DM大鼠體質(zhì)量、FINS升高，TC、TG、FBG均下降，提示Vaspin具有改善T2DM大鼠脂質(zhì)代謝紊亂、減輕胰島素抵抗、增加糖耐量、降低血糖的作用，與既往報道結果一致。

除對代謝指標有調(diào)節(jié)作用外，有研究發(fā)現(xiàn)Vaspin作用于離體胰島后，可引起葡萄糖刺激下的胰島素分泌增加[10]，提示Vaspin亦可影響胰島β細胞功能。本研究基于IPGTT與IPITT、高葡萄糖鉗夾試驗及組織病理學檢查結果可知，相較于T2DM組，Vaspin組大鼠胰島損傷明顯減輕、胰島β細胞功能明顯增強、胰島素敏感性明顯增高，再次驗證了Vaspin具有改善T2DM大鼠胰島β細胞功能的作用。

3.2 Vaspin可增強胰島β細胞自噬

自噬是細胞內(nèi)的“清道夫”，可降解細胞內(nèi)缺陷蛋白質(zhì)、受損細胞器和有害物質(zhì)，從而保護機體免受缺血、缺氧及部分外部刺激等造成的應激性損害[19-20]。在病理條件下，自噬能力不足或受損可能導致胰島β細胞功能障礙甚至凋亡，誘發(fā)T2DM[3]。LC3、P62是公認的自噬標志蛋白，自噬形成時，胞漿型LC3(LC3 Ⅰ)的小片段多肽發(fā)生酶解后轉變?yōu)槟ば蚅C3(LC3 Ⅱ)，故LC3Ⅱ/LC3Ⅰ比值可反映自噬水平，其值越高表示自噬水平越高[21]；P62是一種泛素結合蛋白，其表達水平與細胞自噬活性呈負相關，自噬缺陷時出現(xiàn)P62累積[22]。最新基于T2DM人群和小鼠實驗的研究結果表明，胰島β細胞長時間暴露于游離脂肪酸中可引起自噬體積聚，伴隨自噬蛋白LC3 Ⅱ和P62水平升高，提示暴露于脂肪酸的β細胞自噬水平呈代償性激活但自噬活性下降，導致胰島β細胞凋亡及其功能障礙，促進T2DM進展[20，23]。上調(diào)自噬水平或增加其活性，有助于維持胰島β細胞活力及功能[3]，顯著減少高濃度游離脂肪酸和葡萄糖引起的胰島β細胞凋亡[24]，而Vaspin在其他細胞中已被證實具有激活自噬的作用[11]，理論上有可能通過調(diào)節(jié)自噬信號通路，改善胰島β細胞功能。本研究發(fā)現(xiàn)，與正常對照組比較，T2DM組大鼠胰島素水平降低，反映自噬水平的LC3Ⅱ/LC3Ⅰ比值及與自噬活性呈負相關的P62蛋白水平均升高，進一步驗證了T2DM大鼠胰島β細胞呈自噬水平升高但自噬活性降低的紊亂狀態(tài)；與T2DM組比較，Vaspin組LC3Ⅱ/LC3Ⅰ比值升高，P62蛋白水平降低，提示Vaspin干預后T2DM大鼠胰島β細胞自噬水平上調(diào)的同時自噬活性得到恢復，說明Vaspin改善胰島β細胞的功能與調(diào)控自噬有關。

3.3 Vaspin調(diào)控AMPK/mTOR信號通路增強胰島β細胞自噬

自噬受多個通路的調(diào)控，其中mTOR是負調(diào)控自噬的中心分子。mTOR通過參與多種生物過程以維持機體代謝平衡，包括調(diào)節(jié)細胞自噬、線粒體功能、脂肪生成、酮體合成及葡萄糖穩(wěn)態(tài)[25]。AMPK是維持細胞內(nèi)能量平衡、調(diào)控全身能量代謝的關鍵能量調(diào)節(jié)元件，其可抑制mTOR活性，啟動自噬[26]，因此AMPK/mTOR信號通路不僅是細胞內(nèi)能量代謝監(jiān)測系統(tǒng)的重要位點，也是調(diào)節(jié)自噬的重要上游信號通路[27]?，F(xiàn)有證據(jù)表明，羅格列酮和二甲雙胍等糖尿病治療藥物改善T2DM患者胰島β細胞功能的機制與通過AMPK/mTOR途徑誘導細胞自噬增強有關[28]。既往文獻證實Vaspin具有AMPK/mTOR調(diào)控作用，如Nakatsuka等[18]發(fā)現(xiàn)Vaspin可促進肥胖大鼠肝細胞AMPK磷酸化，改善葡萄糖、脂質(zhì)代謝；Yang等[11]發(fā)現(xiàn)Vaspin可通過AMPK/mTOR通路激活自噬進而減輕缺血再灌注心肌細胞損傷。本研究對該通路關鍵調(diào)控蛋白檢測后發(fā)現(xiàn)，與T2DM組比較，Vaspin組p-AMPK/AMPK比值及LC3Ⅱ/LC3Ⅰ比值均升高，p-mTOR/mTOR比值及P62蛋白水平均降低，初步說明Vaspin可通過激活AMPK/mTOR 信號通路，增強胰島β細胞自噬能力。

本研究創(chuàng)新性：首次闡明Vaspin改善胰島β細胞功能的作用機制與細胞自噬有關。本研究局限性：(1)未設置AMPK/mTOR信號通路抑制劑組，Vaspin與該通路的詳細作用關系尚未闡明；(2)僅為動物實驗，確切結論需臨床研究加以證實。

綜上所述，Vaspin具有保護T2DM大鼠胰島β細胞功能，促進胰島素分泌并增加胰島素敏感性的作用，以降低血糖、減輕T2DM病情，其作用機制可能與活化AMPK/mTOR信號通路，增強細胞自噬能力有關，該分子通路有望成為T2DM防治的新靶點。由于T2DM發(fā)病機制及自噬體系相當復雜，Vaspin調(diào)控自噬及其改善胰島β細胞功能的機制仍需深入研究以進一步驗證。

作者貢獻：魏姣姣負責研究實施及論文撰寫；劉師偉負責研究設計并指導論文修訂；段瑞雪、李楠負責實驗設計、數(shù)據(jù)分析及結果解讀；王江娜負責實驗過程及文獻查詢。

利益沖突：所有作者均聲明不存在利益沖突