應(yīng)用SSR熒光標(biāo)記法構(gòu)建22個(gè)柚類品種的分子身份證

吳仕蔓 婁兵海 陳傳武 唐艷 鄧崇嶺 武曉曉

摘要：【目的】應(yīng)用熒光SSR分子標(biāo)記構(gòu)建柚類種質(zhì)分子身份證，用于品種資源鑒定。【方法】收集22 份柚類材料，篩選SSR熒光標(biāo)記引物，采用熒光毛細(xì)管電泳檢測技術(shù)分析擴(kuò)增條帶分子質(zhì)量和等位基因，獲得相應(yīng)的擴(kuò)增帶型，從而對每份柚材料進(jìn)行標(biāo)記。采用個(gè)位阿拉伯?dāng)?shù)字和小寫英文字母對不同等位基因分子質(zhì)量大小進(jìn)行編碼，再按照引物擴(kuò)增帶型數(shù)由大到小順序?qū)⒏魑稽c(diǎn)賦值編碼的數(shù)字串聯(lián)排序，構(gòu)建供試樣品的分子身份證?！窘Y(jié)果】篩選出4 對多態(tài)性較好的引物，使用這4 對引物共檢測到49 個(gè)擴(kuò)增帶型和41 個(gè)SSR等位位點(diǎn)，平均每對引物的有關(guān)帶型數(shù)12.25 個(gè)、位點(diǎn)數(shù)10.25 個(gè)?！窘Y(jié)論】通過擴(kuò)增帶型分析，構(gòu)建了22 份柚類種質(zhì)的分子身份證，包括12 條信息獨(dú)特的身份證。遺傳聚類與分子身份證分析結(jié)果一致，為柚類品種鑒定和保護(hù)提供了重要依據(jù)。

關(guān)鍵詞：柚類；種質(zhì)資源；SSR熒光標(biāo)記；分子身份證

中圖分類號：S666.3 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A 文章編號：1009-9980（2023）04-0605-10

柚是蕓香科柑橘屬多年生果樹，屬于柑橘屬3個(gè)基本種之一。柚類起源于東南亞或中國南方一帶，在中國的栽培歷史長達(dá)3000 多年，古書《呂氏春秋》記載“果之美者，云夢之柚”[1]。中國是柚類資源的起源中心和遺傳變異中心之一[2]，柚為單胚性，在長期的栽培過程中容易產(chǎn)生遺傳變異，長期以來，人類對柚的選擇和培育產(chǎn)生了數(shù)以百計(jì)的柚品種，這些品種具有不同的果實(shí)大小和品種風(fēng)味，形成豐富的種質(zhì)資源，但至今未發(fā)現(xiàn)有真正野生類型[3]。柚類種質(zhì)資源開發(fā)利用與品種鑒定具有巨大的潛力，柚類品種鑒定、分類同其他果樹一樣經(jīng)歷了形態(tài)分類[3]、孢粉學(xué)[4- 5]、同工酶[6]等傳統(tǒng)的鑒定方法。盡管柑橘可根據(jù)枝葉形態(tài)等鑒別其屬種，但柚類的形態(tài)學(xué)標(biāo)記較少，種內(nèi)品種間差異不明顯，隨著分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，以PCR 技術(shù)為代表的DNA分子標(biāo)記技術(shù)被廣泛應(yīng)用，為柚類種質(zhì)資源的鑒定、親緣關(guān)系分析和遺傳圖譜的構(gòu)建提供了良好的技術(shù)手段。其中，SSR（simple sequence repeat）為簡單序列重復(fù)，由1～6 個(gè)核苷酸重復(fù)多次的基序組成，具有信息含量高、共顯性遺傳、操作簡單、多態(tài)性高等特點(diǎn)[7]，且不受形態(tài)和環(huán)境的影響而在柑橘[8]、板栗[9]、蔓越莓[10]上得到應(yīng)用。柚類種質(zhì)豐富，遺傳多樣性低，具有較高的形態(tài)變異，所以需要更準(zhǔn)確、快速、高效的鑒定方法。

在眾多的分子標(biāo)記中，熒光標(biāo)記SSR 能精準(zhǔn)識別目標(biāo)基因DNA片段大小，精準(zhǔn)識別到只有1 bp 差異的堿基，檢測結(jié)果可靠、穩(wěn)定且準(zhǔn)確[11]。所以，熒光標(biāo)記SSR 被廣泛應(yīng)用于果樹遺傳結(jié)構(gòu)分析、品種鑒定、分子身份證構(gòu)建及品種權(quán)保護(hù)等方面的研究。隨著SSR標(biāo)記的研究，“分子身份證”逐漸被提出和應(yīng)用，使得在品種鑒別和檢索時(shí)變得更快捷。目前，通常采用熒光測序技術(shù)結(jié)合新的帶型編碼方式構(gòu)建分子身份證，該技術(shù)已成功應(yīng)用于構(gòu)建桃[12]、杏[13]、梨[14]、蘋果[15]等多種果樹的分子身份證。目前，尚未發(fā)現(xiàn)利用SSR 熒光毛細(xì)管電泳結(jié)合新的帶型編碼方式構(gòu)建柚類資源分子身份證的相關(guān)研究報(bào)道，筆者在本研究中以22 份柚類種質(zhì)為研究材料，采用SSR 熒光標(biāo)記引物，結(jié)合熒光毛細(xì)管電泳檢測技術(shù)分析擴(kuò)增條帶分子質(zhì)量和圖譜帶型方式構(gòu)建分子身份證，以期為柚類品種的鑒定和親緣關(guān)系分析提供一定的理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料

22 份柚類材料分別取自桂林市廣西特色作物研究院柑橘種質(zhì)資源保存圃、桂林市全州縣以及南寧市高明農(nóng)場，每個(gè)品種采集葉片后，保存于-80 ℃超低溫冰箱中備用。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 DNA提取及PCR 體系采用磁珠法基因組DNA提取試劑盒提取基因組DNA，并用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA提取質(zhì)量。再取2 μL DNA樣本，用NanoDROP8000 超微量分光光度計(jì)進(jìn)行檢測核酸濃度和純度檢測，將DNA統(tǒng)一稀釋成20 ng·μL-1，用于后續(xù)的PCR擴(kuò)增。

引物選自李益等[16]報(bào)道的21 對引物（表1），由武漢天一華煜基因科技有限公司合成。PCR反應(yīng)體系10 μL，包括：2 ×Taq PCR Master Mix 5.0 μL，正、反向引物（10 mol · L- 1）各0.5 μL，基因組DNA（約20ng· μL-1），超純水3.0 μL。PCR反應(yīng)程序：95 ℃預(yù)變性5 min，95 ℃變性30 s，62～52 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，循環(huán)35 次；72 ℃延伸20 min，4 ℃保存。1.2.2 毛細(xì)管電泳檢測將甲酰胺與分子質(zhì)量內(nèi)標(biāo)混合，取9 μL 混合物于上機(jī)板中，再加入1 μL 稀釋的熒光PCR 產(chǎn)物，上樣于96 通道全自動(dòng)ABI3730XL 遺傳分析儀進(jìn)行毛細(xì)管電泳。利用GeneMarker 分析軟件對原始數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，將各泳道內(nèi)分子質(zhì)量內(nèi)標(biāo)的位置與各樣品峰值的位置進(jìn)行比較，確定片段大小和基因型類別。

1.2.3 品種分子身份證構(gòu)建?對25 個(gè)樣品進(jìn)行擴(kuò)增，得到各樣品擴(kuò)增的指紋數(shù)據(jù)，將指紋數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)換為數(shù)字編碼，即分子身份證。編碼方式為：將每對引物在25 份樣品中擴(kuò)增時(shí)所產(chǎn)生的等位基因按從小到大的順序排序，然后用個(gè)位阿拉伯?dāng)?shù)字1，2，3，……，9 作為不同等位基因的代碼，等位基因數(shù)大于9 時(shí)，用a，b，c 代表第10、11、12 個(gè)等位基因，依次類推，無擴(kuò)增產(chǎn)物時(shí)用0 表示；然后，以2 位代碼對某個(gè)標(biāo)記的圖譜帶型進(jìn)行編碼，雜合帶型以2 位不同代碼編碼，純合帶型以2 位相同代碼編碼。根據(jù)各個(gè)標(biāo)記帶型數(shù)的多少，確定用于構(gòu)建分子身份證的標(biāo)記；再按照帶型數(shù)由大到小的順序，將某一供試種質(zhì)各標(biāo)記的編碼串聯(lián)，即形成8 位數(shù)字或字母表示的分子身份證[13]。

1.2.4 聚類分析?使用Cervus 軟件計(jì)算引物的多態(tài)性信息含量（polymorphism information content，PIC）和基因多樣性（gene diversity，D），將各樣品各位點(diǎn)的等位基因編碼成0，1 矩陣形式的指紋圖譜。利用GenAIex 軟件計(jì)算各個(gè)樣品間的遺傳距離（Neis genetic distance，GD），根據(jù)遺傳距離構(gòu)建進(jìn)化樹。

2 結(jié)果與分析

2.1 引物篩選

經(jīng)熒光毛細(xì)管電泳后，每對引物均獲得精確的DNA 片段大小，如引物CS5 的SSR 檢測結(jié)果（圖1）。21 對引物中，有4 對引物多態(tài)性（PIC）大于0.7，屬于高多態(tài)性位點(diǎn)；PIC 介于0.3～0.7 之間的引物有16 對，屬于中高多態(tài)性位點(diǎn)；僅有1 對引物CS3 PIC 為0.147，低于0.2，屬于低多態(tài)性位點(diǎn)，表明該基因較保守（表2）。經(jīng)篩選確定4 對引物CS5、CS7、CS12、CS18 用于后續(xù)柚類種質(zhì)分子身份證的構(gòu)建。

2.2 毛細(xì)管電泳結(jié)果

利用4 對引物對25 份品種資源進(jìn)行擴(kuò)增，共檢測到等位基因數(shù)為41 個(gè)，每個(gè)引物檢測到的等位基因數(shù)為8～11 個(gè)，平均每個(gè)引物擴(kuò)增10.25 個(gè)，其中擴(kuò)增等位基因數(shù)CS5、CS12、CS18 相同，為11 個(gè)，最少的是CS7，為8 個(gè)；擴(kuò)增片段長度在119～282 bp 之間，其中引物CS18 擴(kuò)增的基因片段較長。每個(gè)引物擴(kuò)增有效等位基因（Ne）介于4.005～5.365 之間，平均為4.484；引物多態(tài)性信息（PIC）值變化范圍為0.726～0.79，平均為0.748，其中CS5 最大，CS18 最小。4 對引物在22 份柚類種質(zhì)中共檢測基因型（帶型數(shù)）49 個(gè)，每個(gè)引物擴(kuò)增的基因型數(shù)為11～14 個(gè)，平均為12.25 個(gè)，其中CS5 最大，CS18 最小，CS7 和CS12 相同（表2，表3）。

2.3 種質(zhì)分子身份證編碼

根據(jù)熒光毛細(xì)管電泳及引物多態(tài)性信息，選擇4 對多態(tài)性（PIC＞0.7）的引物，去除多態(tài)性較低的引物，得到各樣品擴(kuò)增的指紋數(shù)據(jù)，將指紋數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)換為數(shù)字編碼，構(gòu)建22 份柚類種質(zhì)分子身份證。按照表2 的引物順序，將每個(gè)熒光標(biāo)記引物擴(kuò)增帶型數(shù)按從多到少的順序排序編碼，將每份種質(zhì)用CS5、CS7、CS12、CS18 這4 個(gè)標(biāo)記得到的等位基因編碼串聯(lián)，得到各種質(zhì)的8 位分子身份證（表4）。每個(gè)字符串的數(shù)字從左到右每2 個(gè)數(shù)字分布在同一對染色體上，對應(yīng)位置編碼相同表明該引物在不同樣品上得到了相同的擴(kuò)增帶型和等位基因。結(jié)果表明，在供試的22 份柚類資源中，得到了15 份不同類型的分子身份證代碼，其中，桂柚1 號、柚選1 號、柚選2 號與沙田柚共享一套分子身份證代碼；青皮柚與紅寶石共享一套分子身份證代碼；廣西蜜柚與紅肉蜜柚琯溪蜜柚；第2 個(gè)亞組包含19 份資源，包括沙田柚

及變異單株桂柚1 號、青柚等栽培品種和地方柚類品種。從中可以看出，在遺傳距離為0.18 時(shí)，6 個(gè)柚品種被區(qū)分開，日柚和考雅聚為一支，與越南翡翠青柚分離；而青皮柚和紅寶石聚在一起，本研究構(gòu)建的兩者的分子身份證相同，說明其親緣關(guān)系很近。在遺傳距離為0.12 處，桂柚1 號、沙田柚、柚選1 號、柚選2 號聚為一支，而與柚選3 號和柚選4 號分離，前四者共享編碼構(gòu)建的分子身份特征代碼，說明四者親緣關(guān)系很近。從聚類關(guān)系樹中可以看出，五鞭柚和囊內(nèi)柚、紅肉蜜柚和廣西蜜柚聚在一起，又與琯溪蜜柚分離，說明五鞭柚和囊內(nèi)柚、紅肉蜜柚和廣西蜜柚的基因組相似性序列相似，親緣關(guān)系很近，紅肉蜜柚、廣西蜜柚與琯溪蜜柚可能是屬于同一個(gè)柚類群。關(guān)系樹上顯示枳、檸檬、金彈單獨(dú)分支，說明SSR 熒光標(biāo)記引物具有可重復(fù)性和準(zhǔn)確性。

3 討論

SSR 熒光標(biāo)記法能精準(zhǔn)識別目標(biāo)DNA片段大小，檢測結(jié)果穩(wěn)定、準(zhǔn)確和高效，適用大批量品種的檢測分析[11，17]，已被廣泛應(yīng)用于品種鑒定和分子身份證的構(gòu)建。李益等[16]利用SSR熒光標(biāo)記篩選出21對核心引物，成功構(gòu)建了包含500 份柑橘品種的DNA指紋圖譜庫，形成了基于熒光毛細(xì)管電泳平臺的柑橘SSR分子標(biāo)記品種鑒定體系。徐雷鋒等[18]利用篩選的SSR 引物，采用熒光測序技術(shù)結(jié)合新的帶型編碼方式構(gòu)建96 份百合樣本的分子身份證。朱田田等[19]利用熒光SSR 分子標(biāo)記對甘肅省11 個(gè)當(dāng)歸（Angelica sinensis）品種（系）的194 份當(dāng)歸樣品進(jìn)行遺傳多樣性和遺傳結(jié)構(gòu)分析，表明SSR 熒光標(biāo)記檢測方法可以對目標(biāo)DNA片段進(jìn)行準(zhǔn)確檢測，結(jié)果可靠。關(guān)于柚類SSR 標(biāo)記的研究已有報(bào)道，劉冬峰等[20]利用4 對SSR 引物組合，區(qū)分18 份浙江柚類資源并構(gòu)建了浙江地方柚類資源的種質(zhì)鑒定圖；劉勇等[21]利用具有多態(tài)性的33 對SSR 引物對來自中國的122 份柚類資源進(jìn)行了分析，分為7 個(gè)組群，進(jìn)而可細(xì)分為18 個(gè)亞組，主要以三大品種群組成：沙田柚品種群、文旦柚品種群及龐大的雜種柚品種群；王旭等[22]利用21 對核心引物，篩選出17 對具有高多態(tài)性的SSR 引物對68 份柚類種質(zhì)資源親緣關(guān)系進(jìn)行分析，聚類分析結(jié)果與結(jié)構(gòu)分析結(jié)果一致，表明墊江柚系列與長壽沙田柚具有很近的親緣關(guān)系并有相同的基因型，從分子水平上說明了墊江柚系列可能屬于沙田柚類型。國外對柚類也進(jìn)行了遺傳多樣性研究，Kongsri 等[23]對泰國優(yōu)良商品品種，泰國中部、南部和北部的地方品種和國外的共53 個(gè)無性系進(jìn)行評價(jià)，結(jié)果表明利用10 個(gè)具有多態(tài)性SSR標(biāo)記的引物，共產(chǎn)生33 個(gè)等位基因，大多數(shù)柚品種，包括商業(yè)品種和雜交品種，都屬于同一類群，而本地和國外品種比商業(yè)品種更多樣化；Ahmed 等[24]利用60 個(gè)SSR標(biāo)記對柚品種進(jìn)行分子鑒定，發(fā)現(xiàn)了26 個(gè)多態(tài)性SSR 位點(diǎn)，具有77 個(gè)擴(kuò)增等位基因，結(jié)果顯示粉柚和白柚的遺傳相似系數(shù)最大，其親緣關(guān)系較近。

建立“分子身份證”，對品種鑒定、種苗和農(nóng)業(yè)生物產(chǎn)品的真?zhèn)舞b別具有重要意義。目前分子身份證的構(gòu)建已在綠豆[25]、小麥[26]、水稻[27-28]、黍子[29]、核桃[30]等上應(yīng)用。DNA指紋圖譜是構(gòu)建分子身份證的基礎(chǔ)，但指紋圖譜區(qū)別于分子身份證。目前，構(gòu)建分子身份證不同的品種采用不同的編碼方法[18，31]，筆者在本研究中采用擴(kuò)增等位基因分子質(zhì)量和結(jié)合圖譜帶型方式構(gòu)建22 份柚類資源分子身份證，在分子身份證上容易區(qū)分種質(zhì)擴(kuò)增的基因帶型是純合子還是雜合子，且這種編碼方式需要的標(biāo)記較少，形成的字符串不長。

目前，應(yīng)用分子標(biāo)記進(jìn)行柑橘品種鑒定還處于研究階段，對于親緣關(guān)系很近的柑橘品種，比如本研究的桂柚1 號是沙田柚的變異單株，兩者很難區(qū)分開；引物開發(fā)和設(shè)計(jì)的SSR 標(biāo)記引物是在已知基因組上隨機(jī)片段設(shè)計(jì)的，無法實(shí)現(xiàn)設(shè)計(jì)的引物在各條染色體上均勻分布，也不能代表整個(gè)基因組的信息。本研究形成的分子身份證能提供參考，但還不能全面的代表柚類品種的信息。因此需要結(jié)合全基因組測序等方法對品種進(jìn)行更全面的鑒定。

4 結(jié)論

本研究通過SSR熒光毛細(xì)管電泳檢測，獲得22份柚類的圖譜帶型和等位基因數(shù)據(jù)，得到了15 份不同類型的分子身份證代碼，其中12 條為信息獨(dú)特的身份證，為柚類及柑橘種質(zhì)資源鑒定和品種保護(hù)提供依據(jù)。

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