• <tr id="yyy80"></tr>
  • <sup id="yyy80"></sup>
  • <tfoot id="yyy80"><noscript id="yyy80"></noscript></tfoot>
  • 99热精品在线国产_美女午夜性视频免费_国产精品国产高清国产av_av欧美777_自拍偷自拍亚洲精品老妇_亚洲熟女精品中文字幕_www日本黄色视频网_国产精品野战在线观看 ?

    黔北麻羊CTSK、FN1基因生物信息學(xué)分析及其在性腺軸中的表達

    2023-06-10 04:31:26趙佳福周明帥楊秀遠
    西南農(nóng)業(yè)學(xué)報 2023年4期
    關(guān)鍵詞:黔北信號肽卵巢

    趙佳福,周明帥,徐 暢,楊秀遠,陳 祥

    (1.貴州大學(xué)高原山地動物遺傳育種與繁殖教育部重點實驗室,貴陽 550025;2.貴州大學(xué)動物科學(xué)學(xué)院,貴陽 550025)

    【研究意義】黔北麻羊作為貴州省三大優(yōu)良地方山羊品種之一,具有生長發(fā)育快、體型大、性成熟早、肉質(zhì)香嫩鮮美、無膻味和皮張品質(zhì)好等特點,深受消費者的歡迎和喜愛[1]。研究發(fā)現(xiàn),黔北麻羊繁殖力較強,產(chǎn)羔率可達196%,高于貴州白山羊(160%)和貴州黑山羊(152%)。繁殖率是肉羊養(yǎng)殖的重要經(jīng)濟性狀[2],因此,研究黔北麻羊繁殖性狀對提高其養(yǎng)殖經(jīng)濟效益具有重要作用?!厩叭搜芯窟M展】組織蛋白酶 K(Cathepsin K,CTSK)是一種溶酶體半胱氨酸蛋白酶,屬于木瓜蛋白酶超家族成員,存在于溶酶體細胞內(nèi),是蛋白酶中一個細胞外基質(zhì)降解酶[3],廣泛存在于病毒、細菌、真菌、原生動物及原蟲、植物、哺乳動物和人體中,通過氨基酸活性部位調(diào)節(jié)對應(yīng)蛋白的催化活性。對綿羊的研究發(fā)現(xiàn),在綿羊妊娠的40~120 d可在其子宮胎盤組織中檢測到多種組織蛋白酶mRNA的表達,CTSK蛋白在妊娠后期主要分布于子宮內(nèi)膜腺間和胎盤間,表明在綿羊子宮胎盤組織中CTSK蛋白可能參與綿羊子宮內(nèi)膜重塑以及胎盤的形成[4]。纖連蛋白(Fibronectin,FN)是一種分子量為440 kDa的高分子量細胞外基質(zhì)糖蛋白,是纖維連接蛋白家族的一個成員,其分子結(jié)構(gòu)中含有多種結(jié)構(gòu)域,可選擇性地與細胞外基質(zhì)中多種大分子如膠原、肝素、纖維蛋白及細胞表面受體結(jié)合,在細胞黏附、遷移、生長、分化及基質(zhì)重塑等多種細胞過程中起至關(guān)重要作用[5],FN1在腫瘤、動脈粥樣硬化、關(guān)節(jié)炎等疾病中發(fā)揮著多種生物學(xué)功能[6]?!颈狙芯壳腥朦c】圍繞前期轉(zhuǎn)錄組學(xué)檢測結(jié)果,以單羔黔北麻羊卵巢中差異表達的CTSK和FN1基因為切入點,研究CTSK、FN1基因在黔北麻羊單羔、多羔性腺軸中的表達規(guī)律,解析CTSK和FN1基因與黔北麻羊繁殖之間的表達調(diào)控關(guān)系?!緮M解決的關(guān)鍵問題】闡明CTSK、FN1基因不同表達模式與黔北麻羊繁殖率之間的相互作用關(guān)系,為黔北麻羊多胎品系的選育尋找潛在的關(guān)鍵候選基因和分子標(biāo)記物。

    1 材料與方法

    1.1 試驗動物、試劑及主要儀器

    1.1.1 試驗動物 黔北麻羊(Qianbei Ma goat)由貴州省習(xí)水縣富興牧業(yè)有限公司提供。選擇健康無病、繁殖性能正常,體重相近的1~2歲單羔(連續(xù)2胎產(chǎn)單羔)和多羔(連續(xù)2胎產(chǎn)雙羔以上)黔北麻羊各3只,屠宰后分別采集單羔、多羔母羊下丘腦、垂體、子宮、輸卵管和卵巢5個性腺組織,使用滅菌的錫箔紙包裹組織樣品,貼好標(biāo)簽置于液氮中運回實驗室,轉(zhuǎn)移至-80 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

    1.1.2 試劑 TRIzol和逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購于Thermo Fisher科技公司,qPCR Mix購于美國BIO-RAD公司,膠回收試劑盒購于Axygen生物技術(shù)有限公司,DNA Marker 2000購于大連寶生物工程有限公司,LB培養(yǎng)基粉末購于上海生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司,液氮、氯仿、50×TAE 緩沖液、異丙醇、無水乙醇、瓊脂糖、氨芐青霉素等購自貴州西寶生物科技有限公司。

    1.1.3 主要儀器 包括超微量紫外分光光度計(NANODROP 2000,美國Thermo Fisher)、恒溫搖床(MaxQ4000,美國ThermoScientific)、電泳儀(DYY-2C 型,北京六一)、PCR 擴增儀(C1000 TouchTM、美國BIO-RAD)、熒光定量PCR儀(CFX 96,美國BIO-RAD)、凝膠成像系統(tǒng)(Gel Doc XR,美國BIO-RAD)、微量瞬時離心機(D1008E,大龍)、斡旋混勻儀(VORTEX-1,歐萊博)。

    1.2 方法

    1.2.1 引物設(shè)計及合成 根據(jù)Genbank公布的山羊CTSK(XM_005677656.3)、FN1(XM_005676508.3)及β-acting基因 mRNA序列,利用Primer Premier 5.0引物設(shè)計軟件設(shè)計熒光定量 PCR引物,由上海擎科生物科技有限公司合成,引物序列信息見表1。

    表1 qPCR引物序列信息Table 1 Primer sequence information of qPCR

    1.2.2 RNA的提取及cDNA的合成 利用TRIZOL法提取組織RNA,超微量紫外分光光度計檢測RNA質(zhì)量,隨后通過HiFi Saript逆轉(zhuǎn)錄試劑盒合成cDNA,逆轉(zhuǎn)錄體系為20 μL,體系為5×RT Buffer 4 μL、RibolockRnose Inhibitor 1 μL、10 mmol/L dNTP Mix 2 μL、RevertAid M-MuLURT 1 μL、RNase-Free water補充至20 μL。反應(yīng)條件:42 ℃,60 min;70 ℃,5 min,最后將反應(yīng)產(chǎn)物置于-20 ℃冰箱保存?zhèn)浜罄m(xù)試驗。

    1.2.3 qPCR檢測 采用qPCR檢測CTSK、FN1基因在單羔、多羔黔北麻羊下丘腦、垂體、卵巢、輸卵管、子宮性腺組織中表達水平。將逆轉(zhuǎn)錄得到的各組織cDNA稀釋至等濃度作為模板,反應(yīng)體系為10 μL:qRT-PCR mix 5 μL、cDNA模板1 μL、上下游引物(100 μmol/L)各0.5 μL、ddH2O 3 μL。反應(yīng)條件:95 ℃預(yù)變性 2 min,95 ℃變性 15 s,60 ℃退火 30 s,70 ℃延伸30 s并添加機器自帶的熔解曲線,以β-acting為內(nèi)參基因,每組3個重復(fù)進行qPCR反應(yīng)。

    1.3 數(shù)據(jù)處理及生物信息學(xué)分析

    qPCR數(shù)據(jù)采用SPSS 19.0進行統(tǒng)計分析,圖表采用GraphPad Prism5進行處理。在t檢驗中,*表示差異顯著(P<0.05),**表示差異極顯著(P<0.01);在進行多重比較分析時,不同字母表示差異極顯著(P< 0.01),相同字母表示差異不顯著(P> 0.05)。使用Expasy網(wǎng)站中的ProtParam(https://web.expasy.org/protparam/)工具分析CTSK、FN1蛋白理化性質(zhì);運用SignalP-5.0Server(http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/)分析蛋白信號肽;使用PSOR(http://psort1.hgc.jp/form.html)預(yù)測蛋白亞細胞定位;SOPMA和SWISS預(yù)測蛋白二級和三級結(jié)構(gòu);使用Megalign進行不同物種同源性比較;用MEGA7.0構(gòu)建不同物種系統(tǒng)發(fā)育進化樹。

    2 結(jié)果與分析

    2.1 CTSK、FN1基因在黔北麻羊單羔、多羔性腺軸中的表達水平

    從圖1看出,CTSK基因在單羔組及多羔組黔北麻羊的卵巢、下丘腦、子宮、輸卵管和垂體中均有表達。在單羔組中,CTSK基因在卵巢組織中的表達最高,極顯著高于其他組織,在垂體和輸卵管中的表達最低;在多羔組中,CTSK基因在卵巢中表達最高,極顯著高于其他組織,在輸卵管、下丘腦、子宮和垂體中的表達較低且差異不顯著。CTSK基因在單羔組卵巢、下丘腦、子宮中的表達均極顯著高于多羔組,在垂體和輸卵管中的表達差異不顯著。FN1基因在單羔組及多羔組卵巢、下丘腦、子宮、輸卵管和垂體中均有表達。在單羔組中,FN1基因在輸卵管中的表達量最高,極顯著高于其他性腺軸組織,在垂體、下丘腦和子宮中的中的表達量較低,且差異不顯著。在多羔組中,FN1基因在子宮組織中的表達量最高,極顯著高于其他性腺軸組織,在輸卵管和垂體中的表達量最低。FN1在多羔組丘腦和子宮組織中的表達極顯著高于單羔組,在卵巢中的表達量顯著高于單羔組,垂體和輸卵管中的表達量極顯著低于單羔組。

    圖1 CTSK和FN1基因在黔北麻羊單羔及多羔性腺軸中的表達量Fig.1 Expression of CTSK gene and FN1 gene in gonadal axis of monotocous and polytocous lambs of Qianbei Ma goat

    2.2 黔北麻羊CTSK和FN1基因蛋白理化性質(zhì)

    黔北麻羊CTSK基因共編碼330個氨基酸,相對分子質(zhì)量37160.25,化學(xué)式C1649H2566N458O490S16,理論PI為8.82,在哺乳動物體中的半衰期約為30 h。其中帶負電荷氨基酸殘基(Asp + Glu)總數(shù)34個,帶正電荷的殘基總數(shù)(Arg + Lys)為41個,說明該基因編碼的氨基酸序列帶負電荷。該基因的不穩(wěn)定指數(shù)為31.67,為穩(wěn)定蛋白質(zhì)(不穩(wěn)定系數(shù)<40),脂肪族指數(shù)為77.12,總平均親水性為-0.523,為親水性蛋白。

    黔北麻羊FN1基因共編碼2478個氨基酸,相對分子質(zhì)量272 070.51,化學(xué)式C11912H18545N3317O3814S88,理論PI為5.37,在哺乳動物體中的半衰期約為30h。其中帶負電荷氨基酸殘基(Asp + Glu)總數(shù)為266個,帶正電荷的殘基總數(shù)(Arg + Lys)為206個,說明該基因編碼的氨基酸序列帶負電荷。該基因的不穩(wěn)定指數(shù)為41.14,為不穩(wěn)定蛋白質(zhì)(不穩(wěn)定系數(shù)>40),脂肪族指數(shù)為69.79,總平均親水性為-0.496,為親水性蛋白。

    2.3 黔北麻羊CTSK和FN1基因的亞細胞定位

    使用PSOR II Prediction在線軟件預(yù)測CTSK、FN1蛋白亞細胞定位結(jié)果顯示,CTSK蛋白定位在細胞外和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的可能性為33.3%,定位在線粒體中的可能性為22.2%,定位在囊泡的可能性為11.1%。FN1蛋白定位在細胞核的可能性60.9%,定位在線粒體及細胞外的可能性均為13.0%,小概率定位在囊泡(8.7%)和細胞質(zhì)(4.3%)中。說明CTSK蛋白可能主要在細胞外和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中發(fā)揮生物學(xué)作用,而FN1蛋白可能主要在細胞核中發(fā)揮生物學(xué)作用。

    2.4 黔北麻羊CTSK和FN1基因信號肽預(yù)測

    從圖2看出,黔北麻羊CTSK蛋白在16~17位(SFA-LY)氨基酸位置有86.23%的可能性出現(xiàn)信號肽切割位點,且是Sec/SPI信號肽的可能性為96.33%;黔北麻羊FN1蛋白在27~28位(AGA-SK)氨基酸位置有34.92%的可能性出現(xiàn)信號肽切割位點,且是Sec/SPI信號肽的可能性為99.35%。說明CTSK和FN1蛋白信號肽均由Sec轉(zhuǎn)運子運輸,由信號肽酶Ⅰ(Lep)切割而成,與信號識別有關(guān)。

    圖2 CTSK和FN1蛋白信號肽預(yù)測Fig.2 Signal peptide prediction of CTSK protein and FN1 protein

    2.5 CTSK和FN1基因的二級和三級結(jié)構(gòu)

    從圖3看出,黔北麻羊CTSK蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)主要由α-螺旋(32.7%)、β-轉(zhuǎn)角(5.45%)、無規(guī)則卷曲(58.47%)與延伸鏈(29.82%)組成;FN1蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)主要由α-螺旋(5.73%)、β-轉(zhuǎn)角(5.97%)、無規(guī)則卷曲(45.45%)與延伸鏈(16.35%)組成。CTSK蛋白質(zhì)三級結(jié)構(gòu)主要由α-螺旋與無規(guī)則卷曲構(gòu)成,FN1蛋白質(zhì)則主要為無規(guī)則卷曲及延伸鏈構(gòu)成,預(yù)測結(jié)果與二級結(jié)構(gòu)一致。

    圖3 CTSK和FN1蛋白的二級結(jié)構(gòu)(A)和三級結(jié)構(gòu)(B)Fig.3 Secondary structures(A) and tertiary structures (B) of CTSK protein and FN1 protein

    2.6 CTSK和FN1基因同源性及遺傳距離

    將黔北麻羊CTSK、FN1基因氨基酸序列與不同物種氨基酸序列進行同源性比對結(jié)果顯示,黔北麻羊CTSK基因與綿羊、牛、豬、狗、馬、兔、人、鼠和雞的同源性分別為99.5%、98.4%、95.9%、95.9%、95.4%、94.7%、94.2%、85.7%和74.9%(圖4-A);黔北麻羊FN1基因與綿羊、牛、豬、狗、馬、人、兔、鼠和雞的同源性分別為99.7%、99.1%、95.8%、95.2%、95.1%、93.9%、93.3%、91.6%和83.2%(圖4-B)。由此可見,黔北麻羊CTSK和FN1基因編碼氨基酸序列在不同物種之間具有較高的保守性,均與反芻動物綿羊、牛的同源性最高,與小型動物或非哺乳動物鼠和雞中的同源性最低。從構(gòu)建的不同物種CTSK、FN1基因系統(tǒng)進化樹結(jié)果證實,黔北麻羊CTSK(圖5-A)和FN1(圖5-B)基因與綿羊、牛等反芻動物遺傳距離最近,與鼠和雞的遺傳距離最遠。

    圖4 不同物種CTSK(A)和FN1(B)氨基酸序列的同源性Fig.4 Amino acid sequence homology of CTSK (A) and FN1 (B) in different species

    圖5 不同物種CTSK(A)和FN1(B)氨基酸序列的系統(tǒng)發(fā)育進化樹Fig.5 Phylogenetic tree of amino acid sequences of CTSK (A) and FN1 (B) in different species

    3 討 論

    CTSK基因作為組織蛋白酶家族中被研究得較少的一類,近年來較多的研究方向均為與骨質(zhì)疏松或牙周炎[7-9]和腫瘤發(fā)生[10]等有關(guān),Feng等[11-13]研究認為,CTSK基因是一種骨質(zhì)疏松靶向蛋白酶,活化的破骨細胞特異性表達成熟CTSK基因,且有助于骨組織的重塑與再吸收,CTSK基因缺乏的骨細胞防止乳汁誘導(dǎo)的骨丟失和甲狀旁腺激素抑制,而雌激素可以下調(diào)CTSK基因的表達。魏巍等[3]發(fā)現(xiàn),CTSK基因不僅參與機體正常生理調(diào)節(jié),而且在多種疾病如實體瘤、關(guān)節(jié)炎、椎間盤退行性改變等中均異常表達。Li等[14]研究表明,CTSK基因被確定為腸道菌群失衡與結(jié)直腸癌轉(zhuǎn)移之間的重要中介,與結(jié)直腸癌轉(zhuǎn)移及預(yù)后不良相關(guān)。但近年來CTSK基因在家畜、山羊上的研究則比較少見。Balatsky等[15]研究表明,肌肉內(nèi)脂肪含量和嫩度受CTSK等位基因變異的影響,CTSK基因可能與優(yōu)質(zhì)瘦肉的生產(chǎn)特別相關(guān)。Suárez-Vega等[16]研究發(fā)現(xiàn),CTSK基因還可能與綿羊的奶酪量與品質(zhì)性狀有關(guān)。本研究中,qPCR結(jié)果顯示,CTSK基因在單羔組卵巢、下丘腦、子宮中的表達均極顯著高于多羔組,這與 Balboula[17]的研究一致;Balboula等研究發(fā)現(xiàn),與質(zhì)量較差的胚胎相比,優(yōu)質(zhì)胚胎或優(yōu)質(zhì)卵裂球表現(xiàn)出更強的自噬活性和較少的CTSK基因活性,且抑制CTSK基因會降低IVP牛胚胎的發(fā)育率(增加囊胚和孵化率)和質(zhì)量(增加細胞總數(shù)和降低凋亡細胞百分比),此外,下丘腦-垂體-卵巢軸通過調(diào)節(jié)激素分泌對哺乳動物卵巢卵泡的發(fā)育具有重要影響[18-20],而CTSK基因在單羔組卵巢和下丘腦組織中高表達,說明CTSK基因可能與胚胎質(zhì)量和卵泡發(fā)育具有負向調(diào)控關(guān)系。

    FN1基因作為纖維連接蛋白家族中的一員,是一種參與細胞粘附和遷移過程的糖蛋白,被普遍研究認為與癌癥的發(fā)生途徑有關(guān)。在癌癥病例中,FN1基因的高表達往往被視為預(yù)后不良,FN1基因在GAC腫瘤組織中的表達水平均顯著高于正常組織[21]。Qiu等[22]研究發(fā)現(xiàn),FN1在甲狀腺乳頭狀癌(PTC)進展中發(fā)揮重要作用,可能作為PTC預(yù)后的標(biāo)志物。在生殖過程中FN1基因也發(fā)揮著不同的功能,如受精和著床。FN1基因的表達從桑椹胚到囊胚早期顯著增加,這表明FN1基因可能也參與了早期囊胚的形成。Goossens等[23]研究認為,FN1可能在囊胚形成過程中發(fā)揮特定的功能,胚胎FN1基質(zhì)具有黏附性,將細胞連接在一起,并為細胞層遷移提供底物。Cai等[24]研究發(fā)現(xiàn),敲低FN1基因能顯著抑制結(jié)腸癌細胞的增殖和遷移;樊慶燦[25]對雞胚的研究表明,FN1基因通過結(jié)構(gòu)域與細胞表面受體、纖維蛋白等特異性結(jié)合,調(diào)控細胞的遷移、分化和黏附,參與胚胎細胞分化和器官形成,在胚胎發(fā)育中起到重要的調(diào)節(jié)作用。本研究表明,FN1基因在多羔組下丘腦、子宮和卵巢組織中的表達均顯著高于單羔組,推測FN1可能通過卵巢及子宮細胞的增殖及遷移,促進胚胎發(fā)育,與動物繁殖性狀可能具有正向調(diào)控關(guān)系。因此,CTSK和FN1基因作為影響黔北麻羊繁殖力高低的重要候選基因還需作進一步的研究。

    4 結(jié) 論

    CTSK、FN1基因分別編碼330和2478個氨基酸,理論PI分別為8.82和5.37,CTSK是一種具有信號肽的穩(wěn)定親水性蛋白,而FN1是一種具有信號肽的不穩(wěn)定親水性蛋白;亞細胞定位結(jié)果說明:CTSK蛋白可能主要在細胞外和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中發(fā)揮生物學(xué)作用,而FN1蛋白可能主要在細胞核中發(fā)揮生物學(xué)作用;高級結(jié)構(gòu)預(yù)測結(jié)果顯示,CTSK和FN1蛋白均主要由無規(guī)則卷曲構(gòu)成;與其他動物相比,黔北麻羊CTSK、FN1基因均與反芻動物綿羊及牛的親緣關(guān)系最近。qPCR表明:CTSK和FN1基因在單羔組及多羔組黔北麻羊的卵巢、下丘腦、子宮、輸卵管和垂體中均有表達;CTSK基因在單羔組卵巢、下丘腦、子宮中的表達均極顯著高于多羔組,在垂體和輸卵管中的表達差異不顯著(P>0.05);FN1在多羔組丘腦和子宮組織中的表達極顯著高于單羔組,在卵巢中的表達量顯著高于單羔組(P<0.05),在垂體和輸卵管中的表達量極顯著低于單羔組。CTSK基因表達量與黔北麻羊的繁殖性狀有一定的負相關(guān),FN1基因表達量與黔北麻羊的繁殖性狀有一定的正相關(guān),兩者均與動物繁殖性狀密切相關(guān)。

    猜你喜歡
    黔北信號肽卵巢
    嵌合信號肽提高α-淀粉酶在枯草芽孢桿菌中的分泌
    保養(yǎng)卵巢吃這些
    卵巢多囊表現(xiàn)不一定是疾病
    如果卵巢、子宮可以說話,會說什么
    黔北山鄉(xiāng)水稻飄香
    運用計算機軟件預(yù)測木質(zhì)部寄生屬信號肽
    內(nèi)源信號肽DSE4介導(dǎo)頭孢菌素C?;冈诋叧嘟湍钢械姆置诒磉_
    黔北鄉(xiāng)間——尋覓時光的味道
    黔北煤田官田壩向斜煤層氣賦存及潛力分析
    中國煤層氣(2015年6期)2015-08-22 03:25:14
    黔北六縣茶產(chǎn)業(yè)發(fā)展比較研究
    91久久精品国产一区二区三区| 18禁裸乳无遮挡免费网站照片| 少妇熟女欧美另类| 免费一级毛片在线播放高清视频| 国产成人精品久久久久久| 99久久精品热视频| 久久久久九九精品影院| 亚洲天堂国产精品一区在线| 国内精品一区二区在线观看| 午夜福利网站1000一区二区三区| 九色成人免费人妻av| 春色校园在线视频观看| 最近最新中文字幕大全电影3| 少妇高潮的动态图| av免费观看日本| 男女边吃奶边做爰视频| 免费黄色在线免费观看| 亚洲欧美成人精品一区二区| 又粗又爽又猛毛片免费看| 中文精品一卡2卡3卡4更新| videossex国产| 亚洲美女搞黄在线观看| 亚洲成人av在线免费| 久久精品国产自在天天线| 青青草视频在线视频观看| 午夜激情福利司机影院| 午夜免费男女啪啪视频观看| 亚洲精品,欧美精品| 丰满乱子伦码专区| 三级国产精品片| 午夜视频国产福利| 久久欧美精品欧美久久欧美| 国产成人福利小说| 久久精品国产亚洲网站| 99久久精品一区二区三区| 搞女人的毛片| av在线亚洲专区| 亚洲欧美成人精品一区二区| 尾随美女入室| 成人高潮视频无遮挡免费网站| 国产高清不卡午夜福利| 欧美区成人在线视频| 中文天堂在线官网| 日本五十路高清| www日本黄色视频网| 精品久久久久久电影网 | 只有这里有精品99| 视频中文字幕在线观看| 中文字幕制服av| 亚洲欧美日韩东京热| 美女大奶头视频| 久久综合国产亚洲精品| 亚洲精品456在线播放app| 中国美白少妇内射xxxbb| 亚洲av中文av极速乱| 久久久久久久午夜电影| 国产精品一二三区在线看| 日韩在线高清观看一区二区三区| 中文天堂在线官网| 精品久久久久久久久av| 少妇熟女欧美另类| 天天一区二区日本电影三级| eeuss影院久久| 噜噜噜噜噜久久久久久91| 亚洲av一区综合| 韩国av在线不卡| 晚上一个人看的免费电影| 亚洲成av人片在线播放无| 亚洲真实伦在线观看| 亚洲av电影在线观看一区二区三区 | 国产高潮美女av| 亚洲自拍偷在线| 精品一区二区免费观看| 国产一区二区亚洲精品在线观看| 国产精品日韩av在线免费观看| av视频在线观看入口| 国产精品美女特级片免费视频播放器| 国产中年淑女户外野战色| 国产单亲对白刺激| 中文字幕人妻熟人妻熟丝袜美| 国产单亲对白刺激| 又黄又爽又刺激的免费视频.| 国产欧美日韩精品一区二区| 麻豆成人av视频| 夫妻性生交免费视频一级片| 欧美精品一区二区大全| 国产精品国产三级专区第一集| 七月丁香在线播放| 久久久精品欧美日韩精品| 国产黄片视频在线免费观看| 亚洲精品影视一区二区三区av| 亚洲av免费高清在线观看| 国产精品美女特级片免费视频播放器| 欧美另类亚洲清纯唯美| 午夜福利成人在线免费观看| 啦啦啦啦在线视频资源| 国产视频内射| 亚洲精品乱码久久久v下载方式| 黄色配什么色好看| 免费不卡的大黄色大毛片视频在线观看 | or卡值多少钱| 日本三级黄在线观看| 美女脱内裤让男人舔精品视频| 美女黄网站色视频| 麻豆成人午夜福利视频| 熟妇人妻久久中文字幕3abv| 99热网站在线观看| 最近2019中文字幕mv第一页| 亚洲国产精品合色在线| 黑人高潮一二区| 成年美女黄网站色视频大全免费| 国产有黄有色有爽视频| 视频区图区小说| 亚洲欧洲国产日韩| av一本久久久久| 一二三四在线观看免费中文在 | 国产精品人妻久久久久久| 在线看a的网站| 亚洲av福利一区| 日本欧美国产在线视频| 日韩视频在线欧美| 亚洲一码二码三码区别大吗| 中文精品一卡2卡3卡4更新| 亚洲av免费高清在线观看| 女的被弄到高潮叫床怎么办| 亚洲三级黄色毛片| 狠狠婷婷综合久久久久久88av| 日本色播在线视频| 免费久久久久久久精品成人欧美视频 | 99久久综合免费| 超碰97精品在线观看| 国产精品人妻久久久久久| av在线观看视频网站免费| 久久综合国产亚洲精品| 人妻人人澡人人爽人人| 香蕉精品网在线| 亚洲少妇的诱惑av| 黄色一级大片看看| 免费观看a级毛片全部| 日本猛色少妇xxxxx猛交久久| 亚洲高清免费不卡视频| 国产深夜福利视频在线观看| 国产成人精品福利久久| 欧美日韩成人在线一区二区| 久久久久久久精品精品| 久久精品久久久久久久性| 亚洲精华国产精华液的使用体验| 女人久久www免费人成看片| 免费观看在线日韩| 五月玫瑰六月丁香| 久久午夜福利片| 三级国产精品片| 午夜精品国产一区二区电影| 成人午夜精彩视频在线观看| 五月开心婷婷网| 免费高清在线观看视频在线观看| xxx大片免费视频| 91精品伊人久久大香线蕉| 一级黄片播放器| 久久国产精品男人的天堂亚洲 | av卡一久久| 妹子高潮喷水视频| 精品视频人人做人人爽| 欧美最新免费一区二区三区| 国产精品成人在线| 中文字幕精品免费在线观看视频 | 免费观看性生交大片5| 国产乱人偷精品视频| 国产成人精品无人区| 制服人妻中文乱码| 久久人人97超碰香蕉20202| 免费观看在线日韩| 国产成人av激情在线播放| 亚洲av在线观看美女高潮| 日本黄大片高清| 国产精品三级大全| 高清在线视频一区二区三区| 一级片免费观看大全| 日韩成人av中文字幕在线观看| 日日啪夜夜爽| 大香蕉久久成人网| 婷婷色综合www| 午夜免费男女啪啪视频观看| 十分钟在线观看高清视频www| 国产精品一区www在线观看| 欧美激情 高清一区二区三区| 久久这里只有精品19| 亚洲欧美中文字幕日韩二区| 国产探花极品一区二区| 国产男人的电影天堂91| 中文字幕免费在线视频6| 男女免费视频国产| 啦啦啦视频在线资源免费观看| 十八禁高潮呻吟视频| 亚洲av欧美aⅴ国产| 日本av手机在线免费观看| 国产亚洲精品第一综合不卡 | 狠狠精品人妻久久久久久综合| 日本黄大片高清| 国产综合精华液| 老女人水多毛片| 一区二区三区精品91| 王馨瑶露胸无遮挡在线观看| 色5月婷婷丁香| 我的女老师完整版在线观看| 青春草国产在线视频| 免费av不卡在线播放| 国国产精品蜜臀av免费| 在线观看人妻少妇| 免费在线观看黄色视频的| 免费日韩欧美在线观看| 日韩熟女老妇一区二区性免费视频| av又黄又爽大尺度在线免费看| 妹子高潮喷水视频| 永久网站在线| 国产免费一区二区三区四区乱码| 人妻一区二区av| 一级毛片 在线播放| 建设人人有责人人尽责人人享有的| 久久女婷五月综合色啪小说| 青青草视频在线视频观看| 在线观看人妻少妇| 国产欧美日韩综合在线一区二区| 一级黄片播放器| 99国产综合亚洲精品| 久久午夜综合久久蜜桃| 午夜影院在线不卡| 精品一区二区三区四区五区乱码 | 永久免费av网站大全| 视频中文字幕在线观看| 国产av一区二区精品久久| 日韩精品有码人妻一区| 国产乱来视频区| 全区人妻精品视频| 国精品久久久久久国模美| 日韩精品免费视频一区二区三区 | 青春草国产在线视频| 插逼视频在线观看| 在线观看美女被高潮喷水网站| 免费黄频网站在线观看国产| 国产欧美日韩综合在线一区二区| 国产69精品久久久久777片| 永久网站在线| 高清不卡的av网站| 亚洲国产精品999| 免费久久久久久久精品成人欧美视频 | 国产日韩欧美在线精品| 国产国语露脸激情在线看| 亚洲五月色婷婷综合| 热99久久久久精品小说推荐| 超色免费av| 国产亚洲午夜精品一区二区久久| 国产亚洲精品久久久com| 久久精品熟女亚洲av麻豆精品| 汤姆久久久久久久影院中文字幕| 午夜激情久久久久久久| 99久国产av精品国产电影| 少妇精品久久久久久久| 亚洲国产精品999| 日本色播在线视频| 久久 成人 亚洲| 亚洲国产成人一精品久久久| 日韩一区二区视频免费看| 国产成人精品在线电影| av播播在线观看一区| 极品人妻少妇av视频| 最近手机中文字幕大全| 男女无遮挡免费网站观看| 伊人亚洲综合成人网| 久久久久人妻精品一区果冻| 性色av一级| 夫妻性生交免费视频一级片| 日日爽夜夜爽网站| 99re6热这里在线精品视频| 国产成人精品婷婷| 97在线人人人人妻| 五月伊人婷婷丁香| 韩国高清视频一区二区三区| 久久免费观看电影| 老司机影院成人| 看十八女毛片水多多多| 黄色怎么调成土黄色| h视频一区二区三区| 桃花免费在线播放| 自线自在国产av| 大香蕉久久成人网| 一边摸一边做爽爽视频免费| 一级片免费观看大全| 国产精品久久久久成人av| www.av在线官网国产| av一本久久久久| 天天影视国产精品| 少妇的丰满在线观看| 国产欧美日韩一区二区三区在线| 亚洲精品日韩在线中文字幕| 国产精品久久久久成人av| 五月开心婷婷网| 久久午夜综合久久蜜桃| 国产成人午夜福利电影在线观看| 丰满乱子伦码专区| 80岁老熟妇乱子伦牲交| 免费久久久久久久精品成人欧美视频 | 精品少妇黑人巨大在线播放| 多毛熟女@视频| tube8黄色片| 视频区图区小说| 激情视频va一区二区三区| 天天操日日干夜夜撸| videossex国产| 国产欧美亚洲国产| 国产成人av激情在线播放| 久久毛片免费看一区二区三区| 五月玫瑰六月丁香| 免费少妇av软件| 少妇人妻久久综合中文| 成年av动漫网址| 亚洲精品视频女| 老司机影院成人| 插逼视频在线观看| 精品久久久精品久久久| 国产av精品麻豆| 中文字幕av电影在线播放| 日韩视频在线欧美| 久久久国产一区二区| 丝袜喷水一区| 亚洲一级一片aⅴ在线观看| 国产深夜福利视频在线观看| 亚洲av成人精品一二三区| 欧美xxxx性猛交bbbb| 欧美xxⅹ黑人| 热99国产精品久久久久久7| 久久久久久久久久人人人人人人| 精品少妇内射三级| 国产成人精品在线电影| 国产免费一区二区三区四区乱码| 国产高清不卡午夜福利| 一区二区三区乱码不卡18| 亚洲中文av在线| 精品少妇久久久久久888优播| 欧美激情 高清一区二区三区| 欧美少妇被猛烈插入视频| 国产色婷婷99| 国产男人的电影天堂91| 国产精品久久久av美女十八| 777米奇影视久久| 国产色爽女视频免费观看| 国产一区二区在线观看av| 成年av动漫网址| 美女主播在线视频| 久久久久久人人人人人| 美女主播在线视频| 自线自在国产av| 久久精品国产自在天天线| 久热久热在线精品观看| 久久精品国产自在天天线| 黄色 视频免费看| 国产精品无大码| 国产69精品久久久久777片| 免费高清在线观看视频在线观看| 久久久精品区二区三区| 成人黄色视频免费在线看| 另类精品久久| 婷婷色综合大香蕉| 亚洲美女搞黄在线观看| av片东京热男人的天堂| 涩涩av久久男人的天堂| 成人国产av品久久久| 国产精品嫩草影院av在线观看| 在线天堂最新版资源| av国产久精品久网站免费入址| 女人久久www免费人成看片| 久久国产亚洲av麻豆专区| 黄色一级大片看看| 精品卡一卡二卡四卡免费| 国产一区二区激情短视频 | 九九爱精品视频在线观看| 国产极品粉嫩免费观看在线| 亚洲av在线观看美女高潮| 精品一区二区三区四区五区乱码 | 免费观看a级毛片全部| 美女视频免费永久观看网站| 欧美bdsm另类| 久久精品国产亚洲av天美| 一区二区av电影网| 在线观看人妻少妇| 久久人人爽人人爽人人片va| 亚洲人成网站在线观看播放| 欧美性感艳星| 久久久久久久久久成人| 人人妻人人添人人爽欧美一区卜| www.av在线官网国产| 久久 成人 亚洲| 国产白丝娇喘喷水9色精品| 久久国产亚洲av麻豆专区| 久久久国产精品麻豆| 91精品国产国语对白视频| 国产白丝娇喘喷水9色精品| 精品少妇内射三级| av.在线天堂| av电影中文网址| 狠狠婷婷综合久久久久久88av| 夜夜骑夜夜射夜夜干| 午夜福利在线观看免费完整高清在| 亚洲欧美清纯卡通| 永久免费av网站大全| 97人妻天天添夜夜摸| 国产永久视频网站| a级毛色黄片| 香蕉国产在线看| 999精品在线视频| 哪个播放器可以免费观看大片| 欧美亚洲日本最大视频资源| 国产欧美日韩综合在线一区二区| 午夜福利影视在线免费观看| 国产成人精品无人区| 人妻少妇偷人精品九色| 最新的欧美精品一区二区| 国产精品国产三级国产专区5o| 两性夫妻黄色片 | 男女免费视频国产| 欧美日韩av久久| 国产黄色免费在线视频| 久热久热在线精品观看| 极品人妻少妇av视频| 免费黄频网站在线观看国产| 午夜久久久在线观看| 亚洲欧美色中文字幕在线| 又大又黄又爽视频免费| 中文字幕av电影在线播放| 亚洲色图综合在线观看| 熟妇人妻不卡中文字幕| 精品福利永久在线观看| 亚洲欧美日韩卡通动漫| 免费看不卡的av| 少妇被粗大猛烈的视频| 91精品伊人久久大香线蕉| 国产精品不卡视频一区二区| 成人黄色视频免费在线看| 精品少妇内射三级| 精品少妇黑人巨大在线播放| 男女国产视频网站| 国产高清三级在线| 日韩伦理黄色片| 51国产日韩欧美| 最近最新中文字幕大全免费视频 | a 毛片基地| 狠狠婷婷综合久久久久久88av| 久久 成人 亚洲| 中国美白少妇内射xxxbb| 搡老乐熟女国产| 日本黄色日本黄色录像| 亚洲高清免费不卡视频| 在线观看人妻少妇| 一本色道久久久久久精品综合| 久久国产精品男人的天堂亚洲 | 五月开心婷婷网| 美国免费a级毛片| 精品福利永久在线观看| 建设人人有责人人尽责人人享有的| 欧美人与性动交α欧美精品济南到 | 国产黄色视频一区二区在线观看| 只有这里有精品99| 中文字幕制服av| 十分钟在线观看高清视频www| 精品视频人人做人人爽| 久久热在线av| 精品酒店卫生间| 99久久精品国产国产毛片| 欧美精品一区二区大全| 国产亚洲一区二区精品| 视频区图区小说| 一级爰片在线观看| 免费av中文字幕在线| 午夜福利,免费看| 高清不卡的av网站| 一级毛片黄色毛片免费观看视频| 水蜜桃什么品种好| 亚洲色图 男人天堂 中文字幕 | 观看av在线不卡| 男女午夜视频在线观看 | 黄色配什么色好看| 最近手机中文字幕大全| 日韩人妻精品一区2区三区| 欧美亚洲日本最大视频资源| www.色视频.com| 日韩精品免费视频一区二区三区 | 欧美变态另类bdsm刘玥| 黄色怎么调成土黄色| 大陆偷拍与自拍| 国产成人aa在线观看| 成人黄色视频免费在线看| 精品人妻一区二区三区麻豆| 免费久久久久久久精品成人欧美视频 | 国产极品天堂在线| 丝袜在线中文字幕| 色婷婷av一区二区三区视频| 国产淫语在线视频| 亚洲国产精品一区三区| videosex国产| 99久久精品国产国产毛片| 亚洲精品视频女| 精品99又大又爽又粗少妇毛片| 亚洲精品色激情综合| 日韩成人伦理影院| 久久 成人 亚洲| 大话2 男鬼变身卡| 天堂俺去俺来也www色官网| 亚洲欧洲国产日韩| 久久精品熟女亚洲av麻豆精品| 观看美女的网站| 你懂的网址亚洲精品在线观看| 99热6这里只有精品| 亚洲欧美成人综合另类久久久| 国产淫语在线视频| 久久99热这里只频精品6学生| 欧美日韩综合久久久久久| 精品一区在线观看国产| 日韩成人伦理影院| 看免费av毛片| 五月开心婷婷网| 一二三四中文在线观看免费高清| 久久久久久人人人人人| 伦精品一区二区三区| 青春草亚洲视频在线观看| 蜜桃在线观看..| 国产激情久久老熟女| 国产色爽女视频免费观看| 一本色道久久久久久精品综合| 高清在线视频一区二区三区| 亚洲国产av影院在线观看| 久久久久久人人人人人| 精品国产乱码久久久久久小说| 久热久热在线精品观看| 成人黄色视频免费在线看| 香蕉精品网在线| 国产极品粉嫩免费观看在线| 内地一区二区视频在线| 亚洲国产av影院在线观看| 97在线人人人人妻| 成人国语在线视频| 亚洲第一av免费看| xxx大片免费视频| 免费人成在线观看视频色| 大片电影免费在线观看免费| 亚洲精品久久成人aⅴ小说| 免费av中文字幕在线| 免费看不卡的av| 黑人欧美特级aaaaaa片| 亚洲在久久综合| 在线观看免费高清a一片| 插逼视频在线观看| 国产老妇伦熟女老妇高清| 91午夜精品亚洲一区二区三区| 麻豆精品久久久久久蜜桃| 国产一区二区三区av在线| 女人被躁到高潮嗷嗷叫费观| 成人国产麻豆网| 久久久精品免费免费高清| 大片免费播放器 马上看| 丝袜人妻中文字幕| av在线app专区| 狂野欧美激情性xxxx在线观看| 99国产综合亚洲精品| 啦啦啦啦在线视频资源| 亚洲综合色网址| 五月开心婷婷网| 亚洲欧美日韩另类电影网站| 十分钟在线观看高清视频www| 亚洲成av片中文字幕在线观看 | 18禁在线无遮挡免费观看视频| 亚洲精品乱码久久久久久按摩| 十八禁高潮呻吟视频| 狂野欧美激情性xxxx在线观看| 一级毛片黄色毛片免费观看视频| 亚洲av综合色区一区| 亚洲av福利一区| 精品酒店卫生间| 亚洲五月色婷婷综合| 亚洲成国产人片在线观看| 99国产精品免费福利视频| 曰老女人黄片| 菩萨蛮人人尽说江南好唐韦庄| 国产精品不卡视频一区二区| 亚洲av免费高清在线观看| 亚洲精品,欧美精品| 欧美97在线视频| 国产成人a∨麻豆精品| 这个男人来自地球电影免费观看 | 激情视频va一区二区三区| 各种免费的搞黄视频| 久久久久精品人妻al黑| 日韩 亚洲 欧美在线| www.色视频.com| 十八禁网站网址无遮挡| 欧美精品亚洲一区二区| 最近最新中文字幕免费大全7| 91精品三级在线观看| 黄色视频在线播放观看不卡| 亚洲av男天堂| 久久鲁丝午夜福利片| 亚洲欧美日韩另类电影网站| 黑人高潮一二区| 在线观看三级黄色| 人人妻人人爽人人添夜夜欢视频| 好男人视频免费观看在线| 亚洲av欧美aⅴ国产| 香蕉精品网在线| 亚洲精品色激情综合| 亚洲欧美成人精品一区二区| 91精品伊人久久大香线蕉| 欧美精品一区二区大全| 晚上一个人看的免费电影| 黑人高潮一二区| 一本一本久久a久久精品综合妖精 国产伦在线观看视频一区 | 少妇的丰满在线观看|