枳實-白芍不同配伍比例及枳實生品與炮制品換用的枳實芍藥散化學(xué)成分研究

余遠(yuǎn)盼，林桂梅，李醫(yī)名

遼寧中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，遼寧 大連 116600

枳實芍藥散由枳實和白芍兩藥配伍而成，始見于《金匱要略》“枳實（燒令黑，勿太過），芍藥等分。上二味，杵為散，服方寸匕，日三服，并主癰膿，以麥粥下之”，用于“產(chǎn)后腹痛，煩滿不得臥”。枳實性溫，能破氣消積、化痰除痞；芍藥酸寒，養(yǎng)血斂陰、緩急止痛。兩藥合用，枳實得芍藥行氣不傷血，芍藥得枳實養(yǎng)血不瘀滯，共奏行氣和血止痛之功[1-2]。枳實始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，歷代古籍記載有清炒、麩炒、土炒、面炒、炒炭、酒炙、醋炙、蜜炙、姜炙等多種炮制方法[3]。枳實藥性峻烈，麩炒后能緩和苦燥之性，增強健脾和胃之功[4]。枳實芍藥散中枳實為炒炭后入藥，可入血分行血中之氣滯。目前臨床使用枳實為生品或麩炒品，偶有使用清炒品[5]?！侗静菝审堋酚小安患皠t功效難求，太過則氣味反失”，體現(xiàn)了不同炮制方法對藥物化學(xué)成分的影響不同。藥對作為臨床處方用藥中相對固定的配伍形式，在方劑配伍中起到相輔相成的作用，藥對配伍比例為經(jīng)方研究的關(guān)鍵問題之一。有研究發(fā)現(xiàn)，藥對不同配伍比例對有效成分的溶出有很大影響[6-8]。研究藥對配伍比例對成分提取率的影響具有十分重要的意義。因此，不同炮制品枳實及枳實與白芍不同配伍比例對枳實芍藥散化學(xué)成分的影響值得探索。

本研究根據(jù)枳實芍藥散臨床實際使用情況，以其水煎液為研究對象，以辛弗林、蕓香柚皮苷、柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷、沒食子酸、(+)-兒茶素、芍藥苷和芍藥內(nèi)酯苷9個成分為指標(biāo)，采用HPLC考察枳實-白芍藥對不同配伍比例及枳實生品與炮制品換用對枳實芍藥散化學(xué)成分提取率的影響，以期從化學(xué)成分變化角度為解析枳實炮制原理及經(jīng)方配伍提供依據(jù)。

1 儀器與試藥

Waters e2695高效液相色譜儀（配置Waters e2695泵、Waters 2998檢測器，Empower 3數(shù)字處理軟件），沃特世公司；DFT-200型高速萬能粉碎機，浙江溫嶺市林大機械有限公司；PTHW型電熱套，上海棱標(biāo)儀器有限公司；AS系列超聲波清洗機，天津奧特賽恩斯儀器有限公司；AE240型十萬分之一電子分析天平，瑞士梅特勒-托利多公司；FA1004B型電子天平，上海精密科學(xué)儀器有限公司。

枳實飲片和白芍飲片分別購于江西省和安徽省，經(jīng)遼寧中醫(yī)藥大學(xué)王榮祥教授鑒定，分別為蕓香科植物酸橙Citrus aurantiumL.的干燥幼果和毛茛科植物芍藥Paeonia lactifloraPall.的干燥根，符合2020 年版《中華人民共和國藥典》標(biāo)準(zhǔn)。麥麩（批號160801）購于安徽省。對照品辛弗林（批號110227-200306），中國藥品生物制品檢定所；蕓香柚皮苷（批號S0808 AS）、柚皮苷（批號A0319AS）、橙皮苷（批號D1106AS），大連美侖生物技術(shù)有限公司；新橙皮苷（批號200029）、芍藥內(nèi)酯苷（批號102086），江蘇永健醫(yī)藥科技有限公司；芍藥苷（批號DSTDS007001）、沒食子酸（批號DST190715-008）、(+)-兒茶素（批號DST190628-001），樂美天醫(yī)藥/德爾特生物公司。所用對照品純度均不低于98%。甲醇、乙腈為色譜純（美國TEDIA公司），其他試劑為分析純，水為娃哈哈純凈水。

2 方法與結(jié)果

2.1 樣品制備

2.1.1 清炒枳實

稱取大小分等的枳實飲片100 g。將炒鍋加熱至約180 ℃，投入凈枳實片，快速翻動，炒至枳實表面淡黃時，立即取出，攤開晾涼[9]。

2.1.2 麩炒枳實

取大小分等的枳實飲片100 g，麥麩10～15 g。將炒鍋加熱至約180 ℃，均勻撒入麥麩即刻煙起時，投入凈枳實片，快速翻動，炒至枳實表面淡黃色、麥麩焦黑色時，立即取出，篩除炒制后的麥麩，攤開晾涼[10]。

2.1.3 炒炭枳實

取大小分等枳實飲片100 g，炒鍋加熱至約220 ℃，投入凈枳實片，翻炒至枳實表面焦黑色、內(nèi)部焦褐色，立即取出，攤開晾涼[9]。

2.2 供試品溶液制備

2.2.1 枳實生品和不同炮制品及白芍單煎液

分別精密稱取枳實生品和不同炮制品及白芍粉末（過4號篩）各約0.2 g，置于圓底燒瓶中，精密加入純凈水25 mL，加熱至沸騰后，保持微沸2 h，冷卻后過濾，精密量取續(xù)濾液5 mL于10 mL量瓶中，用純凈水定容至刻度后混勻，用0.22 μm 微孔濾膜過濾，即得。

2.2.2 枳實生品和不同炮制品與白芍合煎液

分別精密稱取枳實生品和不同炮制品與白芍粉末（過4號篩）約0.2 g，按1∶1比例混合，置于圓底燒瓶中，精密加入純凈水25 mL，加熱至沸騰后，保持微沸2 h，冷卻后過濾，精密量取續(xù)濾液5 mL于10 mL量瓶中，用純凈水定容至刻度后混勻，用0.22 μm微孔濾膜過濾，即得。

2.3 對照品溶液制備

分別精密稱取辛弗林、蕓香柚皮苷、柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷、沒食子酸、(+)-兒茶素、芍藥內(nèi)酯苷和芍藥苷對照品適量，加甲醇充分溶解并定容至刻度，制成濃度分別為0.307、1.313、1.036、0.508、0.486、0.484、0.503、0.486、0.515 mg/mL的對照品溶液。取各對照品溶液適量，制成混合對照品溶液，經(jīng)0.22 μm微孔濾膜過濾，即得。

2.4 色譜條件

采用WondaSil C18 色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm），流動相為乙腈（A）-0.1%磷酸水溶液（B），梯度洗脫（0～10 min，5%～18%A；10～25 min，18%～20%A；25～30 min，20%～25%A；30～35 min，25%～30%A），柱溫35 ℃，流速1 mL/min，檢測波長230 nm，進樣量10 μL。對照品及枳實生品和不同炮制品的枳實芍藥散色譜圖見圖1。

圖1 枳實生品和不同炮制品的枳實芍藥散9個成分HPLC圖

2.5 方法學(xué)考察

2.5.1 線性關(guān)系考察

精密吸取“2.3”項下混合對照品溶液適量，逐級稀釋成不同濃度的系列對照品溶液，按“2.4”項下色譜條件進樣測定。以對照品濃度為橫坐標(biāo)，峰面積積分值為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，9個成分線性關(guān)系考察結(jié)果見表1。各成分在相應(yīng)濃度范圍內(nèi)的線性關(guān)系良好。

表1 9個成分線性關(guān)系考察結(jié)果

2.5.2 精密度試驗

精密吸取“2.3”項下混合對照品溶液，按“2.4”項下色譜條件連續(xù)進樣6次，記錄各成分峰面積并計算其RSD。結(jié)果顯示，辛弗林、蕓香柚皮苷、柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷、沒食子酸、(+)-兒茶素、芍藥內(nèi)酯苷和芍藥苷的峰面積RSD 分別為0.90%、0.60%、0.66%、0.64%、0.80%、0.86%、0.63%、0.70%、0.65%，表明儀器精密度良好。

2.5.3 穩(wěn)定性試驗

精密稱取枳實生品和白芍粉末適量，按“2.2”項下方法制備供試品溶液，按“2.4”項下色譜條件，于制備后0、2、4、6、8、10、12、24 h進樣測定，計算各成分峰面積RSD。結(jié)果顯示，辛弗林、蕓香柚皮苷、柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷、沒食子酸、(+)-兒茶素、芍藥內(nèi)酯苷和芍藥苷峰面積的RSD 分別為0.20%、0.27%、0.13%、1.87%、1.52%、0.44%、1.37%、0.43%、0.77%，表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.5.4 重復(fù)性試驗

精密稱取6份枳實生品和白芍粉末適量，按“2.2”項下方法平行制備6份供試品溶液，按“2.4”項下色譜條件分別進樣測定，記錄各成分的峰面積并計算其RSD。結(jié)果顯示，辛弗林、蕓香柚皮苷、柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷、沒食子酸、(+)-兒茶素、芍藥內(nèi)酯苷和芍藥苷峰面積的RSD分別為0.15%、1.03%、1.41%、1.85%、2.01%、0.61%、2.43%、0.60%、1.88%，表明該方法重復(fù)性良好。

2.5.5 加樣回收率試驗

精密稱取6份已知含量的生枳實和白芍混合粉末適量，分別精密加入適量各對照品，按“2.2”項下方法制備供試品溶液，按“2.4”項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積，計算平均回收率及其RSD。結(jié)果顯示，辛弗林、蕓香柚皮苷、柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷、沒食子酸、(+)-兒茶素、芍藥內(nèi)酯苷和芍藥苷的平均加樣回收率分別為97.96%、98.68%、99.24%、98.54%、98.46%、101.50%、97.24%、98.50%、99.27%，RSD分別為0.42%、0.83%、0.55%、1.11%、0.53%、0.51%、1.07%、0.52%、0.52%，表明該方法的準(zhǔn)確度良好。

2.6 枳實-白芍不同配伍比例的枳實芍藥散樣品含量測定

分別精密稱取枳實生品和白芍粉末（過4 號篩）適量，按“2.2.2”項下方法分別制備不同配伍比例（3∶1、2∶1、1∶1、1∶2、1∶3）枳實-白芍合煎液，并按“2.4”項下色譜條件進樣測定，記錄各色譜峰面積，計算9個成分的含量，并計算提取率（該成分在總提取物中含量÷該成分所對應(yīng)藥材的取樣量），結(jié)果見表2、圖2。

表2 不同配伍比例枳實-白芍合煎液9個成分提取率比較（mg/g，n=3）

圖2 不同配伍比例枳實-白芍合煎液9個成分提取率

由表2、圖2可以看出，在不同配伍比例的枳實-白芍合煎液中，蕓香柚皮苷、橙皮苷、沒食子酸、(+)-兒茶素和芍藥內(nèi)酯苷的含量隨枳實所占比例增加而升高，推測枳實在該藥對中所占比例越大，越有助于上述5個成分溶出；當(dāng)枳實-白芍配伍比例為2∶1、1∶1、1∶2時，辛弗林、柚皮苷、新橙皮苷在水煎液中的提取率最高。

2.7 枳實生品與炮制品換用的枳實芍藥散樣品含量測定

分別取枳實生品和不同炮制品及白芍粉末適量，按“2.2”項下方法制備供試品溶液，按“2.4”項下色譜條件進樣測定，記錄各色譜峰面積，計算9個成分含量，結(jié)果枳實和白芍單煎液與枳實芍藥散中9個成分含量有一定差異，見表3。

表3 枳實生品和不同炮制品與白芍配伍前后9個成分含量測定結(jié)果（mg/g，n=3）

3 討論

枳實的主要活性成分包括生物堿和黃酮兩大類，其中以柚皮苷、橙皮苷及新橙皮苷為代表的黃酮類成分具有抑制平滑肌收縮、改善功能性消化不良大鼠胃排空及抗炎、抗氧化等作用[11-13]，是枳實破氣消積的主要活性物質(zhì)，生物堿類代表成分辛弗林為《中華人民共和國藥典》枳實的指標(biāo)成分，因此，選取蕓香柚皮苷、柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷及辛弗林含量為枳實的考察指標(biāo)。白芍中以芍藥苷為代表的單萜及其苷類具有保肝、鎮(zhèn)痛、抗抑郁、抗腫瘤等作用[14-16]，而鞣質(zhì)類成分也發(fā)揮著重要的藥理作用，因此，選取芍藥苷、芍藥內(nèi)酯苷、沒食子酸和(+)-兒茶素含量為白芍的考察指標(biāo)。

本試驗對供試品溶液進行全波長掃描，發(fā)現(xiàn)辛弗林、蕓香柚皮苷、柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷及沒食子酸在波長230 nm和283 nm處出峰均較好，芍藥苷、芍藥內(nèi)酯苷、(+)-兒茶素在波長230 nm處出峰較好，因此檢測波長確定為230 nm。同時比較了甲醇-水、乙腈-水、甲醇-2%乙酸水、甲醇-磷酸二氫鉀溶液等流動相，發(fā)現(xiàn)甲醇-水溶液分離效率較低，而乙腈-水系統(tǒng)具有較好的色譜分離效果。為有效改善部分色譜峰的拖尾現(xiàn)象，加入磷酸以提高分離度。最終確定流動相為乙腈-0.1%磷酸水溶液。

枳實與白藥配伍見于大柴胡湯、麻子仁丸、四逆散、排膿散等經(jīng)典方劑，現(xiàn)行藥品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中以枳實-白芍配伍入藥的中成藥也較多，如2020年版《中華人民共和國藥典》收載的脾胃舒丸（枳實∶白芍=1∶1）、香連化滯丸（枳實∶白芍=1∶2）、麻仁丸（枳實∶白芍=1∶1）、麻仁滋脾丸（枳實∶白芍=4∶3）等[17]。中藥化學(xué)成分復(fù)雜，配伍應(yīng)用時常發(fā)生助溶、沉淀等物理現(xiàn)象[18]，配伍后有些成分的結(jié)構(gòu)、溶出率等也會發(fā)生變化，可能影響藥物臨床治療效果。本研究建立了HPLC同時測定枳實芍藥散9個成分含量的方法，發(fā)現(xiàn)其在單煎液和枳實-白芍不同配伍比例合煎液中的提取率有一定差異，表明枳實與白芍配伍后其化學(xué)成分含量發(fā)生變化。當(dāng)配伍比例為2∶1、1∶1和1∶2時，辛弗林、柚皮苷、新橙皮苷3個主要藥效成分在水煎液中的提取率高于其他配伍比例，表明合理的配伍比例有助于成分溶出，體現(xiàn)了經(jīng)方配伍在方藥運用中的重要性。枳實-白芍不同配伍比例對肝郁脾虛型腸易激綜合征大鼠的藥效學(xué)實驗發(fā)現(xiàn)，當(dāng)枳實-白芍比例為1∶1和2∶1時，其抗抑郁、鎮(zhèn)痛、調(diào)節(jié)胃腸道功能作用較好，體現(xiàn)了古方配伍（1∶1）用藥的合理性[19-21]。

本研究發(fā)現(xiàn)，白芍與枳實配伍后化學(xué)成分發(fā)生變化：組方與單味藥白芍相比，芍藥內(nèi)酯苷、沒食子酸、(+)-兒茶素的含量增加；生品及不同炮制品之間比較，清炒枳實芍藥散中芍藥苷和(+)-兒茶素的含量高于其他樣品，而芍藥內(nèi)酯苷和沒食子酸的含量在炒炭枳實芍藥散中最高。

對比枳實生品和不同炮制品與白芍配伍前后黃酮苷類成分含量發(fā)現(xiàn)，單味藥和復(fù)方中枳實經(jīng)清炒和麩炒后柚皮苷、橙皮苷和新橙皮苷的含量增加，而炒炭后黃酮苷類成分均降低。黃酮苷類成分作為枳實增強胃腸功能的主要活性物質(zhì)，麩炒可提高黃酮苷類成分含量，保證其健脾消積作用，推測可能是麥麩在炒制過程中通過吸附等形式，將輔料中的成分傳遞至炮制品，還能吸收飲片中的部分揮發(fā)性成分，達(dá)到增強療效、緩和燥性的作用；清炒也有助于黃酮類成分的溶出，可能是炒制過程破壞了細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)，促進了成分的溶出，但長時間加熱可能會破壞其結(jié)構(gòu)，故炒制過程中應(yīng)該控制好溫度和時間。枳實與白芍配伍后枳實中黃酮苷類成分含量降低而白芍中芍藥內(nèi)酯苷、沒食子酸、(+)-兒茶素含量增加，表明與白芍配伍對白芍有效成分的溶出有促進作用，有利于增強白芍緩急止痛作用，結(jié)合枳實、白芍的性味特點發(fā)現(xiàn)，兩者藥性大致相反，配伍后能夠相反相成。同時，枳實主要活性物質(zhì)辛弗林經(jīng)清炒和麩炒后含量有所增加，但炒炭后含量大幅降低，推測為長時間高溫加熱破壞其結(jié)構(gòu)所致。另外，沒食子酸含量在炒炭枳實芍藥散中最高，可能是炒制過程中某些成分發(fā)生了分解或某些物質(zhì)的轉(zhuǎn)化使其含量增加，這與古籍中用于治療婦女產(chǎn)后氣滯、氣結(jié)血凝等煩滿不得臥相符，也證實了枳實芍藥散中枳實炒炭的合理性。

本研究從炮制與經(jīng)方配伍角度，比較枳實生品與炮制品換用的枳實芍藥散化學(xué)成分變化，詮釋古籍中運用炮制品的合理性。今后將從入血成分及其代謝情況入手開展研究，以期從體內(nèi)物質(zhì)代謝角度揭示枳實炮制原理。