基于柱前Hantzsch 衍生高效液相色譜法檢測紙吸管中微量游離甲醛

◎ 陳 闖，肖 宇，李永麗，薛 康

（成都海關技術(shù)中心，四川 成都 610041）

甲醛無色具有刺激性氣味，影響機體的免疫系統(tǒng)，能對人體造成包括嗅覺、肺功能、免疫功能、肝功能的異常及損傷，還可能誘發(fā)細胞基因突變，具有一定的遺傳毒性[1]。2017 年世界衛(wèi)生組織國際癌癥研究機構(gòu)公布甲醛在Ⅰ類致癌物列表清單中。2022 年我國發(fā)布《食品安全國家標準 食品接觸紙和紙板材料及制品》（GB 4806.8—2022）國家標準，規(guī)定甲醛殘留量應≤1 mg·dm-2[2]。甲醛作為化工原料也常應用于食品接觸材料中，其單體及其低聚物會殘留在這些食品接觸材料中，食品接觸用紙制品使用到的原材料、助劑、膠粘劑等以及不法企業(yè)使用的廢紙原料，均有可能引入甲醛[3-5]。

目前針對紙質(zhì)食品接觸材料中甲醛的檢測主要是使用分光光度法[6-7]和基于2,4-二硝基苯肼衍生的高效液相色譜法[8-10]。分光光度法易受食品接觸用紙及紙制品在水提取過程中褪色的影響，引起吸光度測量誤差，造成測量不準確[11-12]。2,4-二硝基苯肼幾乎能與所有酮、醛發(fā)生衍生反應，反應產(chǎn)物較復雜，同樣紙制品中也可能含有其他醛酮類物質(zhì)，易產(chǎn)生干擾[13-14]。由于乙酰丙酮只與甲醛和乙醛發(fā)生Hantzsch衍生反應，且在高效液相色譜條件下易分離出兩者的衍生產(chǎn)物，產(chǎn)生的甲醛衍生產(chǎn)物為2,6-二甲基-3,5-二乙?；?1,4-二氫吡啶，在可見光區(qū)有最大吸收波長為415 nm，可通過液相色譜儀進行檢測[15-16]。徐莉莉等[17]、曾文祥等[18]、王晨蕾等[19]已成功應用上述衍生反應結(jié)合液相色譜法對酒類及牙膏中微量甲醛進行了檢測。

本文利用乙酰丙酮與甲醛發(fā)生Hantzsch 衍生的反應產(chǎn)物特性，參考相關標準文獻，借助高效液相色譜儀，旨在建立一種操作簡便、定量準確、精密度高，適用于紙吸管中微量游離甲醛含量測定的檢測方法。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器

網(wǎng)絡及線下市場隨機購買的不同品牌紙吸管樣品各8 批次，密封保存，冷藏備用。

甲醛標準品（北京曼哈格生物科技有限公司，100 mg·L-1）；乙酰丙酮（天津科密歐化學試劑有限公司）；乙酸、乙酸銨、乙腈（美國天地化學試劑有限公司，色譜純）。

安捷倫1200 高效液相色譜儀帶二極管陣列檢測器（美國安捷倫科技公司）；恒溫水浴鍋（浙江金壇富華儀器有限公司）；VORTEX GENIUS 3 渦旋混勻儀（德國IKA 公司）； XS 105 Dual Range 電子天平（瑞士梅特勒-托利公司）；MIMI-Q A10 超純水儀（美國密理博公司）；0.45 μm 水相濾膜（津騰公司）。

1.2 實驗方法

1.2.1 溶液配制

2%乙酰丙酮衍生液配制：稱取150 g 乙酸銨至500 mL 容量瓶中，加入7.5 mL 乙酸及1.00 g 乙酰丙酮，超純水溶解后并定容至500 mL，放置于2 ～8 ℃冰箱避光保存。

10 mg·L-1甲醛標準中間液：吸取100 mg·L-1甲醛標準1 mL 至10 mL 容量瓶中，加超純水定容。

1.2.2 甲醛衍生物標準系列溶液配制

分別吸取10 mg·L-1甲醛標準中間液0 μL、50 μL、100 μL、200 μL、400 μL、800 μL、1 600 μL 和3 200 μL至10 mL 具塞比色管中，然后各加入2%乙酰丙酮衍生液2.5 mL，超純水定容至刻度，玻璃塞密封比色管，渦旋混勻，放置于恒溫水浴鍋，在60 ℃條件下水浴15 min 后冷卻，即配制成濃度為0 mg·L-1、0.05 mg·L-1、0.10 mg·L-1、0.20 mg·L-1、0.40 mg·L-1、0.80 mg·L-1、1.60 mg·L-1和3.20 mg·L-1甲醛衍生物標準溶液（現(xiàn)配現(xiàn)用）。

1.2.3 樣品前處理

考慮到紙吸管在使用過程中預期溫度可能超過40 ℃，參考食品安全國家標準GB 4806.8—2022 中關于對食品接觸用紙和紙板材料及制品測定甲醛時制取水提取試液的規(guī)定。稱取剪碎至1 cm2大小的紙吸管樣品10 g左右（精確至0.01 g），將樣品置于具塞250 mL三角燒瓶中，加入200 mL 沸水，蓋上塞子。將燒瓶置于恒溫水浴槽中，控制溫度為（80±2）℃，時間為（120±5）min，其間不時振搖。時間到后，將溶液從燒瓶中轉(zhuǎn)移至250 mL 容量瓶中，并用80 ℃的水沖洗試樣2 次，洗滌液并入250 mL 容量瓶中，冷卻至20℃定容混勻。吸取提取液5 mL 至10 mL 具塞比色管中，同理按照1.2.2 方式衍生處理，反應結(jié)束，取提取液過0.45 μm 水相濾膜至進樣瓶中供液相色譜檢測。按同樣方法制備空白溶液。

1.2.4 液相色譜條件

色譜柱：SHIMADZU VP-ODS C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相：水∶乙腈=80 ∶20；流速：1.0 mL·min-1；檢測波長：415 nm；進樣量：10 μL；柱溫：30 ℃。

2 結(jié)果與分析

2.1 檢測波長的確定

通過安捷倫液相色譜二極管陣列檢測器進行3D光譜掃描，發(fā)現(xiàn)甲醛衍生產(chǎn)物在254 nm 和415 nm 處分別都有吸收峰。對比發(fā)現(xiàn)雖然在254 nm 響應值較高，但在該紫外波段附近的其他雜峰較多，甲醛衍生物檢測易受干擾，因此選擇415 nm 作為檢測波長。

2.2 衍生溫度與時間優(yōu)化

根據(jù)GB 31604.48—2016 食品接觸材料及制品甲醛遷移量的測定中分光光度法衍生條件，該衍生反應在40 ℃水浴中放置30 min 即可反應完全[20]。

將3.2 mg·L-1的甲醛溶液按1.2.2 實驗方法考察反應溫度為40 ℃、50 ℃、60 ℃、70 ℃、80 ℃對衍生反應后甲醛衍生產(chǎn)物在液相色譜儀上的衍生峰響應面積的影響。設置反應時間為5 min、10 min、15 min、20 min、30 min、60 min，發(fā)現(xiàn)實驗前期在相同的時間內(nèi)，衍生溫度越高，衍生峰面積越大（圖1）。在10 min后60 ℃、70 ℃、80 ℃的條件下，衍生峰面積趨于最大并基本穩(wěn)定，最大面積與在40 ℃水浴中放置30 min時衍生峰面積基本一致。為確保反應完全同時考慮時效性，選定衍生溫度為60 ℃，時間為15 min。

圖1 衍生溫度和時間對衍生峰面積的影響圖

2.3 衍生劑濃度對衍生峰面積的影響

配制3.2 mg·L-1的甲醛溶液，加入濃度為0%、0.1%、0.2%、0.4%、1.0%、1.5%、2.0%、4.0% 和5.0% 的乙酰丙酮衍生液2.5 mL，按照1.2.2 方式衍生處理，冷卻后檢測，考察加入乙酰丙酮濃度對衍生峰面積的影響，結(jié)果見表1。結(jié)果表明，隨著乙酰丙酮衍生液濃度的增大，衍生物峰面積逐漸增大；當加入的乙酰丙酮濃度在1.5%以上時，衍生峰面積就基本趨于保持恒定。該實驗選擇加入濃度為2%的乙酰丙酮衍生液。

表1 乙酰丙酮衍生液濃度對衍生峰面積的影響表

2.4 方法學考察

2.4.1 方法專屬性

通過液相色譜儀器檢測甲醛衍生物標準系列，甲醛衍生物的保留時間為9.19 min。對比空白標準衍生液與甲醛衍生物標準濃度為0.1 mg·L-1的色譜圖，結(jié)果顯示在衍生物出峰位置及附近未出現(xiàn)其他干擾峰，該方法的專屬性較好，詳見圖2、圖3。

圖2 空白標準衍生液圖

圖3 0.1 mg·L-1 甲醛衍生物標準圖

2.4.2 方法檢出限與定量限

取6 份10 g 陰性紙吸管樣品，按1.2.3 制備6 份甲醛加標濃度為0.01 mg·L-1、0.02 mg·L-1、0.05 mg·L-1、0.10 mg·L-1、0.20 mg·L-1和0.50 mg·L-1的甲醛衍生物上機溶液，通過液相色譜檢測。擬將待測物的信噪比約為3 ∶1 時，對應的加標濃度定為儀器檢出限；將信噪比約為10 ∶1 時，對應的加標濃度定為儀器定量限。

實驗結(jié)果顯示在0.02 mg·L-1濃度時測的信噪比為4.3；在0.05 mg·L-1濃度時測的信噪比為12.6，綜合色譜圖基線情況選取0.02 mg·L-1為儀器的檢出限，0.05 mg·L-1為儀器的定量限。根據(jù)樣品前處理及稀釋比例，對應的該方法的檢出限及定量限分別為1.0 mg·kg-1和2.5 mg·kg-1。

2.4.3 標準曲線

配制濃度為0 mg·L-1、0.05 mg·L-1、0.10 mg·L-1、0.20 mg·L-1、0.40 mg·L-1、0.80 mg·L-1、1.60 mg·L-1和3.20 mg·L-1的甲醛衍生物標準系列溶液，通過液相色譜儀檢測，以濃度為橫坐標，衍生峰面積為縱坐標繪制標準曲線。甲醛衍生物標準在0.05 ～3.20 mg·L-1與之對應衍生物峰面積呈線性，線性方程為y=120.61x-0.094，相關系數(shù)R2為0.999 8。說明甲醛衍生物上機濃度在0.05 ～3.20 mg·L-1時與甲醛衍生物峰面積之間有較好的線性關系。

2.4.4 方法回收率和精密度

取某陽性樣品按照1.2.3 衍生反應處理，進行6 次檢測，樣品提取液本底平均值為1.87 mg·L-1。同理該樣品分別按照1 倍定量限、10 倍定量限和40 倍定量限，做3 個濃度的加標衍生反應，最終折算為上機溶液中加標濃度為0.05 mg·L-1、0.50 mg·L-1、2.00 mg·L-1，分別進行6 次測定。3 種不同添加濃度下的加標回收率為87.2%～106.1%，RSD 為1.42%～4.63%。方法具有良好的回收率及精密度，滿足檢測方法對加標回收率及精密度的要求。相關數(shù)據(jù)及結(jié)果見表2。

表2 甲醛加標回收率和精密度結(jié)果表（n=6）

2.5 實際樣品的檢測

在網(wǎng)絡及線下市場隨機購買不同品牌的紙吸管樣品各8 份，共16 份樣品，稱取重量、量取尺寸，對殘留的游離甲醛含量進行檢測，并按照面積折算檢測結(jié)果。其中有4 份紙吸管浸泡液甲醛檢測結(jié)果呈陽性，按面積折算結(jié)果值均小于1 mg·dm-2，符合《食品安全國家標準 食品接觸用紙和紙板材料及制品》（GB 4806.8—2022）中甲醛殘留量要求。由于本次所檢樣品不能代表所有紙吸管產(chǎn)品的結(jié)果，而且紙吸管是直接與口腔接觸的食品接觸材料，較低的含量也應該引起消費者企業(yè)，相關監(jiān)管部門的注意。各數(shù)據(jù)結(jié)果見表3。

表3 紙吸管樣品的測定表

3 結(jié)論

本文確定以添加濃度為2%乙酰丙酮衍生液與甲醛在60 ℃、15 min 的條件下完成Hantzsch 衍生反應，利用生成的甲醛衍生物在可見光區(qū)有最大吸收波長415 nm，經(jīng)高效液相色譜分離并檢測甲醛衍生物，外標法定量，建立了針對檢測紙吸管中微量游離甲醛的基于柱前Hantzsch 衍生高效液相色譜法。該方法操作簡便、選擇性好、定量準確、回收率及精密度良好，可以滿足對紙吸管中殘留的微量游離甲醛的定性、定量檢測分析。