嗜水氣單胞菌外膜蛋白AHA2991的原核表達(dá)、純化與免疫原性研究

簡(jiǎn)思杰,晁 嘉,孫 薇,陳春琳,陸 娟,劉 勇,劉 祥

(1. 阜陽(yáng)師范大學(xué)生物與食品工程學(xué)院, 安徽 阜陽(yáng) 236037;2. 陜西理工大學(xué)生物科學(xué)與工程學(xué)院/中德天然產(chǎn)物研究所,陜西 漢中 723001)

【研究意義】嗜水氣單胞菌(Aeromonashydrophila)屬于氣單胞菌屬(Aeromonas),是革蘭氏陰性菌,廣泛分布于水生環(huán)境,是魚(yú)類(lèi)細(xì)菌性敗血癥的主要病原菌。其可危害鰱魚(yú)(Hypophthalmichthysmolitrix)、鯽魚(yú)(Cruciancrap)、鯉魚(yú)(Cyprinuscarpio)、草魚(yú)(Ctenopharyngodonidellus)等經(jīng)濟(jì)型淡水魚(yú)類(lèi)[1]。嗜水氣單胞菌毒力強(qiáng)、病程短、致死率高,感染后主要表現(xiàn)為腹腔水腫、潰瘍和局部感染等[2]。這不僅造成水產(chǎn)養(yǎng)殖戶(hù)巨額損失,且阻礙了我國(guó)水產(chǎn)行業(yè)的發(fā)展。目前該病原菌防治主要以抗生素治療為主,但抗生素濫用易導(dǎo)致細(xì)菌耐藥性、環(huán)境污染等問(wèn)題[3];飼料中維生素與中草藥的添加雖會(huì)提高魚(yú)類(lèi)抗菌力,但防治效果不明顯;益生素的使用能夠提高一部分魚(yú)類(lèi)的自身免疫力,但適用范圍并不廣泛[4]。而主動(dòng)疫苗作為一種有效且環(huán)保的防治方法,目前已獲得人們的廣泛關(guān)注?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】外膜是革蘭氏陰性菌的獨(dú)有膜系統(tǒng)[5],而外膜蛋白(Outer membrane protein, OMP)在革蘭氏陰性菌外膜系統(tǒng)中發(fā)揮著重要的生物學(xué)功能,其暴露的抗原決定簇也可使外膜蛋白極易被免疫系統(tǒng)識(shí)別,從而激發(fā)機(jī)體的特異性免疫[6]。目前,已有大量外膜蛋白使機(jī)體產(chǎn)生免疫保護(hù)作用的研究,例如Zhang等[7]對(duì)嗜水氣單胞菌外膜蛋白OmpF與OmpK進(jìn)行了免疫學(xué)分析,通過(guò)對(duì)歐洲鰻鱺(Anguillaanguilla)進(jìn)行免疫及攻毒,結(jié)果表明OmpF與OmpK對(duì)歐洲鰻鱺的保護(hù)率分別為35.5%、70.0%;榮娜等[8]構(gòu)建嗜水氣單胞菌外膜蛋白P5大腸桿菌表達(dá)菌株,發(fā)現(xiàn)攻毒后外膜蛋白P5對(duì)紅鯽的保護(hù)率為69%?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】嗜水氣單胞菌外膜蛋白AHA2991為外排蛋白,可從細(xì)胞內(nèi)排出抗生素等毒性因子,是導(dǎo)致細(xì)菌耐藥性的重要外膜蛋白[9]。但目前關(guān)于嗜水氣單胞菌外膜蛋白AHA2991的免疫原性研究未見(jiàn)報(bào)道。【擬解決的關(guān)鍵問(wèn)題】本研究選取嗜水氣單胞菌外膜蛋白AHA2991進(jìn)行原核表達(dá)并確定最佳誘導(dǎo)條件,Western blotting檢測(cè)AHA2991紅鯽血清的特異性與效價(jià),ELISA模擬紅鯽血漿與嗜水氣單胞菌的體外相互識(shí)別作用,酸性、堿性磷酸酶測(cè)定與細(xì)胞吞噬作用評(píng)價(jià)非特異性免疫,組織病理學(xué)切片探究免疫AHA2991對(duì)紅鯽內(nèi)臟的影響,為嗜水氣單胞菌疫苗的研發(fā)奠定理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株及供試動(dòng)物 嗜水氣單胞菌 ATCC ATCC 7966、EscherichiacoliDH5a、BL21菌株及pET-32a質(zhì)粒由陜西理工大學(xué)中德天然產(chǎn)物研究所保存;紅鯽購(gòu)買(mǎi)自漢中市水族館。

1.1.2 主要試劑rTaq聚合酶、EXTaq聚合酶、T4-DNA連接酶、內(nèi)切酶BamH Ι及XhoⅠ購(gòu)自日本TaKaRa 公司;細(xì)菌基因組提試劑盒取購(gòu)自北京天根試劑公司,質(zhì)粒提取試劑盒、膠回收試劑盒購(gòu)自杭州博日公司;四甲基聯(lián)苯胺(Tetramethylbenzidine, TMB)顯色液為上海生工公司產(chǎn)品;辣根過(guò)氧化物酶(Horseradish peroxidase, HRP)標(biāo)記山羊抗大鼠免疫球蛋白G(Immunoglobulin G, IgG)購(gòu)于Sigma公司;堿性磷酸酶(Alkaline phosphatase, AKP)、酸性磷酸酶(Acid phosphatase, ACP)試劑盒購(gòu)自南京建成生物工程研究所;弗氏完全佐劑、不完全佐劑購(gòu)自MP生物醫(yī)療公司;引物合成、基因測(cè)序由西安奧科生物公司提供;大鼠抗魚(yú)血清為實(shí)驗(yàn)室自制。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 生物信息學(xué)分析 從NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中下載不同菌株與AHA2991相同家族的氨基酸序列,GeneDoc軟件生成序列對(duì)比圖,MEGA軟件繪制系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)。

1.2.2 重組質(zhì)粒pET-32a-AHA2991的構(gòu)建 NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中查找嗜水氣單胞菌 ATCC7966 全基因組,根據(jù)全基因組設(shè)計(jì)AHA2991的擴(kuò)增引物:SensePrimer: AGAGGATCCATGACGATGTACCACTTA,Anti-sense Primer: ACACTCGAGTCAGCTGCGATCGCT CC(劃線部分為酶切位點(diǎn));擴(kuò)增模板為嗜水氣單胞菌全基因組;利用Taq聚合酶擴(kuò)增,體系為50 μL。預(yù)變性溫度、退火溫度與退火時(shí)間分別為94 ℃、55 ℃、90 s;對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行電泳鑒定并切膠回收;使用BamH Ι 與XhoⅠ對(duì)PCR產(chǎn)物與pET-32a質(zhì)粒進(jìn)行雙酶切;通過(guò)T4-DNA 連接酶將目的片段與載體在16 ℃下連接16～18 h。將連接后的產(chǎn)物轉(zhuǎn)化入E.coliDH5α中,轉(zhuǎn)化成功后可提取構(gòu)建好的重組質(zhì)粒。利用雙酶切與基因測(cè)序鑒定,最后將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化入E.coliBL21中,進(jìn)行相應(yīng)蛋白的原核表達(dá)。

1.2.3 重組蛋白的表達(dá)與純化 挑取單菌落培養(yǎng)8～12 h,1∶100轉(zhuǎn)接至含氨芐青霉素的培養(yǎng)基中培養(yǎng)3～4 h,0.1 mol/L 異丙基-β-D-硫代半乳糖苷(Isopropyl-β-D-thiogalactopyranoside, IPTG)誘導(dǎo)8 h。取1 mL菌液并離心收菌,加入300 μL 2×SDS上樣緩沖液后沸水浴2 min,SDS-PAGE電泳檢測(cè)目的蛋白的表達(dá)。重組蛋白的純化具體步驟如下:以1∶100的比例將過(guò)夜培養(yǎng)的表達(dá)菌液轉(zhuǎn)接至600 mL LB培養(yǎng)液(Amp+)中;培養(yǎng)至OD600=0.5時(shí),加入600 μL 0.1 mol/L IPTG,誘導(dǎo)8 h;4000 r/min離心10 min,收集誘導(dǎo)菌體,進(jìn)行超聲破碎,超聲結(jié)束后 8000 r/min離心10 min,收集包涵體;將包涵體反復(fù)洗滌后進(jìn)行SDS-PAGE電泳;將目標(biāo)條帶切下研磨至無(wú)凝膠碎片,用蛋白浸提液重懸,室溫輕搖2 h;4 ℃、8000 r/min離心20 min,收集上清,加入4倍體積預(yù)冷丙酮,-20 ℃過(guò)夜沉淀;將沉淀后的蛋白離心,收集沉淀用無(wú)菌水溶解,測(cè)量濃度并凍干。

1.2.4 重組蛋白表達(dá)條件的優(yōu)化 以L9(34)正交實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ?表1)確定目的蛋白的最佳表達(dá)條件。步驟簡(jiǎn)要如下:將過(guò)夜培養(yǎng)的蛋白表達(dá)菌液以1∶200的比例接入600 mL培養(yǎng)液中,培養(yǎng)至設(shè)定的OD600值;按照表中要求加入不同濃度的IPTG,每組進(jìn)行3次重復(fù)。取1 mL誘導(dǎo)菌液,離心收菌后菌體加入300 μL 2×SDS蛋白上樣緩沖液,沸水浴2 min,SDS-PAGE電泳獲得不同誘導(dǎo)條件下的AHA2991蛋白表達(dá)圖譜。通過(guò)軟件Phoretix 1D和SPSS對(duì)表達(dá)圖譜進(jìn)行分析。

表1 蛋白表達(dá)條件正交試驗(yàn)的因子與水平Table 1 Factors and levels of orthogonal test for protein expression condition

1.2.5 AHA2991紅鯽多克隆抗體制備 紅鯽飼養(yǎng)時(shí),每天換水1/3,2 d喂食1次。經(jīng)過(guò)7 d適應(yīng)性飼養(yǎng),體表健康無(wú)損傷。實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組各15尾,采用腹腔注射法進(jìn)行免疫,實(shí)驗(yàn)組注射外膜蛋白AHA2991,對(duì)照組注射生理鹽水。免疫程序如下:純化的重組外膜蛋白以魚(yú)體重2 μg/g的劑量與等體積弗氏不完全佐劑充分乳化進(jìn)行首次免疫,每尾50 μL。14 d后,采用相同的蛋白量進(jìn)行免疫,加強(qiáng)免疫紅鯽。7 d后,紅鯽經(jīng)尾靜脈取血,血液于4 ℃靜置待血清自然析出,4 ℃、3000 r/min離心10 min,收集抗血清于-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.6 蛋白免疫后紅鯽血清抗體的特異性檢測(cè) 采用Western blotting夾心法驗(yàn)證紅鯽抗血清特異性,步驟簡(jiǎn)述如下:嗜水氣單胞菌全蛋白進(jìn)行SDS-PAGE電泳;將所獲得的蛋白條帶轉(zhuǎn)于硝酸纖維素(Nitrocellulose, NC)膜上,轉(zhuǎn)膜條件為:80 V,1 h;轉(zhuǎn)膜結(jié)束后,將NC膜置于脫脂牛奶中4 ℃過(guò)夜封閉;將封閉結(jié)束的NC膜與不同稀釋倍數(shù)(1∶100、1∶200、1∶400、1∶800、1∶1600、1∶3200)的紅鯽抗血清于37 ℃孵育40 min,TBST溶液洗滌3次,每次10 min;再與大鼠抗紅鯽血清(1∶400)孵育,具體步驟同上;最后與山羊抗大鼠抗體(1∶3000)孵育,洗滌后DAB顯色確定紅鯽抗血清的特異性。

1.2.7 酸性、堿性磷酸酶免疫指標(biāo)的測(cè)定 本試驗(yàn)采用南京建成生物工程研究所試劑盒進(jìn)行測(cè)定,嚴(yán)格按說(shuō)明書(shū)步驟進(jìn)行。

1.2.8 體外細(xì)胞吞噬實(shí)驗(yàn) 取免疫AHA2991后紅鯽血漿200 μL與1%甲醛生理鹽水滅活的金黃色葡萄球菌(6×108CFU)均等混合,25 ℃水浴60 min(每10 min振蕩混勻1次);反應(yīng)結(jié)束后制作血涂片,用快速姬姆薩染色試劑盒(上海生工)進(jìn)行染色,在顯微鏡(油鏡)下對(duì)吞噬細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)。

1.2.9 體外模擬魚(yú)血漿與嗜水氣單胞菌的相互識(shí)別作用 ELISA[10]檢測(cè)魚(yú)血漿與嗜水氣單胞菌的相互作用。具體步驟簡(jiǎn)述如下:嗜水氣單胞菌培養(yǎng)至OD600約1.0后將菌體離心并洗滌;菌體OD600調(diào)整至1.0(菌濃度109cfu/mL),分裝菌體每管150 μL,與不同稀釋倍數(shù)的血漿(1∶100、1∶200、1∶400、1∶800、1∶1600、1∶3200)37 ℃條件下孵育90 min,對(duì)照為陰性血漿。再與1∶400的大鼠抗魚(yú)血清孵育90 min;最后與1∶300山羊抗大鼠抗體孵育1 h。將洗滌好的菌體與20 μL PBS混合后加入酶標(biāo)板,加入200 μL的TMB顯色液;50 μL 2 mol/L H2SO4終止反應(yīng),450 nm讀數(shù)。

1.2.10 病理切片觀察AHA2991蛋白免疫對(duì)紅鯽內(nèi)臟的影響 取腎、脾、腸為病理學(xué)組織切片材料。病理切片主要有3個(gè)步驟,即組織包埋、組織切片和H&E染色。①組織包埋:將組織立即浸泡在改良的Davidson’s[11]固定液中,固定18～24 h后轉(zhuǎn)入10%甲醛溶液中繼續(xù)固定24 h;將固定好的組織于梯度濃度(80%、90%、95%、100%)的乙醇中脫水,再放入二甲苯中透明;將透明好的組織于60 ℃的石蠟中充分浸蠟,再包埋于折疊好的模具中。②切片:將包埋好的組織修正成約1 cm2的立方體,石蠟切片機(jī)切成厚度為4 μm的切片,附著于載玻片上,烘干。③H&E染色:使用蘇木素與伊紅進(jìn)行染色。烘干的切片放入二甲苯中脫蠟、乙醇中復(fù)水;蘇木素染色30 s,使細(xì)胞核上色,伊紅染色20 min,使細(xì)胞質(zhì)著色。于梯度濃度的乙醇中脫水,在二甲苯中透明,最后用中性樹(shù)脂封片即可。

1.3 數(shù)據(jù)處理

實(shí)驗(yàn)結(jié)果以平均值 ± 標(biāo)準(zhǔn)差表示,以Microsoft Office Excel 2019進(jìn)行數(shù)據(jù)計(jì)算,采用SPSS Statistics 26軟件進(jìn)行單因素方差分析,用GraphPad Prism 8.0.1軟件繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 AHA2991同源性與系統(tǒng)發(fā)育分析

研究結(jié)果表明,AHA2991蛋白家族在不同菌株間具有同源性(圖1),以MEGA軟件構(gòu)建的進(jìn)化樹(shù)顯示,嗜水氣單胞菌與達(dá)氏氣單胞菌(Aeromonasdhakensis)親緣關(guān)系接近,且不同種菌株間也有一定的親緣關(guān)系(圖2)。因而,AHA2991免疫動(dòng)物產(chǎn)生的抗體可能對(duì)不同種屬的細(xì)菌感染有交叉免疫保護(hù)作用。

圖1 氨基酸序列比對(duì)Fig.1 Sequence alignment of amino acid

圖2 系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)Fig.2 Phylogenetic tree

2.2 重組質(zhì)粒的構(gòu)建及蛋白表達(dá)純化

PCR擴(kuò)增AHA2991基因如圖3-A所示,在1500 bp左右處呈現(xiàn)單一且清晰的條帶,與理論值相同;重組質(zhì)粒pET-32a-AHA2991經(jīng)過(guò)BamH Ι與XhoΙ雙酶切鑒定,在1374 bp處得到一條帶,與理論值相同,表明重組質(zhì)粒構(gòu)建成功(圖3-B)。重組質(zhì)粒經(jīng)E.coliBL21轉(zhuǎn)化、誘導(dǎo)并純化后,可得一條約50 kDa的條帶(圖3-C)。

A. PCR擴(kuò)增AHA2991基因; B. 重組質(zhì)粒pET-32a-AHA2991的雙酶切; C. AHA2991蛋白的表達(dá)純化; M1. DNA Marker; M2. 蛋白Marker; 1. AHA2991基因; 2. 重組質(zhì)粒pET-32a-AHA2991; 3. BamH Ι和Xoh Ι 雙酶切; 4. 未誘導(dǎo)菌株; 5. 誘導(dǎo)菌株; 6. 純化的AHA2991蛋白。A. Amplification of AHA2991 gene by PCR; B. Double digestion of recombinant plasmid pET-32a-AHA2991; C. Expression and purification of AHA2991; M1. DNA Marker; M2. Protein marker; 1. AHA2991 gene; 2. Recombinant plasmid pET-32a-AHA2991; 3. Double digestion by BamH Ι and Xho Ι; 4. Uninduced strain; 5. Induced strain; 6. Purified AHA2991 protein.圖3 AHA2991重組質(zhì)粒的構(gòu)建及蛋白純化Fig.3 Construction of recombinant plasmid and protein purification of AHA2991

2.3 AHA2991蛋白表達(dá)條件的優(yōu)化

通過(guò)正交實(shí)驗(yàn)確定AHA2991的最佳表達(dá)條件,每組3個(gè)重復(fù)。將誘導(dǎo)后的菌液進(jìn)行處理,經(jīng)過(guò)蛋白電泳可得不同條件下的蛋白表達(dá)(圖4);通過(guò)Phoretix 1D對(duì)正交表達(dá)圖進(jìn)行光密度分析,將所得數(shù)據(jù)通過(guò)SPSS計(jì)算可得蛋白的最佳表達(dá)條件為:菌液濃度OD600=1.0,IPTG終濃度0.5 mmol/L,在28 ℃下誘導(dǎo)8 h;通過(guò)顯著性分析(表2)可知,IPTG濃度對(duì)蛋白的高效表達(dá)有重要作用。

A, B, C為3次重復(fù); M. 蛋白marker; 1. 未誘導(dǎo)菌株; 2～4. OD600值為1.0, 誘導(dǎo)溫度分別為28、37、32 ℃; 5～7. OD600值為0.8, 誘導(dǎo)溫度分別為28、32、37 ℃; 8～10. OD600值為0.5, 誘導(dǎo)溫度分別為37、32、28 ℃。A, B, C are three repetitions; M. Protein marker; 1. Uninduced strain; 2-4. OD600 is 1.0, inducing temperature is 28, 37, 32 ℃, respectively; 5-7. OD600 is 0.8, inducing temperature is 28, 32, 37 ℃, respectively; 8-10. OD600 is 0.5, inducing temperature is 37, 32, 28 ℃, respectively.圖4 不同誘導(dǎo)條件下AHA2991蛋白表達(dá)圖譜Fig.4 Expression map of AHA2991 under different induction conditions

表2 蛋白表達(dá)條件正交試驗(yàn)Table 2 Factors and levels of orthogonal test for protein expression condition

2.4 AHA2991免疫后魚(yú)血清的特異性與效價(jià)檢測(cè)

Western blotting試驗(yàn)結(jié)果表明,出現(xiàn)大小約為45 kDa的特異性條帶,而對(duì)照組未見(jiàn)條帶,效價(jià)為1∶800(圖5)。

M. 蛋白質(zhì)marker; 1. 陰性對(duì)照血清; 2. 血清稀釋倍數(shù)為1∶100; 3. 血清稀釋倍數(shù)為1∶200; 4. 血清稀釋倍數(shù)為1∶400; 5. 血清稀釋倍數(shù)為1∶800。M. Protein marker; 1. Negative control serum; 2. Serum dilution ratio is 1∶100; 3. Serum dilution ratio is 1∶200;4. Serum dilution ratio is 1∶400; 5. Serum dilution ratio is 1∶800.圖5 Western blotting檢測(cè)魚(yú)血清特異性與效價(jià)Fig.5 Detection of specificity and titer of fish serum by Western blotting

2.5 免疫蛋白AHA2991后魚(yú)血漿的酸性、堿性磷酸酶測(cè)定

紅鯽在免疫蛋白AHA2991后,血漿的ACP、AKP指標(biāo)較對(duì)照組相比均極顯著升高(圖6),表明AHA2991激活了紅鯽的非特異性免疫。

2.6 體外細(xì)胞吞噬作用

如表3所示,AHA2991血漿細(xì)胞吞噬作用較對(duì)照組相比具有明顯升高,吞噬百分?jǐn)?shù)升高;且吞噬指數(shù)極顯著高于對(duì)照組(P<0.01)。

表3 免疫AHA2991后紅鯽血漿的細(xì)胞吞噬作用Table 3 Leukocyte phagocytosis of C. auratus plasma after immunization with AHA2991

2.7 免疫AHA2991后紅鯽血漿與嗜水氣單胞菌的相互識(shí)別作用

ELISA實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,免疫AHA2991后紅鯽血漿與嗜水氣單胞菌在體外具有相互識(shí)別作用;且抗體的滴度可達(dá)1∶3200(圖7)。

圖7 免疫AHA2991后紅鯽血漿與嗜水氣單胞菌體外相互作用Fig.7 Interaction between C. arassius plasma after immunization with AHA2991 and A. hydrophila in vitro

2.8 病理切片觀察AHA2991蛋白免疫對(duì)紅鯽內(nèi)臟的影響

紅鯽免疫AHA2991蛋白2次后,取其腎臟、脾臟、腸組織進(jìn)行組織病理學(xué)切片;發(fā)現(xiàn)AHA2991與對(duì)照組相比其內(nèi)臟組織無(wú)明顯區(qū)別(圖8),表明紅鯽免疫外膜蛋白AHA2991對(duì)其內(nèi)臟無(wú)影響。

A為對(duì)照組(免疫無(wú)菌水),B為AHA2991蛋白免疫;a、b、c依次為腎、脾、腸。A is the slice from the control group (immunization sterile water), and B is the slice after immunization with AHA2991 protein; a, b and c are kidney, spleen, intestine.圖8 紅鯽腎、脾、腸組織病理學(xué)切片F(xiàn)ig.8 Pathological sections of kidney, spleen and intestine of C. auratus

3 討 論

嗜水氣單胞菌作為一種水產(chǎn)養(yǎng)殖主要病原菌,其危害性已引起公眾的關(guān)注,但其目前的防治方法單一,主要使用抗生素防治[12],而抗生素的濫用已經(jīng)引發(fā)一系列環(huán)境健康、食品安全等問(wèn)題。故本研究選取嗜水氣單胞菌外膜蛋白AHA2991進(jìn)行主動(dòng)免疫評(píng)價(jià),為嗜水氣單胞菌漁用疫苗的研發(fā)奠定基礎(chǔ)。

分子克隆技術(shù)是分子生物學(xué)的基礎(chǔ),目前已應(yīng)用在基因擴(kuò)增、限制性?xún)?nèi)切酶的應(yīng)用、載體構(gòu)建、細(xì)胞轉(zhuǎn)化、重組體篩選鑒定、基因表達(dá)以及物質(zhì)生產(chǎn)等方面。王記圓等[13]對(duì)橡膠樹(shù)炭疽菌疏水蛋白Hydr進(jìn)行基因擴(kuò)增并將其插入載體pET-32a中,構(gòu)建了Hydr蛋白的原核表達(dá)載體,經(jīng)由IPTG誘導(dǎo),可正確表達(dá)蛋白。董素芳等[14]克隆了類(lèi)鼻疽伯克霍爾德菌TssE-6蛋白,利用pET-30a載體成功進(jìn)行了原核表達(dá),通過(guò)Ni2+純化獲得了單一的目標(biāo)蛋白。本研究利用分子克隆技術(shù)成功構(gòu)建了pET-32a-AHA2991載體,并轉(zhuǎn)化至大腸桿菌,SDS-PAGE電泳顯示外膜蛋白AHA2991相對(duì)分子量大小正確,為后續(xù)實(shí)驗(yàn)奠定基礎(chǔ)。

生物信息學(xué)可準(zhǔn)確預(yù)測(cè)不同蛋白質(zhì)間的同源性、親緣性及高級(jí)結(jié)構(gòu)。在蛋白質(zhì)的抗原表位分析和設(shè)計(jì)方面,可有效降低實(shí)驗(yàn)的盲目性,提高工作效率[15]。研究發(fā)現(xiàn)熒光假單胞菌外膜蛋白ExbB進(jìn)化保守,且具有交叉免疫保護(hù)作用[16];Liu等[17]對(duì)熒光假單胞菌外膜蛋白PF1380進(jìn)行生物信息學(xué)分析,發(fā)現(xiàn)PF1380與多種菌株具有同源性,在交叉免疫評(píng)價(jià)中具良好的保護(hù)效果。本研究通過(guò)生物信息學(xué)對(duì)外膜蛋白AHA2991進(jìn)行分析,發(fā)現(xiàn)AHA2991進(jìn)化保守,免疫動(dòng)物產(chǎn)生的抗體可能對(duì)不同種屬的細(xì)菌感染有交叉免疫保護(hù)作用。

蛋白質(zhì)的分離純化在生物化學(xué)研究應(yīng)用中使用廣泛,是一項(xiàng)重要的操作技術(shù)。蛋白純化的方法主要有凝膠過(guò)濾層析、離子交換層析、親和層析、包涵體洗滌和SDS-PAGE電泳切膠等方法。李秋璇等[18]利用原核表達(dá)系統(tǒng)制備了諾如病毒VP1蛋白,通過(guò)His標(biāo)簽鎳離子蛋白柱純化,得到高純度的VP1蛋白;劉祥[19]利用包涵體洗滌和梯度復(fù)性的方法獲得較高純度的蛋白。本研究結(jié)合包涵體洗滌法和SDS-PAGE電泳切膠法,成功純化嗜水氣單胞菌外膜蛋白AHA2991,濃度測(cè)定與SDS-PAGE電泳結(jié)果表明純化結(jié)果較為理想,為后續(xù)蛋白免疫原性研究及功能性分析奠定基礎(chǔ)。此外,為確定AHA2991表達(dá)菌株的最佳誘導(dǎo)條件,通過(guò)L9(34)正交模型確定的AHA2991最佳表達(dá)條件為:菌液濃度OD600=1.0,IPTG誘導(dǎo)終濃度0.1 mmol/L,在28 ℃下誘導(dǎo)8 h。通過(guò)SPSS分析可知菌液濃度及誘導(dǎo)時(shí)間對(duì)AHA2991的表達(dá)有顯著影響,其中誘導(dǎo)時(shí)間為極顯著。研究報(bào)道IPTG對(duì)細(xì)菌具有毒性,過(guò)量的IPTG會(huì)影響蛋白表達(dá)[20],本研究結(jié)果與此結(jié)論相同;Wyre等[21]發(fā)現(xiàn)大腸桿菌在低溫情況下可減少表達(dá)蛋白的不溶性包涵體,這與本研究結(jié)果一致。適度的誘導(dǎo)時(shí)間對(duì)蛋白的表達(dá)同樣有重要的作用,伍娜娜等[22]報(bào)道過(guò)長(zhǎng)的誘導(dǎo)時(shí)間會(huì)導(dǎo)致蛋白被蛋白酶降解,本研究也表明誘導(dǎo)時(shí)間對(duì)蛋白的表達(dá)有極顯著影響。綜上,最佳誘導(dǎo)條件的確定,為工業(yè)上大規(guī)模制備蛋白AHA2991提供了理論依據(jù)。

為探索外膜蛋白AHA2991的免疫原性,采用Western blotting檢測(cè)紅鯽血清的特異性與效價(jià);體外模擬紅鯽血漿與嗜水氣單胞菌的識(shí)別作用。Western blotting發(fā)現(xiàn)紅鯽抗血清具有特異性,效價(jià)為1∶800。有研究利用布魯氏菌的重組蛋白OMP16免疫 BALB/c小鼠制備多克隆抗血清,并檢測(cè)其效價(jià)為1∶100 000 000[23];劉瑋等[24]以嗜水氣單胞菌外膜蛋白OmpTS與溶血素Hly的融合蛋白免疫新西蘭兔后,抗血清在Western blotting分析中呈陽(yáng)性,滴度可達(dá)1∶4000。孫薇等[25]表達(dá)純化了熒光假單胞菌外膜蛋白SlyB并制備了小鼠抗血清,ELISA表明其滴度可達(dá)1∶12 800。本研究以間接ELISA法檢測(cè)紅鯽血漿與嗜水氣單胞菌的體外識(shí)別作用,其滴度為1∶3200,表明體外AHA2991紅鯽血漿對(duì)嗜水氣單胞菌具有識(shí)別作用。本研究以純化的嗜水氣單胞菌外膜蛋白AHA2991免疫紅鯽,發(fā)現(xiàn)AHA2991具有一定的免疫原性,為漁用疫苗的開(kāi)發(fā)提供了生物學(xué)基礎(chǔ)。

非特異性免疫也稱(chēng)為先天免疫,與機(jī)體的免疫功能密切相關(guān)。吞噬作用是血液中特定細(xì)胞識(shí)別并吞噬異物的作用,是機(jī)體基本的防衛(wèi)方式[26];有研究證明酸性磷酸酶(ACP)、堿性磷酸酶(AKP)為魚(yú)類(lèi)主要解毒酶[27],且廣泛存在魚(yú)體組織、血液或細(xì)胞中,因而可作為主要免疫指標(biāo)[28]。故本研究選擇吞噬作用、ACP、AKP作為非特異性免疫的評(píng)價(jià)指標(biāo)。本研究通過(guò)免疫AHA2991后,發(fā)現(xiàn)紅鯽血漿中ACP、AKP、吞噬作用均高于對(duì)照組。王卓等[29]發(fā)現(xiàn)青海湖裸鯉幼魚(yú)在碳酸鹽堿度脅迫下,ACP、AKP酶活性升高;趙娜等[30]將牙鲆免疫海豚鏈球菌,發(fā)現(xiàn)牙鲆血細(xì)胞中ACP、吞噬指標(biāo)均上升。以上結(jié)果均證明紅鯽非特異性免疫被激活。組織病理形態(tài)學(xué)觀察可直觀地了解組織損傷或病變程度,常被采用進(jìn)行藥物功能的評(píng)價(jià)。楊成年等[31]以維氏氣單胞菌感染雜交鱘后,對(duì)其肝、脾、腸觀察使用組織切片技術(shù)進(jìn)行病理變化描述;蘭蕾等[32]將大鼠進(jìn)行艾煙染毒,對(duì)其心、肝、脾、肺等組織進(jìn)行病理學(xué)切片,發(fā)現(xiàn)染毒后均有損傷。本研究利用組織病理學(xué)切片技術(shù),發(fā)現(xiàn)AHA2991蛋白的免疫對(duì)紅鯽內(nèi)臟無(wú)明顯影響。

4 結(jié) 論

AHA2991表達(dá)菌株的最佳誘導(dǎo)表達(dá)條件為菌液濃度OD600=1.0,IPTG終濃度0.1 mmol/L,在28 ℃下誘導(dǎo)8 h;紅鯽主動(dòng)免疫嗜水氣單胞菌外膜蛋白AHA2991后,血漿中ACP、AKP活力升高,細(xì)胞吞噬作用增強(qiáng);ELISA體外模擬結(jié)果顯示,AHA2991血漿對(duì)嗜水氣單胞菌特具有識(shí)別作用,滴度可達(dá)1∶3200;Western blotting結(jié)果顯示紅鯽血漿中含有特異性抗體;組織病理學(xué)切片表明紅鯽免疫外膜蛋白AHA2991對(duì)其內(nèi)臟無(wú)影響。上述結(jié)果說(shuō)明嗜水氣單胞菌外膜蛋白AHA2991是一種保護(hù)性抗原,可為嗜水氣單胞菌疫苗的開(kāi)發(fā)提供理論基礎(chǔ)。