山楂葉提取物對慶大霉素誘導(dǎo)大鼠急性腎損傷的影響及機(jī)制研究

豐姝姝,高旭杰,張珂,郭雪麗,陳雯艷,范雙雙,李國玉,王航宇*,王金輝, 2

(1 石河子大學(xué)藥學(xué)院/新疆植物藥資源利用教育部重點實驗室,新疆 石河子 832002;2 哈爾濱醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院,黑龍江,哈爾濱 150081;3 深圳弘?yún)R醫(yī)藥科技有限公司,廣東 深圳 518000)

急性腎損傷(Acute kidney injury,AKI)是一種急性炎癥反應(yīng)疾病,其特征是腎功能在7天或更短的時間內(nèi)突然下降,是導(dǎo)致病情進(jìn)展為慢性腎病的危險因素,具有高發(fā)生率和死亡率[1]。許多病因與AKI的病理生理過程有關(guān),包括缺血再灌注損害、腎毒性藥物、內(nèi)源性毒素或感染[2-3]。近年來,AKI的發(fā)病率呈逐年上升趨勢。據(jù)調(diào)查顯示,全世界每年大約有1300萬急性腎損傷患者,死亡人數(shù)也達(dá)到了170萬[4-5]。然而,迄今為止,還沒有針對AKI的特效藥物,因此,尋找有效的AKI治療方法備受關(guān)注。

山楂葉為薔薇科(Rasaceae)山楂屬(CrataegusL.)植物山楂(CrataeguspinnatifidaBge.)的干燥葉。現(xiàn)代藥理學(xué)研究表明,山楂葉提取物有降糖、降脂、抗炎、抗氧化等多種藥理活性[6-8]。近年來,研究者們對山楂葉的關(guān)注大多集中于心血管疾病方面,但在腎損傷方面的研究很少[9-10]。周其其等[11]研究發(fā)現(xiàn)山楂葉類黃酮可通過抗氧化和抗炎作用緩解高脂血癥造成的腎損傷。因此,本研究探討山楂葉提取物對慶大霉素所致AKI大鼠的影響及作用機(jī)制,為山楂葉治療AKI的藥用前景提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物

健康清潔級雄性Sprague-Dawley(SD)大鼠48只,購自鄭州市惠濟(jì)區(qū)華興實驗動物養(yǎng)殖場,體重220±20 g,動物質(zhì)量合格證號:SCXK(豫)2019-0002。本實驗由石河子大學(xué)醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院實驗動物倫理委員會批準(zhǔn)。

1.1.2 實驗儀器

N-1100旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(上海愛朗儀器有限公司),TGL-16臺式低速離心機(jī)(上海安亭科學(xué)儀器廠),Therrno 3001全自動多功能酶標(biāo)儀(美國Thermo),Axio Imager A蔡司正置熒光顯微鏡(北京博瑞斯科技有限公司),DYY-6C電泳儀(北京六一生物科技有限公司),EC3510化學(xué)發(fā)光檢測成像系統(tǒng)(美國UVP公司)。

1.1.3 實驗試劑

山楂葉:采集于新疆林業(yè)科學(xué)院,鹽酸維拉帕米緩釋片(1127762):AbbVie Deutschland GmbH& Co.KG,硫酸慶大霉素注射液(01Y06011 C2):宜昌人福藥業(yè),一氧化氮合成酶(Nitric Oxide Synthase,NOS,20210604)、谷胱甘肽過氧化物酶(Glutathione Peroxidase,GSH-PX,20210608)、丙二醛(Malondialdehyde,MDA,20210609)、總蛋白定量測定試劑盒(The total protein assay kit,20210610)、總超氧化物歧化酶(Superoxide Dismutase,SOD,20210609)、一氧化氮(Nitric Oxide,NO,20210531)、溶菌酶(Lysozyme,LZM,20210604)、β-N-乙酰氨基葡萄糖苷酶(β-N-acetyl-glucosaminidase,NAG,20210416)試劑盒:南京建成生物工程研究所,P-ERK1/2抗體(BM5446):武漢博士德公司,P-p38 MAPK(4631S)、P-JNK(4668S)抗體:Cell Signaling technology公司,β-actin(TA-09)、山羊抗小鼠(127655)、山羊抗兔(129256)抗體:北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 山楂葉提取物的制備

干燥山楂葉分別加入10倍量與8倍量的95%乙醇進(jìn)行回流提取,每次提取時間為2 h,濾液濃縮成浸膏備用。

1.2.2 AKI動物模型

大鼠腹腔注射慶大霉素(100 mg·kg-1),連續(xù)7 d,于末次注射24 h后,大鼠眼眶靜脈叢取血,血清測定SCR和BUN含量,然后收集大鼠24 h內(nèi)的尿液,測定LZM和NAG含量,判斷AKI模型是否建立成功。

1.2.3 動物分組及給藥

將AKI大鼠隨機(jī)分為模型組,山楂葉提取物低劑量組(0.5 g·kg-1),山楂葉提取物中劑量組(1 g·kg-1),山楂葉提取物高劑量組(2 g·kg-1)及陽性藥組(維拉帕米,15 mg·kg-1),空白組和模型組給予生理鹽水口服,其余組大鼠給予相應(yīng)藥物溶液口服,連續(xù)14 d。

1.3 觀察指標(biāo)及方法

1.3.1 腎體指數(shù)

實驗動物末次口服給藥24 h后,收集大鼠兩側(cè)腎組織,用生理鹽水沖去表面血漬,濾紙擦干,記錄重量,并計算腎體指數(shù)。

1.3.2 腎組織病理學(xué)

將固定于10%甲醛溶液48 h的腎組織浸入石蠟中,切片后,進(jìn)行HE染色,使用光學(xué)顯微鏡拍照并觀察。

1.3.3 腎功能指標(biāo)

實驗動物末次口服給藥24 h后,腹主動脈取血,離心制備血清,測定SCR和BUN含量。

1.3.4 炎癥因子

取大鼠右腎適量組織剪碎,加入預(yù)冷的生理鹽水,制成10%腎組織勻漿。在4 ℃下離心得上清液,按ELISA試劑盒操作說明書,測定IL-1β、IL-6、TNF-α及KIM-1的含量。

1.3.5 氧化應(yīng)激水平

10%腎組織勻漿上清用于大鼠NO、MDA、SOD、NOS及GSH-PX含量的測定。

1.3.6 腎組織P-p38 MAPK、P-ERK、P-JNK蛋白的表達(dá)

用RIPA裂解緩沖液(含0.1% PMSF)提取腎組織蛋白質(zhì)。通過SDS-PAGE分離等量的蛋白樣品,并將目的蛋白電轉(zhuǎn)到PVDF膜上。經(jīng)封閉液封閉1.5 h,和P-p38(1∶800)、P-ERK(1∶1 000)、P-JNK(1∶1 000)的抗體在4 ℃下孵育過夜,然后與山羊抗兔抗體孵育1.5 h,滴加ECL試劑,UVP拍照,Image J軟件計算灰度值。

1.3.7 統(tǒng)計學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 大鼠AKI模型的建立

與空白組大鼠相比,AKI大鼠尿液中LZM和NAG酶活性顯著升高(P<0.01),血清中BUN和SCR含量顯著升高(P<0.01)。表明已成功建立大鼠AKI模型(圖1)。

與空白組相比##P<0.01。圖1 AKI模型組大鼠尿液NAG、LZM水平及血清BUN、SCR水平

2.2 山楂葉提取物對AKI大鼠腎外觀和腎體指數(shù)的影響

實驗動物解剖取材后,觀察大鼠腎組織的外觀。模型組大鼠腎臟組織明顯腫大,并且泛白,經(jīng)山楂葉提取物的處理后,腎腫大現(xiàn)象有所改善,并且顏色逐漸鮮紅。計算腎臟系數(shù),如圖2所示,與空白組相比,模型組大鼠腎臟系數(shù)升高顯著(P<0.01),山楂葉提取物呈劑量依賴性地降低這種上升趨勢。以上結(jié)果說明,山楂葉提取物能夠改善AKI大鼠腎臟的腫大情況,從而保護(hù)腎臟。

A: 空白組;B: 模型組;C: 山楂葉提取物低劑量組;D: 山楂葉提取物中劑量組;E: 山楂葉提取物高劑量組;F: 維拉帕米組;與空白組相比##P<0.01;與模型組相比*P<0.05。圖2 山楂葉提取物對AKI大鼠腎外觀及腎體指數(shù)的影響

2.3 山楂葉提取物對AKI大鼠腎組織損傷程度的影響

為了確定山楂葉提取物是否對慶大霉素誘導(dǎo)的AKI有保護(hù)作用,我們檢查了大鼠腎臟組織的病理改變,結(jié)果如圖3所示?？瞻捉M大鼠腎小管細(xì)胞擺列緊密,腎小球、腎小管形態(tài)正常;模型組大鼠腎臟結(jié)構(gòu)明顯被破壞,空泡增多,腎小管擴(kuò)張,腎小管排列紊亂;與模型組相比,山楂葉提取物治療后大鼠腎損傷的組織學(xué)特征逐漸改善,其中山楂葉提取物高劑量組效果最好。

A: 空白組;B: 模型組;C: 山楂葉提取物低劑量組;D: 山楂葉提取物中劑量組;E: 山楂葉提取物高劑量組;F: 維拉帕米組。圖3 腎組織H&E染色(200×)

2.4 山楂葉提取物對AKI大鼠血清BUN和SCR的影響

通過測量大鼠血清BUN和SCR含量評估腎功能。結(jié)果如圖4所示,與空白組相比,模型組大鼠血清BUN和SCR含量升高,差異具有顯著性(P<0.01);與模型組相比,山楂葉提取物能呈劑量依賴性地降低BUN和SCR的含量,且中劑量和高劑量組效果顯著(P<0.05或P<0.01)。

與空白組相比##P<0.01;與模型組相比*P<0.05,**P<0.01。圖4 山楂葉提取物對AKI大鼠血清中BUN(圖A)和SCR(圖B)的影響

2.5 山楂葉提取物對AKI大鼠腎組織IL-1β、IL-6、TNF-α及KIM-1的影響

AKI與全身和腎內(nèi)炎癥有關(guān),炎癥反應(yīng)會降低腎功能,并促進(jìn)晚期慢性腎病的發(fā)展。因此我們測定了炎癥因子的表達(dá)。結(jié)果如圖5所示,與空白組相比,模型組大鼠腎組織IL-1β、IL-6、TNF-α及KIM-1的含量顯著升高(P<0.05或P<0.01);與模型組相比,治療組大鼠腎組織IL-1β、IL-6、TNF-α及KIM-1的含量均有不同程度的降低(P<0.05或P<0.01),其中山楂葉提取物高劑量組顯著降低(P<0.01)。說明山楂葉提取物可以降低AKI大鼠炎癥因子水平,改善腎損傷。

與空白組相比##P<0.01;與模型組相比*P<0.05,**P<0.01。圖5 山楂葉提取物對AKI大鼠腎組織中IL-1β、IL-6、TNF-α及KIM-1的影響

2.6 山楂葉提取物對AKI大鼠腎組織NO、MDA、SOD、NOS及GSH-PX含量的影響

結(jié)果如圖6所示,模型組大鼠腎組織NO、MDA、NOS含量顯著上升(P<0.01),SOD和GSH-PX含量顯著下降(P<0.01)。而山楂葉提取物治療后,與模型組大鼠比較,腎組織NO、MDA、NOS含量顯著下降(P<0.05或P<0.01),SOD和GSH-PX含量上升,高劑量組效果顯著(P<0.05或P<0.01)。因此,山楂葉提取物能夠通過抗氧化途徑來抑制AKI引起的氧化/抗氧化失衡。

與空白組相比##P<0.01;與模型組相比*P<0.05,**P<0.01。圖6 山楂葉提取物對AKI大鼠腎組織中NO、MDA、SOD、NOS、GSH-PX含量的影響

2.7 山楂葉提取物對大鼠腎臟P-p38 MAPK、P-ERK1/2、P-JNK蛋白表達(dá)的影響

為了進(jìn)一步探索山楂葉提取物在AKI中的作用機(jī)制,使用Western Blot試驗方法對P-p38 MAPK、P-ERK1/2、P-JNK蛋白表達(dá)含量進(jìn)行檢測。結(jié)果如圖7所示,與空白組相比,模型組大鼠腎組織P-p38 MAPK、P-ERK1/2、P-JNK蛋白表達(dá)水平顯著增加(P<0.05或P<0.01);與模型組相比,山楂葉提取物組大鼠腎組織P-p38 MAPK、P-ERK1/2、P-JNK蛋白表達(dá)水平降低(P<0.05或P<0.01),且山楂葉提取物高劑量組和陽性藥組的蛋白表達(dá)量接近空白組。

3 討論

慶大霉素是一種強(qiáng)效氨基糖苷類抗生素,在臨床上主要用于治療革蘭氏陰性菌感染,但因為其能導(dǎo)致嚴(yán)重的腎毒性,因此限制了慶大霉素的臨床應(yīng)用[12-13]。黃酮類化合物是山楂葉中的主要成分,對肝、腎損傷及心肌缺血具有保護(hù)作用,具有極高的研究價值[14]。本實驗通過建立AKI模型后給予山楂葉提取物口服給藥,以探討山楂葉提取物對慶大霉素所致AKI的影響。

慶大霉素引起的腎功能惡化表現(xiàn)為BUN和CR水平升高超過正常范圍,KIM-1和NAG的含量發(fā)生顯著變化。BUN主要經(jīng)腎小球濾過,BUN的升高在一定程度上可以反應(yīng)腎小球濾過功能的降低;實驗結(jié)果顯示,注射慶大霉素7 d后的大鼠尿液NAG、LZM含量及血清BUN、SCR水平較空白組相比,均顯著性升高,提示成功建立AKI大鼠模型,這與先前的研究一致。隨后AKI大鼠給予山楂葉提取物進(jìn)行干預(yù),病理學(xué)觀察顯示,空白組大鼠腎小管、腎小球形態(tài)正常;模型組大鼠腎小管擴(kuò)張,腎組織結(jié)構(gòu)破壞,損傷嚴(yán)重,且模型組大鼠血清BUN、CR含量較空白組顯著上升;山楂葉提取物低、中、高劑量組大鼠較模型組相比,腎組織損傷有所減輕,BUN和SCR含量降低,說明山楂葉提取物能夠改善腎組織病變,減輕慶大霉素導(dǎo)致的大鼠急性腎損傷。

氧化應(yīng)激與慶大霉素誘導(dǎo)的腎毒性的發(fā)病機(jī)制密切相關(guān)?；钚匝?ROS)的增加在慶大霉素引起的腎小管損傷的病理過程中扮演著重要的角色。當(dāng)機(jī)體內(nèi)氧化應(yīng)激反應(yīng)過強(qiáng),不在機(jī)體的可調(diào)控范圍內(nèi)時,過多的氧化物質(zhì)會蓄積,導(dǎo)致各器官發(fā)生損傷。SOD和GSH是機(jī)體內(nèi)重要的抗氧化防御系統(tǒng)成員,對機(jī)體維持氧化平衡有重要意義;而MDA是脂質(zhì)過氧化代謝產(chǎn)物,可以間接反映機(jī)體的氧化應(yīng)激水平[15-16]。同時,ROS的過度產(chǎn)生會導(dǎo)致炎性細(xì)胞因子包括IL-1β、IL-6、TNF-α的表達(dá)增加[17]。與空白組相比,注射慶大霉素的大鼠腎臟中的MDA水平,NO和NOS含量顯著增加,而抗氧化酶(GSH、SOD)含量顯著降低。山楂葉提取物可拮抗這些改變,表明山楂葉提取物可改善慶大霉素誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激與炎癥反應(yīng)。

先前的研究已表明MAPK通路與氧化應(yīng)激、細(xì)胞凋亡和炎癥的調(diào)節(jié)顯著相關(guān),且氧化應(yīng)激可能會誘導(dǎo)MAPK信號通路的激活[18-19]。因此,抑制氧化應(yīng)激和MAPK通路的藥物對AKI具有治療潛力。MAPK信號通路是細(xì)胞內(nèi)信號傳導(dǎo)的重要途徑,參與調(diào)控了細(xì)胞的增殖、分化和凋亡等生理病理學(xué)過程,主要相關(guān)效應(yīng)蛋白包括p38、ERK和JNK[20]。本研究發(fā)現(xiàn),山楂葉提取物可以抑制p38、ERK和JNK蛋白的磷酸化水平來減少細(xì)胞因子的產(chǎn)生,從而減弱慶大霉素誘導(dǎo)的炎癥損傷。

綜上所述,本研究表明山楂葉提取物能有效降低慶大霉素誘導(dǎo)的AKI大鼠的SCR和BUN水平,明顯減輕其腎臟病理損傷,通過抑制腎臟中IL-1β、IL-6、TNF-α的含量來達(dá)到抗炎的作用,其保護(hù)機(jī)制可能與改善氧化應(yīng)激,調(diào)控MAPK信號通路,下調(diào)P-p38 MAPK、P-ERK1/2和P-JNK的表達(dá),從而減輕炎癥反應(yīng),改善腎損傷,但其具體分子作用機(jī)制需后續(xù)進(jìn)一步研究。