肝糖異方改善肝細(xì)胞過氧化損傷致糖代謝異常的體外研究

皮亞妮，王雨露，許笑陽，徐 虹，姜 娜，王 帆，陶艷艷，趙長青，4，5

1.上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬曙光醫(yī)院肝病研究所（上海 201203）；2.杭州市紅十字會(huì)醫(yī)院消化肝病科（浙江 杭州 310003）；3.浙江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第二醫(yī)院肝病、感染性疾病科（浙江 杭州 310005）；4.上海市中醫(yī)臨床重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室（上海 201203）；5.上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬曙光醫(yī)院肝病科（上海 201203）

肝細(xì)胞在機(jī)體糖代謝中發(fā)揮重要的作用，維持血糖的相對(duì)穩(wěn)定；氧化應(yīng)激導(dǎo)致肝細(xì)胞合成、分解或貯備糖原受損，從而導(dǎo)致血糖降低或血糖升高。研究［1］顯示，減少氧化應(yīng)激是預(yù)防和治療糖代謝異常的關(guān)鍵所在。肝糖異方由扶正化瘀方（丹參、蟲草菌絲、桃仁、松花粉、絞股藍(lán)、五味子）和實(shí)脾方（黃芪、黃精、虎杖）組成，立足于“扶正化瘀”基礎(chǔ)上加強(qiáng)“實(shí)脾”，是治療肝源性糖尿病的臨床有效中藥復(fù)方。前期臨床研究［2］發(fā)現(xiàn)，肝糖異方能有效改善肝硬化合并糖尿病患者糖代謝異常，療效是對(duì)照組的2.575 倍，總有效率達(dá)到80.95 %。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，肝糖異方對(duì)肝源性糖尿病模型大鼠具有保肝和抗肝纖維化作用，并可降低血糖、糾正糖代謝異常；肝糖異方還可顯著降低肝組織丙二醛（MDA）含量和增加超氧化物歧化酶（SOD）含量，上調(diào)肝組織醌氧化還原酶1（NQO1）、血紅素氧合酶1（HO-1）和谷胱甘肽過氧化酶（GSH-PX）基因水平，提示該方具有一定的抗氧化作用。［3］有研究［4-6］顯示，抗氧化治療在防治肝損傷、改善糖代謝方面有重要作用。本研究以過氧化氫（H2O2）誘導(dǎo)大鼠肝細(xì)胞過氧化損傷模型［7-8］，探討肝糖異方調(diào)控糖原合成通路，改善氧化應(yīng)激所致糖代謝異常的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細(xì)胞 大鼠肝細(xì)胞（BRL-3A 細(xì)胞），購自中國科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院細(xì)胞庫（批號(hào)：GNR10）。

1.1.2 藥物與試劑 黃芪（批號(hào)：2016092302）、黃精（批號(hào)：2016082402）、虎杖（批號(hào)：2016092001），購于上海上藥華宇實(shí)業(yè)有限公司，提取率為26 %；扶正化瘀方浸膏粉（批號(hào)：170605），購于上海黃海制藥有限責(zé)任公司，提取率為14.31 %。鹽酸二甲雙胍（批號(hào)：11668019），購于生工生物公司。藥物配制：上述浸膏按表1 配制，稱取100 μg 溶于1 mL 二甲基亞砜（DMSO）后混勻，存儲(chǔ)濃度為100 mg/L，分裝，-20 ℃保存；使用時(shí)以無血清高糖培養(yǎng)基（DMEM）稀釋。肝糖異方浸膏粉的質(zhì)量控制采用高效液相色譜法（HPLC）檢測(cè)，各成分計(jì)算結(jié)果見表2。

表1 肝糖異方組方

表2 肝糖異方浸膏粉成分

MDA 試劑盒，上海百蕊生物科技有限公司（批號(hào)：XF01926B）；丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶（ALT）、天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶（AST）試劑盒，武漢華美公司（批號(hào)：CSB-E13024r、CSBE13023r）；活性氧（ROS）試劑盒，碧云天生物技術(shù)有限公司（批號(hào)：S0033）；糖原染色試劑盒，北京索萊寶生物科技公司（批號(hào)： G1360）；葡萄糖測(cè)試盒，南京建成生物工程研究所有限公司（批號(hào)：A154-1-1）；二辛可寧酸（BCA）法蛋白定量試劑盒，南京建成生物工程研究所有限公司（批號(hào)：A045-4）；細(xì)胞計(jì)數(shù)試劑盒-8（CCK-8）活力檢測(cè)試劑盒，日本同仁株式會(huì)社（批號(hào)：CK04）；2′，7′-二氯二氫熒光素二乙酸酯（DCFH-DA），美國MCE 公司（批號(hào)：HY-D0940）；抗磷酸化糖原合成激酶-3β（p-GSK-3β）抗體、抗磷酸化FoxO1 轉(zhuǎn)錄因子（p-FoxO1）抗體、抗β-肌動(dòng)蛋白（β-actin）抗體，美國CST 公司（批號(hào)：5558、9461、8457）；抗糖原合成激酶-3β（GSK-3β）抗體，美國Proteintech 公司（批號(hào)：22104-1-AP）；抗FoxO1 轉(zhuǎn)錄因子（FoxO1）抗體 ，英國Abcam 公司（批號(hào)：AB52857）。

1.1.3 儀器 微孔板分光光度計(jì)，美國Bio-Tek公司（型號(hào)：Bio-Tek PowerWave XS）；倒置顯微鏡，日本Olympus株式會(huì)社（型號(hào)：IX70）；電子天平，德國Sartorius公司（型號(hào)：BSA224S-CW）；全自動(dòng)數(shù)碼凝膠圖像分析系統(tǒng)，上海天能生命科學(xué)有限公司（型號(hào)：Tanon 3500）。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng) BRL-3A 細(xì)胞用含10 %胎牛血清的達(dá)爾伯克改良伊格爾（DMEM）高糖培養(yǎng)基培養(yǎng)，置于5 %CO2、37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中，根據(jù)生長狀況進(jìn)行傳代培養(yǎng)，細(xì)胞生長至約80 %融合狀態(tài)可用于實(shí)驗(yàn)。

1.3 分組與干預(yù) 實(shí)驗(yàn)設(shè)正常組、模型組、肝糖異方組、二甲雙胍組，每組設(shè)3 個(gè)復(fù)孔，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3 次。正常組加不含血清的DMEM 培養(yǎng)基；除正常組外，其余各組先以500 μmol/L 的H2O2干預(yù)30 min 誘導(dǎo)細(xì)胞過氧化損傷模型，棄上清；隨后模型組更換不含血清的DMEM，肝糖異方組與二甲雙胍組分別以肝糖異方（200 μg/L）及二甲雙胍（5 mmol/L）與細(xì)胞共孵育48 h［9］。

1.4 檢測(cè)指標(biāo)與方法

1.4.1 細(xì)胞活力 采用CCK-8 法檢測(cè)細(xì)胞活力。BRL-3A細(xì)胞以1×104個(gè)/孔接種于96孔板，培養(yǎng)24 h，設(shè)正常組、模型組、肝糖異方組、二甲雙胍組，每個(gè)濃度均設(shè)3個(gè)復(fù)孔，藥物孵育48 h，棄上清。按照CCK-8 原液∶DMEM=1∶10 的比例混勻，100 μL/孔，37 ℃、5 % CO2培養(yǎng)箱中孵育1 h，在450 nm 波長處讀取各孔的吸光度（OD）值。計(jì)算公式：細(xì)胞活力（%）=（實(shí)驗(yàn)孔-空白孔）/（對(duì)照孔-空白孔）×100%。

1.4.2 ALT、AST 活性及MDA 水平 采用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）法檢測(cè)ALT、AST 活性及MDA 水平。BRL-3A 細(xì)胞以2×105個(gè)/孔接種于6 孔板造模后，藥物干預(yù)48 h，收集細(xì)胞，超聲破碎后離心收集上清。從4 ℃冰箱中取出試劑盒，在室溫下復(fù)溫30 min，用雙蒸水將20 倍濃縮液稀釋至1 倍。配置標(biāo)準(zhǔn)品，向96 孔板中分別加入50 μL 倍比稀釋好的標(biāo)準(zhǔn)品、50 μL 各組上清，并立即加入50 μL 生一普遍物素標(biāo)記抗體，在37 ℃恒溫條件下?lián)u床孵育1 h。孵育結(jié)束后，棄去上清，用洗滌液洗滌，重復(fù)3 次。每孔加入80 μL 的辣根過氧化物酶（HPR）標(biāo)記親和素，用新的膠條覆蓋微滴定板，避光放入37 ℃的恒溫?fù)u床孵育30 min。棄去上清后用洗滌液洗滌，重復(fù)3 次。每孔加入100 μL 酶底物顯色液，37 ℃避光孵育10 min。取出酶標(biāo)板，每孔迅速加入50 μL 酶反應(yīng)停止液終止反應(yīng)。立即在450 nm 波長處測(cè)定各孔的OD 值，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品及對(duì)應(yīng)的OD 值分別計(jì)算ALT、AST活性及MDA水平。

1.4.3 ROS 水平 BRL-3A 細(xì)胞以2×105個(gè)/孔接種于6孔板造模后，藥物干預(yù)48 h。用1∶1 000 無血清培養(yǎng)液稀釋DCFH-DA濃度至10 μmol/L。棄細(xì)胞培養(yǎng)液，加入1.5 mL 稀釋好的DCFH-DA 充分覆蓋細(xì)胞。取1份不加探針的細(xì)胞設(shè)為陰性對(duì)照管。取1 份已加入探針的細(xì)胞設(shè)為陽性對(duì)照管，同時(shí)加入ROS供氫體（20～100 μmol/L）誘導(dǎo)細(xì)胞。37 ℃細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)孵育30～60 min。吸棄培養(yǎng)液，用無血清細(xì)胞培養(yǎng)液將細(xì)胞洗滌3 次，以充分去除未進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)的DCFH-DA。將各組制備成相同濃度的細(xì)胞懸液，各取100 μL 細(xì)胞懸液用酶標(biāo)儀檢測(cè)熒光強(qiáng)度，激發(fā)波長485 nm，發(fā)射波長538 nm。與對(duì)照組熒光強(qiáng)度比較，逐時(shí)間點(diǎn)檢測(cè)刺激前后熒光強(qiáng)弱，計(jì)算各組細(xì)胞內(nèi)ROS變化。

1.4.4 糖原染色及葡萄糖濃度 BRL-3A 細(xì)胞以3×104

個(gè)/孔接種于48 孔板，待細(xì)胞融合至80%，造模30 min，藥物干預(yù)48 h 后，細(xì)胞培養(yǎng)板中加入試劑盒中固定液固定10～15 min，細(xì)胞用水清洗并晾干。加入氧化劑，在室溫下氧化15～20 min。自來水沖洗2 次，再用蒸餾水浸洗2 次，并晾干。加入希夫試劑并加蓋遮光，置于室溫陰暗條件下浸染10～20 min。流水沖洗2 min。加入蘇木素染色液，復(fù)染1～2 min。清洗后晾干，封片鏡下觀察到細(xì)胞中糖原或多糖呈紫紅色，核呈藍(lán)色。

BRL-3A 細(xì)胞以8×105個(gè)/孔接種于24 孔板，培養(yǎng)24 h，設(shè)正常組、模型組、肝糖異方組、二甲雙胍組，每個(gè)濃度均設(shè)6個(gè)復(fù)孔。細(xì)胞予藥物孵育48 h后，留取細(xì)胞上清液，1 000 r/min 離心10 min，每孔加入待測(cè)樣本2.5 μL，再加入250 μL工作液，37 ℃孵育10 min，在505 nm波長處測(cè)定各孔的OD 值，檢測(cè)葡萄糖濃度。再用BCA法測(cè)定蛋白濃度進(jìn)行定量，每孔加80 μL 細(xì)胞裂解液，收集混合液，離心取上清，按照BCA 工作液A 液∶B液=50∶1配制，每孔加入200 μL 工作液，37 ℃孵育30 min，在562 nm 波長處測(cè)定各孔的OD 值，得出每組蛋白濃度。計(jì)算公式：細(xì)胞上清中葡萄糖含量（mmol/g）=細(xì)胞上清中葡萄糖濃度（mmol/L）/蛋白濃度（g/L）。

1.4.5 p-GSK-3β/GSK-3β、p-FoxO1/FoxO1 蛋白表達(dá)采用Western blot 法檢測(cè)細(xì)胞p-GSK-3 β/GSK-3 β、p-FoxO1/FoxO1 蛋白表達(dá)。3×105個(gè)/孔BRL-3A 細(xì)胞接種于10 cm培養(yǎng)皿中，藥物處理48 h結(jié)束后，棄細(xì)胞培養(yǎng)液，加入200 μL 細(xì)胞組織快速裂解液冰上裂解，12 000 r/min、4 ℃離心15 min，取上清，并用BCA法測(cè)定蛋白濃度。取20 μg總蛋白（20 μL體系），經(jīng)10 % 聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）后轉(zhuǎn)移至聚偏二氟乙烯膜（PVDF）上，以5 %胎牛血清/吐溫-磷酸鹽緩沖溶液（TPBS）室溫封閉1 h，分別加入p-GSK-3β（1∶1 000）、GSK-3β（1∶2 000）、p-FoxO1（1∶1 000）、FoxO1（1∶1 000）一抗4 ℃過夜， TPBS 清洗后加入HRP 標(biāo)記的二抗（1∶10 000）室溫孵育1 h，TPBS 清洗后加入增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光（ECL）試劑盒，按ECL 試劑盒說明進(jìn)行顯影，并以全自動(dòng)數(shù)碼凝膠圖像分析系統(tǒng)分析。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPSS 26.0統(tǒng)計(jì)軟件分析，以GraphPad Prism 9作圖。計(jì)量資料以±s表示，多組間兩兩比較采用單因素方差分析（One-Way ANOVA），兩組間比較采用snk-q檢驗(yàn)，各組與模型組比較采用Dunnett-t檢驗(yàn)。以P<0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 對(duì)細(xì)胞活力的影響 0～200 μg/L 肝糖異方可明顯促進(jìn)BRL-3A 細(xì)胞活力（P<0.05）；400 μg/L 肝糖異方可明顯抑制細(xì)胞活力，提示0～200 μg/L 肝糖異方對(duì)BRL-3A細(xì)胞無毒性，濃度≥400 μg/L時(shí)肝糖異方具有一定的毒性作用。100 μg/L 與200 μg/L 間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），但200 μg/L肝糖異方的細(xì)胞活力有升高的趨勢(shì)，因此我們選擇無毒濃度200 μg/L 作為后續(xù)研究肝糖異方的劑量。見圖1A。

圖1 不同濃度的肝糖異方及各組細(xì)胞活力比較

檢測(cè)200 μg/L 肝糖異方對(duì)500 μmol/L H2O2誘導(dǎo)BRL-3A 過氧化損傷模型的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)500 μmol/L H2O2可明顯抑制細(xì)胞活力（P<0.05）；200 μg/L肝糖異方可明顯提高模型組的細(xì)胞活力（P<0.05），5 mmol/L二甲雙胍對(duì)細(xì)胞活力有所改善但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），肝糖異方改善肝細(xì)胞活力優(yōu)于二甲雙胍（P<0.05）。見圖1B。

2.2 對(duì)肝細(xì)胞過氧化損傷的保護(hù)作用 與正常組比較，模型組ALT、AST、MDA 水平均明顯升高（P<0.05）。與模型組比較，肝糖異方組ALT、AST、MDA 水平均明顯降低（P<0.05）；二甲雙胍組ALT、AST 活性有所降低（P<0.05），MDA 含量有所降低但組間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。肝糖異方組下調(diào)ALT、AST、MDA 水平優(yōu)于二甲雙胍組（P<0.05）。見圖2。

圖2 各組ALT、AST、MDA水平比較

2.3 對(duì)氧化應(yīng)激肝細(xì)胞ROS 水平的影響 與正常組比較，模型組、肝糖異方組和二甲雙胍組ROS生成速率均明顯升高（P<0.05）；與模型組比較，肝糖異方組和二甲雙胍組ROS 生成速率均明顯降低（P<0.05）；且肝糖異方組較二甲雙胍組ROS 生成速率降低更為明顯（P<0.05）。見圖3。

圖3 各組ROS生成水平比較

2.4 對(duì)氧化應(yīng)激肝細(xì)胞糖原合成的影響 BRL-3A 細(xì)胞糖原染色結(jié)果顯示：正常組肝細(xì)胞漿中紫紅色糖原顆粒陽染明顯；模型組細(xì)胞陽染顆粒顯著減少，著色較淺；肝糖異方組肝細(xì)胞著色較模型組加深。上述提示肝糖異方可有效促進(jìn)肝細(xì)胞糖原合成。見圖4。

圖4 各組糖原染色比較（過碘酸雪夫染色，×200）

細(xì)胞上清中葡萄糖含量研究結(jié)果顯示：與正常組比較，模型組細(xì)胞上清中葡萄糖含量明顯升高（P<0.05）；與模型組比較，肝糖異方組與二甲雙胍組細(xì)胞上清中葡萄糖含量顯著下降（P<0.05）；肝糖異方組與二甲雙胍組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。見圖5。

圖5 各組細(xì)胞上清中葡萄糖含量比較

2.5 對(duì)BRL-3A細(xì)胞糖原合成信號(hào)通路的影響 與正常組比較，模型組p-GSK-3β/GSK-3β明顯降低（P<0.05）；與模型組比較，肝糖異方組和二甲雙胍組的p-GSK-3β/GSK-3β明顯升高（P<0.05）；與肝糖異方組比較，二甲雙胍組的p-GSK-3β/GSK-3β明顯升高（P<0.05）。見圖6。

圖6 各組GSK-3β磷酸化情況比較

與正常組比較，模型組的p-FoxO1/FoxO1 明顯降低（P<0.05）；與模型組比較，肝糖異方組和二甲雙胍組的p-FoxO1/FoxO1 均明顯升高（P<0.05）；與肝糖異方組比較，二甲雙胍組的p-FoxO1/FoxO1差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。見圖7。

圖7 各組FoxO1磷酸化情況比較

3 討論

肝源性糖尿病泛指繼發(fā)于各種慢性肝實(shí)質(zhì)損害的糖尿病，由于肝細(xì)胞受損導(dǎo)致胰島素抵抗及代謝異常而引起的糖代謝紊亂，也是肝硬化的重要并發(fā)癥之一［10-11］。前期研究［12］提示，肝源性糖尿病的基本病機(jī)為“脾虛、血瘀、肝郁”，針對(duì)此病機(jī)，我們建立了肝糖異方。肝糖異方由扶正化瘀方和實(shí)脾方共同組成，立足于“扶正化瘀”基礎(chǔ)上加強(qiáng)“實(shí)脾”，是治療肝源性糖尿病的臨床有效中藥復(fù)方。二甲雙胍是臨床治療糖尿病的一線藥物，具有抗氧化及控制血糖的作用，且無肝損傷報(bào)道［13-14］。研究［15］表明，氧化應(yīng)激與肝細(xì)胞損傷及肝臟糖原合成有重要關(guān)系。H2O2是一種強(qiáng)氧化劑，可以打破細(xì)胞氧化-抗氧化平衡系統(tǒng)，常用于體外氧化損傷模型的建立。已有研究［16］表明，H2O2能引起肝細(xì)胞的氧化損傷。因此，抗氧化治療在防治肝損傷、改善糖代謝方面具有重要意義。前期研究［3］表明，肝糖異方具有較好的抗氧化活性及改善糖代謝的作用。本研究采用H2O2誘導(dǎo)的BRL-3A 細(xì)胞損傷模型，探討肝糖異方改善肝細(xì)胞過氧化損傷所致糖代謝異常的作用機(jī)制。

本研究結(jié)果顯示，BRL-3A 細(xì)胞經(jīng)H2O2誘導(dǎo)后細(xì)胞活力顯著下降，而細(xì)胞培養(yǎng)液中的ALT 和AST 活力顯著升高，這表明H2O2對(duì)BRL-3A細(xì)胞具有明顯的損傷作用。200 μg/L 肝糖異方和5 mmol/L 二甲雙胍可以增加細(xì)胞活力，降低ALT 和AST 水平，對(duì)肝細(xì)胞具有一定的保護(hù)作用，且200 μg/L 肝糖異方效果優(yōu)于二甲雙胍。此外，利用CCK-8 法檢測(cè)肝糖異方單獨(dú)作用對(duì)BRL-3A細(xì)胞活性的影響，結(jié)果顯示，0～200 μg/L 肝糖異方對(duì)BRL-3A細(xì)胞無毒性，濃度≥400 μg/L時(shí)肝糖異方具有一定的毒性作用，因此本研究選擇200 μg/L 作為后續(xù)研究肝糖異方的劑量。進(jìn)一步的研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，經(jīng)H2O2損傷后BRL-3A 細(xì)胞中的MDA 和ROS 水平顯著增加，而與模型組相比，肝糖異方組和二甲雙胍組上述指標(biāo)都得到了不同程度的改善，且肝糖異方效果優(yōu)于二甲雙胍。肝糖異方可以通過降低細(xì)胞內(nèi)的ROS 水平，減少由ROS 觸發(fā)的氧化應(yīng)激造成的脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物MDA 水平的增加來抵御氧化應(yīng)激產(chǎn)生的損傷，對(duì)H2O2誘導(dǎo)的BRL-3A 細(xì)胞損傷起保護(hù)作用。另外糖原染色結(jié)果顯示，經(jīng)H2O2刺激后的肝細(xì)胞陽染顆粒顯著減少，著色較淺，肝糖異方組肝細(xì)胞著色較模型組加深。細(xì)胞上清中葡萄糖含量檢測(cè)結(jié)果顯示，經(jīng)H2O2刺激后的細(xì)胞上清中葡萄糖含量明顯升高，與模型組相比，肝糖異方組可降低細(xì)胞上清中葡萄糖含量，提示肝糖異方可有效促進(jìn)模型組糖原合成，使細(xì)胞上清中葡萄糖含量降低，進(jìn)而達(dá)到調(diào)節(jié)血糖的作用。綜上可見，肝糖異方可通過影響酶類和非酶類抗氧化物來保護(hù)肝細(xì)胞發(fā)揮重要的抗氧化及調(diào)節(jié)糖代謝的作用。

GSK-3β 是一種絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，在肝糖代謝中發(fā)揮重要作用。在正常狀態(tài)下，GSK-3β 磷酸化后活性被抑制，糖原合成酶去磷酸化活性上升，糖原合成增加，維持機(jī)體正常血糖水平［17］；當(dāng)GSK-3β過表達(dá)時(shí)則會(huì)出現(xiàn)糖耐量異常［18］。GSK-3β通過使糖原合酶（GS）磷酸化而抑制其活性，使糖原合成減少。因此通過抑制GSK-3β 的活性，使GS 活性增加，促進(jìn)細(xì)胞外葡萄糖向糖原的轉(zhuǎn)化，可以降低血糖。肝臟維持體內(nèi)血糖水平穩(wěn)定主要依靠糖原分解及糖異生。Ferrer 等［19］發(fā)現(xiàn)，可以通過上調(diào)GSK-3β 磷酸化水平增加GS 的活性來促進(jìn)糖原合成，還可以通過抑制糖原磷酸化酶來達(dá)到降血糖的作用。研究［20-21］發(fā)現(xiàn)，過量的ROS 會(huì)促進(jìn)下游GSK-3β分子通路信號(hào)表達(dá)，同時(shí)GSK-3β 也可以刺激機(jī)體產(chǎn)生氧化應(yīng)激。本研究結(jié)果顯示，與模型組相比，肝糖異方組可使p-GSK-3β/GSK-3β蛋白的表達(dá)顯著升高，提示肝糖異方可能具有通過促進(jìn)GSK-3β 磷酸化，減輕氧化應(yīng)激從而起到影響肝細(xì)胞內(nèi)糖原合成的作用。

FoxO1作為糖異生信號(hào)通路的一個(gè)重要信號(hào)分子，貫穿細(xì)胞核內(nèi)外，在細(xì)胞的增殖、凋亡、分化和抵抗氧化應(yīng)激等方面發(fā)揮重要作用。大量研究［22-23］表明，F(xiàn)oxO1 在肝臟糖脂代謝中具有重要的調(diào)控作用；其受上游磷脂酰肌醇3 激酶/Akt 信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路（PI3K/Akt）的調(diào)控，被Akt 磷酸化后出細(xì)胞核失去活性，影響下游靶基因葡萄糖-6-磷酸酶及磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶的表達(dá)，從而抑制肝臟糖異生過程，達(dá)到降低血糖的作用。研究［24］表明，通過抑制FoxO1 蛋白活性可以增強(qiáng)細(xì)胞抗氧化能力，抑制氧化應(yīng)激產(chǎn)生。本研究發(fā)現(xiàn)，與模型組相比，肝糖異方使p-FoxO1/FoxO1 的表達(dá)顯著升高，提示肝糖異方可能具有通過促進(jìn)FoxO1 磷酸化提高抗氧化能力，從而達(dá)到調(diào)控糖異生的作用。

綜上所述，肝糖異方具有較好的改善肝細(xì)胞損傷及抗氧化作用，且其改善糖代謝的作用機(jī)制可能與影響GSK-3β/FoxO1 磷酸化的糖原合成通路有關(guān)，其確切的作用機(jī)制有待于進(jìn)一步深入研究。