不同環(huán)境因素對(duì)苦菜提取液抑菌穩(wěn)定性的影響

盧寧　侯金麗

摘要：隨著時(shí)代的發(fā)展，人們對(duì)食品安全的關(guān)注度上升，因此對(duì)天然防腐劑的開(kāi)發(fā)和應(yīng)用成為近幾年的研究熱點(diǎn)。文章在前期研究的基礎(chǔ)上，繼續(xù)對(duì)苦菜提取液抑菌穩(wěn)定性進(jìn)行研究。以大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌、綠膿桿菌為供試菌種，探討溫度、pH、紫外線、金屬離子、蔗糖、保存時(shí)間等對(duì)苦菜提取液抑菌活性的影響。結(jié)果表明，苦菜提取液對(duì)熱處理、紫外線、保存時(shí)間均具有較好的穩(wěn)定性；pH為7.0時(shí)，苦菜提取液的抑菌效果最好；Ca2+、Fe2+、Fe3+有增強(qiáng)苦菜提取液抑菌能力的作用；隨著蔗糖濃度的增大，提取液的抑菌活性有所增強(qiáng)?？嗖颂崛∫旱囊志钚暂^穩(wěn)定，可適應(yīng)多種加工條件，作為天然的抑菌防腐劑使用，有較好的應(yīng)用前景。

關(guān)鍵詞：苦菜；提取液；抑菌；穩(wěn)定性

中圖分類號(hào)：TS201.2文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A 文章編號(hào)：1000-9973（2023）06-0100-04

Abstract： With the development of the times， people pay more attention to food safety， so the development and application of natural preservatives has become a research hotspot in recent years. In this paper， on the basis of previous studies， the bacteriostatic stability of Patrinia villosa extract continues to be studied. With E. coli， Staphylococcus aureus， Bacillus subtilis and Pseudomonas aeruginosa as the tested bacteria， the effects of temperature， pH， ultraviolet ray， metal ions， sucrose and preservation time on the bacteriostatic activity of Patrinia villosa extract are discussed. The results show that Patrinia villosa extract has good stability to heat treatment， ultraviolet ray and preservation time; when the pH is 7.0， the bacteriostatic effect of Patrinia villosa extract is the best; Ca2+、Fe2+、Fe3+ have the effect of enhancing the bacteriostatic ability of Patrinia villosa extract; with the increase of sucrose concentration， the bacteriostatic activity of the extract increases. The bacteriostatic activity of Patrinia villosa extract is relatively stable and can adapt to various processing conditions. It has a good application prospect as a natural bacteriostatic preservative.

Key words： Patrinia villosa； extract； bacteriostasis； stability

收稿日期：2022-12-13

基金項(xiàng)目：2015年度河南省教育廳規(guī)劃項(xiàng)目（2015-GH-160）

作者簡(jiǎn)介：盧寧（1983—），女，河南駐馬店人，講師，碩士，研究方向：營(yíng)養(yǎng)與檢測(cè)及食品質(zhì)量安全控制；

侯金麗（1980—），女，河南新鄉(xiāng)人，講師，碩士，研究方向：微生物、化學(xué)。

食品在為人體提供豐富多樣的營(yíng)養(yǎng)成分的同時(shí)，也為微生物的生長(zhǎng)提供了充足的條件。微生物有適應(yīng)性強(qiáng)、生長(zhǎng)旺盛、繁殖快等特點(diǎn)，極易造成各種食品腐敗變質(zhì)，引起食品的品質(zhì)嚴(yán)重下降。目前，因?yàn)槲⑸镌斐傻氖称沸袠I(yè)每年損失大約占到10％～20％，給食品行業(yè)造成了很大困擾，同時(shí)也給食品行業(yè)在人力、物力、財(cái)力方面造成了非常大的損失。因此在食品生產(chǎn)、運(yùn)輸、儲(chǔ)藏等過(guò)程中，如何科學(xué)防腐保鮮一直是不得不重視的問(wèn)題[1]。對(duì)食品進(jìn)行科學(xué)防腐保鮮的方法有很多，現(xiàn)在普遍流行的是在食品中添加防腐劑。

食品防腐劑對(duì)于防止食品腐敗變質(zhì)最簡(jiǎn)單、最有效。目前，食品防腐劑主要分為兩種：一種是化學(xué)防腐劑，另一種是天然防腐劑，其中化學(xué)防腐劑應(yīng)用較多。但是近些年化學(xué)防腐劑殘留問(wèn)題凸顯，食品安全已經(jīng)成為消費(fèi)者和食品產(chǎn)業(yè)共同關(guān)心的熱點(diǎn)問(wèn)題。因此各國(guó)都重視天然食品防腐劑的研究與開(kāi)發(fā)，天然食品防腐劑不斷進(jìn)入人們的視野，其應(yīng)用范圍將逐漸擴(kuò)大。

苦菜，屬于菊科植物，生長(zhǎng)于路邊及田野，在中國(guó)大部分地區(qū)以及俄羅斯、日本、韓國(guó)均有分布。作者前期研究發(fā)現(xiàn)，苦菜提取液對(duì)金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌、大腸桿菌、綠膿桿菌等一些主要的能夠引起食品腐敗的細(xì)菌都有不同程度的抑菌作用[2]，有的抑菌效果特別顯著。同時(shí)，苦菜提取液具有高效、低毒、自然資源豐富的特點(diǎn)，在食品防腐及果蔬保鮮等方面有良好的應(yīng)用前景。目前，苦菜提取液的研究?jī)?nèi)容主要集中在以下幾個(gè)方面：其一，苦菜提取液的各種提取方法；其二，苦菜提取液的各種提取工藝[3-4]；其三，苦菜提取液在各種食品中的應(yīng)用[5-6]。但是，對(duì)于苦菜提取液抑菌穩(wěn)定性的研究未見(jiàn)報(bào)道。基于此，本實(shí)驗(yàn)通過(guò)對(duì)苦菜提取液在不同的溫度、pH、紫外線、金屬離子、蔗糖、保存時(shí)間等條件下進(jìn)行處理，研究苦菜提取液的抑菌穩(wěn)定性。此次研究成果將為苦菜提取液在食品中的應(yīng)用提供新的理論參考依據(jù)和更廣闊的空間。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

苦菜：河南鄭州；大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌、綠膿桿菌：河南工業(yè)貿(mào)易職業(yè)學(xué)院微生物實(shí)驗(yàn)室；平板計(jì)數(shù)瓊脂培養(yǎng)基：廣東環(huán)凱微生物科技有限公司；其余化學(xué)試劑均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

RC-FA系列電子分析天平 北京睿誠(chéng)永創(chuàng)科技有限公司；多功能粉碎機(jī) 常州庭旺干燥設(shè)備有限公司；立式壓力蒸汽滅菌鍋 濟(jì)南程騰生物技術(shù)有限公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 苦菜提取液的制備[5]

稱取100 g苦菜，用組織搗碎機(jī)破碎，置于燒杯中加入1 000 mL 水，常規(guī)水煎，濃縮至500 mL，即濃度為0.25 g/mL的母液，滅菌備用。臨用前將0.25 g/mL的母液稀釋至120? mg/L。

1.3.2 抑菌圈的測(cè)定——牛津杯法[7-8]

牛津杯法是檢測(cè)抗生素效價(jià)的一種方法，本實(shí)驗(yàn)選擇三劑量法。主要原理為將培養(yǎng)基表面直接垂直放上裝滿藥液的牛津杯，在培養(yǎng)皿中，實(shí)驗(yàn)菌生長(zhǎng)的同時(shí)，抗生素呈球面擴(kuò)散，離牛津杯越近，抗生素濃度越大，離牛津杯越遠(yuǎn)，抗生素濃度越小。隨著抗生素濃度的減小，有一條最低抑菌濃度帶，在濃度帶范圍內(nèi)，菌不能生長(zhǎng)，而呈透明的圓圈，稱為“抑菌圈”。抗生素濃度越高，抑菌圈越大。

本次研究采用的實(shí)驗(yàn)具體操作如下：

將各種供試菌菌種擴(kuò)大活化后，用無(wú)菌水稀釋至菌液濃度達(dá)到108 CFU/mL。

將處理后的各種供試菌懸液100 μL分別均勻涂布在平板上，用鑷子將3個(gè)無(wú)菌的牛津杯（內(nèi)徑6 mm、外徑8 mm、高10 mm的圓形小管，管的兩端要光滑，也可用玻璃管、瓷管）放入培養(yǎng)皿中，輕輕按壓牛津杯，使其與培養(yǎng)基表面接觸嚴(yán)密。

吸取250 μL苦菜提取液放入牛津杯中，將裝有牛津杯的培養(yǎng)基放置于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后取出，用游標(biāo)卡尺分別測(cè)量抑菌圈直徑。

每組重復(fù)3次，取平均值，同時(shí)采用無(wú)菌水作陰性對(duì)照實(shí)驗(yàn)。

1.3.3 熱處理對(duì)苦菜提取液抑菌穩(wěn)定性的影響

取質(zhì)量濃度為120 mg/L 的苦菜提取液分別置于40，60，80，100 ℃水浴和121 ℃高壓濕熱條件下處理30 min，與未進(jìn)行加熱處理的苦菜提取液進(jìn)行對(duì)照。經(jīng)過(guò)對(duì)供試菌的培養(yǎng)后，測(cè)定每個(gè)處理溫度下苦菜提取液的抑菌圈直徑，每組重復(fù)3次。

1.3.4 pH對(duì)苦菜提取液抑菌穩(wěn)定性的影響[9]

用HCl 和 NaOH 溶液調(diào)節(jié)120 mg/L 的苦菜提取液的pH值分別為2.0，4.0，6.0，7.0，8.0，10.0，以未進(jìn)行pH值調(diào)節(jié)的苦菜提取液（pH值為6.8）作對(duì)照。經(jīng)過(guò)對(duì)供試菌的培養(yǎng)后，測(cè)定不同pH值下苦菜提取液的抑菌圈直徑，每組重復(fù)3次。

1.3.5 紫外線照射對(duì)苦菜提取液抑菌穩(wěn)定性的影響

將120 mg/L 的苦菜提取液分別在紫外燈下垂直照射10，20，30，40，50，60 min，與未進(jìn)行紫外線照射處理的苦菜提取液作對(duì)照。經(jīng)過(guò)對(duì)供試菌的培養(yǎng)后，測(cè)定不同紫外線照射時(shí)間處理下苦菜提取液的抑菌圈直徑，每組重復(fù)3次。

1.3.6 金屬離子對(duì)苦菜提取液抑菌穩(wěn)定性的影響[10-11]

用1 mol/L的不同金屬離子（K+、Na+、Ca+、Fe2+、Fe3+）溶液浸泡苦菜提取液12 h，其中苦菜提取液的質(zhì)量濃度為120 mg/L，以未進(jìn)行金屬離子浸泡處理的苦菜提取液作對(duì)照。經(jīng)過(guò)對(duì)供試菌的培養(yǎng)后，測(cè)定不同金屬離子下苦菜提取液的抑菌圈直徑，每組重復(fù)3次。

1.3.7 蔗糖濃度對(duì)苦菜提取液抑菌穩(wěn)定性的影響

用濃度為10%、20%、30%、40%、50%、60%的蔗糖溶液溶解苦菜提取液，配制成濃度為120 mg/L的苦菜提取液，以不加蔗糖溶液的苦菜提取液作空白對(duì)照。經(jīng)過(guò)對(duì)供試菌的培養(yǎng)后，測(cè)定不同蔗糖溶液濃度下苦菜提取液的抑菌圈直徑，每組重復(fù)3次。

1.3.8 保存時(shí)間對(duì)苦菜提取液抑菌穩(wěn)定性的影響

將120 mg/L 的苦菜提取液在室溫下每隔4 d測(cè)定一次抑菌活性，共測(cè)5次，與未經(jīng)室溫保存的苦菜提取液作對(duì)照。通過(guò)觀察，測(cè)定不同保存時(shí)間下苦菜提取液的抑菌圈直徑，每組重復(fù)3次。

2 結(jié)果與分析

2.1 熱處理對(duì)苦菜提取液抑菌穩(wěn)定性的影響

由圖1可知，經(jīng)過(guò)不同溫度處理的苦菜提取液對(duì)供試菌的抑菌圈直徑?jīng)]有明顯影響，基本保持原有的抑菌效力，表明苦菜提取液熱處理后其抗菌成分活性并未受到顯著影響，說(shuō)明溫度變化對(duì)苦菜提取液抑菌活性的影響不大，不易發(fā)生熱變性，具備很好的熱穩(wěn)定性?？嗖颂崛∫旱哪蜔嵝钥蓱?yīng)用于食品的保鮮儲(chǔ)藏，可作為熱加工食品中的防腐劑。且苦菜提取液的熱穩(wěn)定性對(duì)高溫環(huán)境下食品運(yùn)輸過(guò)程中的防腐保鮮具有重要的應(yīng)用價(jià)值，可大大提高食品的儲(chǔ)藏期[12]。

2.2 pH對(duì)苦菜提取液抑菌穩(wěn)定性的影響

由圖2可知，不同pH環(huán)境對(duì)苦菜提取液的抑菌效果影響很大。當(dāng)pH值為7.0時(shí)，苦菜提取液的抑菌效果達(dá)到最好。當(dāng) pH≤6或 pH≥7 時(shí)，隨著處理后苦菜提取液的pH值逐漸降低或升高，苦菜提取液的抑菌效果均會(huì)逐漸降低。原因可能是pH值升高或降低破壞了苦菜提取液中抑菌物質(zhì)的結(jié)構(gòu)（或活性），而在中性和弱酸性的環(huán)境下，苦菜提取液中抑菌物質(zhì)的結(jié)構(gòu)較穩(wěn)定，具有較強(qiáng)的抑菌活性。因此，將苦菜提取液應(yīng)用于食品保鮮時(shí)，應(yīng)避免強(qiáng)酸或堿性條件。

2.3 紫外線照射對(duì)苦菜提取液抑菌穩(wěn)定性的影響

由圖3可知，和對(duì)照組相比，經(jīng)過(guò)不同時(shí)間的紫外線照射處理，苦菜提取液對(duì)實(shí)驗(yàn)菌枯草芽孢桿菌、金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、綠膿桿菌的抑菌活性變化趨勢(shì)平緩，抑菌活性基本保持穩(wěn)定。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，苦菜提取液中的抑菌活性成分對(duì)紫外線具有極高的穩(wěn)定性。

2.4 金屬離子對(duì)苦菜提取液抑菌穩(wěn)定性的影響

由圖 4 可知，苦菜提取液經(jīng) Na+、K+兩種離子處理后，抑菌活性與對(duì)照基本保持一致。但經(jīng)Ca2+、Fe2+、Fe3+處理后，苦菜提取液的抑菌活性明顯高于對(duì)照，其原因可能是金屬離子本身對(duì)菌體的生長(zhǎng)存在抑制作用[13]，以及金屬離子與苦菜提取液中的抑菌活性成分發(fā)生了螯合作用，從而明顯提高了其抑菌能力。

2.5 蔗糖濃度對(duì)苦菜提取液抑菌穩(wěn)定性的影響

由圖5可知，隨著蔗糖濃度的升高，苦菜提取液的抑菌能力逐漸增強(qiáng)。這表明蔗糖對(duì)苦菜提取液的抑菌活性具有一定的增效作用，表現(xiàn)出了協(xié)同效應(yīng)，提高了抑菌活性。有研究顯示，當(dāng)蔗糖達(dá)到一定濃度時(shí)，通過(guò)影響微生物細(xì)胞膜的滲透壓，從而抑制微生物的生長(zhǎng)[14-16]，因此對(duì)苦菜提取液的抑菌活性起到促進(jìn)作用。

2.6 保存時(shí)間對(duì)苦菜提取液抑菌穩(wěn)定性的影響

由圖6可知，隨著保存時(shí)間的延長(zhǎng)，苦菜提取液的抑菌活性略有降低，說(shuō)明其抑菌成分在光照、氧氣等的作用下可能發(fā)生變化，使得有效含量減少，進(jìn)而降低了抑菌效果。

3 結(jié)果與討論

熱處理、介質(zhì)pH的變化、不同金屬離子、紫外殺菌、添加蔗糖，都是在食品生產(chǎn)中經(jīng)常采用的抑菌處理方式。本實(shí)驗(yàn)選取這些常見(jiàn)因素對(duì)苦菜提取液進(jìn)行了抑菌穩(wěn)定性的研究，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，苦菜提取液對(duì)溫度、紫外照射及金屬離子具有良好的穩(wěn)定性，且Ca2+、Fe2+、Fe3+處理后的苦菜提取液的抑菌活性明顯高于對(duì)照；蔗糖濃度對(duì)苦菜提取液的抑菌活性有一定的影響，在一定程度上有增效作用；苦菜提取液在中性和弱酸性的環(huán)境下具有較強(qiáng)的抑菌活性，其中pH為7.0時(shí)，苦菜提取液的抑菌效果達(dá)到最好；在保存期20 d內(nèi)，苦菜提取液的抑菌活性變化幅度較小，說(shuō)明苦菜提取液的抑菌成分受環(huán)境因素的影響較小。

食品添加劑未來(lái)的發(fā)展方向趨于綠色、天然、健康，隨著居民生活和消費(fèi)水平的提高，人們對(duì)食品的安全性越來(lái)越重視。通過(guò)實(shí)驗(yàn)可知，苦菜提取液的抑菌活性較穩(wěn)定，可以適應(yīng)多種常見(jiàn)抑菌處理方式，作為天然的抑菌防腐劑使用，有較好的應(yīng)用前景。后續(xù)研究可對(duì)苦菜提取液中的主要抑菌物質(zhì)進(jìn)行分離純化與結(jié)構(gòu)分析，同時(shí)闡明其抑菌機(jī)制，消除其對(duì)食品風(fēng)味的影響，為新型的植物性抑菌防腐劑的開(kāi)發(fā)提供參考依據(jù)。

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