八角皂苷的提取及穩(wěn)定性研究

鄭燕菲　蔡杰慧　譚義秋　韋鳳　韋海娟

摘要：文章以八角果實為研究對象，考察了超聲波輔助法和加熱回流法對八角果實中皂苷提取效果的影響，探討了溫度、氧化物、pH、金屬離子、光照條件對八角皂苷穩(wěn)定性的影響情況。結(jié)果表明，加熱回流法提取八角皂苷比超聲波輔助法提取效果好，超聲波輔助法提取八角皂苷的得率為2.67%，加熱回流法提取八角皂苷的得率達5.47%。溫度和氧化物H2O2對八角皂苷的穩(wěn)定性影響顯著，金屬離子對八角皂苷的穩(wěn)定性有一定的影響；在生產(chǎn)、使用、存放時，八角皂苷在低溫、pH為8、避光環(huán)境中穩(wěn)定性更佳。該研究結(jié)果可為八角皂苷在天然藥物和功能食品等領(lǐng)域中的開發(fā)利用提供理論參考。

關(guān)鍵詞：八角；皂苷；提??；穩(wěn)定性

中圖分類號：TS201.2文獻標志碼：A 文章編號：1000-9973（2023）06-0096-04

Abstract： Taking star anise fruit as the research object， the effects of ultrasonic-assisted method and heating reflux method on the extraction effect of saponin from star anise fruit are investigated， and the effects of temperature， oxides， pH， metal ions and light conditions on the stability of star anise saponin are discussed. The results show that the extraction effect of saponin from star anise by heating reflux method is better than that by ultrasonic-assisted method. The yield of saponin from star anise extracted by ultrasonic-assisted method is 2.67%， while the yield of saponin from star anise extracted by heating reflux method reaches 5.47%. Temperature and oxide H2O2 have significant effects on the stability of star anise saponin， and metal ions have acertain effect on the stability of star anise saponin. During production， use and storage， star anise saponin has better stability at low temperature， pH 8 and dark environment. The research results could provide theoretical references for the development and utilization of saponin from star anise in the field of nature medicine and functional food.

Key words： star anise； saponin； extraction； stability

收稿日期：2022-12-11

基金項目：2020年廣西自然科學(xué)基金項目（2020JJB120001）；2021年廣西高校中青年教師基礎(chǔ)能力提升項目（2021KY0773）；廣西民族師范學(xué)院科研項目（2020YB011，2021YB038）

作者簡介：鄭燕菲（1987－），女，副教授，博士，研究方向：天然產(chǎn)物、功能食品的研究與開發(fā)。

*通信作者：譚義秋（1967－），男，教授，碩士，研究方向：天然高分子的改性及應(yīng)用。

八角（star anise，Illicium verum Hook. f.），又名八角茴香，是在我國許多地區(qū)都有種植的芳香植物[1]，廣西八角的產(chǎn)量占全國的85%，占世界的70%，八角是廣西地區(qū)最重要的經(jīng)濟樹種之一[2]。八角既是食品中不可或缺的香辛料調(diào)味品，又可作為香精和藥物的原料，其干燥成熟果實含有芳香油約5%～8%、脂肪油約22%，及黃酮、多酚、蛋白質(zhì)、莽草酸等化學(xué)成分[3-5]。八角的有效成分是多種組分的混合物，具有抑菌、抗氧化、鎮(zhèn)痛等多種生理功效[6-9]。皂苷是廣泛存在于天然植物中的一種天然物質(zhì)[10]。皂苷物質(zhì)的研究是保健食品開發(fā)的重要方向，同時也是天然藥物提取的重要途徑，其在臨床上有抗腫瘤、抗炎、抗氧化、降血糖、降血脂、降血壓、增強免疫力等作用[11-14]。目前，對三七、人參、黃芪、紅棗等植物中皂苷的研究[15-18]有很多，但對八角皂苷的提取及穩(wěn)定性的研究鮮有報道。為了開發(fā)具有高附加值功能的八角產(chǎn)品，促進地區(qū)的經(jīng)濟發(fā)展和生態(tài)保護，本文以八角果實為研究對象，考察超聲波輔助提取法和加熱回流法對八角果實中皂苷得率的影響，探討溫度、氧化物、pH、金屬離子、光照條件對八角皂苷穩(wěn)定性的影響情況，結(jié)果為八角植物資源在醫(yī)藥品、食品中的開發(fā)利用和功能原料的發(fā)展提供了參考。

1 材料與方法

1.1 材料

八角干果：購于廣西崇左市江洲區(qū)。將八角干果用粉碎機粉碎，過40目篩，于40～50 ℃烘箱內(nèi)烘干，八角粉末用密封袋保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 試劑

乙醇、香草醛、高氯酸、冰醋酸、濃硫酸、過氧化氫、乙酸酐、氫氧化鈉、甲醇、氯化鉀、無水氯化鈣、三氯化鋁、三氯化鐵、氯化鎂等：均為分析純；實驗用水均為蒸餾水。

1.3 儀器與設(shè)備

722型可見分光光度計 上海舜宇恒平科學(xué)儀器有限公司；SHZ-D Ⅲ型循環(huán)水式真空泵 河南予華儀器有限公司；DGX-9143BC-1型烘箱 上海?，攲嶒炘O(shè)備有限公司；KQ3200型超聲波清洗器 昆山市超聲儀器有限公司；AR224CN型電子分析天平 奧豪斯儀器（上海）有限公司；YP5102型電子天平 上海光正醫(yī)療儀器有限公司；HJ-3型恒溫磁力攪拌器 金壇市易晨儀器制造有限公司；HH-S4型數(shù)顯恒溫水浴鍋 金壇市醫(yī)療儀器廠；RE-3000B型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器 上海雅榮生化設(shè)備儀器有限公司。

1.4 實驗方法

1.4.1 八角皂苷定量分析方法的建立

1.4.1.1 定量分析的原理

采用香草醛-硫酸法對八角皂苷的含量進行測定。原理為皂苷溶液與香草醛-冰醋酸、高氯酸溶液在加熱條件下可顯色，顏色的深淺與皂苷含量成比例關(guān)系，顏色越深，皂苷含量越多，顏色越淺，皂苷含量越少。根據(jù)物質(zhì)的吸收光譜和光的吸收定律，利用香草醛-硫酸法對八角皂苷顯色，在548 nm波長處進行吸光度檢測[19]，計算出皂苷的含量[20]。

1.4.1.2 標準曲線的繪制

分別準確移取0.00，1.00，2.00，3.00，4.00，5.00 mL質(zhì)量濃度為0.007 0 mg/mL的齊墩果酸標準溶液于棕色試管中，在70 ℃水浴中加熱至試管中的甲醇全部揮發(fā)，分別依次加入0.2 mL 5%的香草醛-冰醋酸溶液、0.8 mL高氯酸，搖勻，于水浴鍋中加熱20 min后，迅速放到冰水中冷卻5 min，加入5 mL冰醋酸，充分搖勻，靜置22 min，在548 nm波長處測吸光度，繪制標準曲線。

1.4.2 八角皂苷的提取

1.4.2.1 樣品的預(yù)處理

準確稱取85.00 g八角粉末，放入圓底燒瓶中，加入300 mL石油醚，在70 ℃油浴中回流4 h后，除去八角粉末中的石油醚，自然干燥后在50 ℃烘箱中烘干1 h，得到脫脂后的八角粉末，裝入密封袋中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4.2.2 超聲波輔助法提取

準確稱取50.00 g已脫脂的八角粉末放入250 mL圓底燒瓶中，加入100 mL 40%乙醇溶液，搖勻，150 W超聲波輔助提取20 min，取出提取液；再加入100 mL 40%乙醇溶液，搖勻，150 W超聲波輔助提取20 min，取上清液。合并提取液，離心、過濾、濃縮，于50 ℃烘箱中烘干，制得八角皂苷超聲波輔助提取物。實驗平行提取5次，用標準曲線繪制的香草醛-硫酸法對八角皂苷的含量進行測定，計算八角皂苷的得率。

1.4.2.3 加熱回流法提取

準確稱取50.00 g已脫脂的八角粉末放入250 mL圓底燒瓶中，加入100 mL 40%乙醇，搖勻，于70 ℃油浴加熱回流1 h，取出提取液；再加入100 mL 40%乙醇溶液，搖勻，于70 ℃油浴加熱回流1 h，取上清液。合并提取液，離心、過濾、濃縮，于50 ℃烘箱中烘干，制得八角皂苷加熱回流提取物。實驗平行提取5次，用標準曲線繪制的香草醛-硫酸法對八角皂苷的含量進行測定，計算八角皂苷的得率。

1.4.3 八角皂苷的定性分析

1.4.3.1 泡沫實驗

取一定量的八角皂苷提取物，加入少量蒸餾水將其溶解，以蒸餾水作為空白對照，煮沸10 min，將煮沸后的提取液放入試管中，強烈振搖，觀察實驗現(xiàn)象。

1.4.3.2 Lieberman反應(yīng)

用乙酸酐溶解一定量的八角皂苷提取物，向溶液中加入1滴濃硫酸，觀察實驗現(xiàn)象。以蒸餾水作為空白對照。

1.4.4 八角皂苷穩(wěn)定性的測定

分別稱取八角皂苷超聲波輔助提取物和八角皂苷加熱回流提取物各1.003 0 g，用甲醇溶解，定容于100 mL棕色容量瓶中，搖勻，制得質(zhì)量濃度為10.03 mg/mL的八角皂苷液。

1.4.4.1 溫度對八角皂苷穩(wěn)定性的影響

分別取3 mL八角皂苷液于試管中，分別放在40，50，60，70，80 ℃恒溫水浴鍋中加熱10 min，用香草醛-濃硫酸法顯色后，在548 nm波長處測其吸光度。

1.4.4.2 氧化物對八角皂苷穩(wěn)定性的影響

分別取3 mL八角皂苷液于試管中，分別加入1滴15%的H2O2溶液，用香草醛-濃硫酸法顯色，以八角皂苷液為空白對照，在548 nm波長處測其吸光度。

1.4.4.3 pH對八角皂苷穩(wěn)定性的影響

分別取3 mL八角皂苷液于試管中，分別用1%的HCl溶液和1%的NaOH溶液調(diào)節(jié)酸堿度，使得溶液的pH分別為2，4，6，8，10，12，以八角皂苷液為空白對照，用香草醛-濃硫酸法顯色后，在548 nm波長處測其吸光度。

1.4.4.4 金屬離子對八角皂苷穩(wěn)定性的影響

分別取3 mL八角皂苷液于試管中，分別加入1.0 mg/mL的CaCl2、NaCl、MgCl2、KCl、AlCl3溶液，以八角皂苷液為空白對照，用香草醛-濃硫酸法顯色后，在548 nm波長處測其吸光度。

1.4.4.5 光照條件對八角皂苷穩(wěn)定性的影響

分別取3 mL八角皂苷液于試管中，分別進行日光照射和避光處理，每隔1 h，用香草醛-濃硫酸法顯色，在548 nm波長處測其吸光度。

2 結(jié)果與分析

2.1 八角皂苷定性分析

在泡沫實驗中，有八角提取物的試管中出現(xiàn)了蜂窩狀泡沫，持續(xù)達20 min；蒸餾水空白對照試管中沒有出現(xiàn)蜂窩狀泡沫。在Lieberman反應(yīng)實驗中，剛加入濃硫酸時，有八角提取物的試管溶液顏色變?yōu)闇\綠色，放置24 h后顏色褪去；蒸餾水空白對照試管中一直為無色。由此可知，八角提取物中含有三萜類皂苷。

2.2 八角皂苷定量分析

以齊墩果酸的濃度（C）作為橫坐標，吸光度（A）作為縱坐標，繪制標準曲線。經(jīng)過線性擬合得到方程為A=0.011C－0.024，R2=0.999 5。說明在質(zhì)量濃度20.50～102.50 mg/mL的范圍內(nèi)，齊墩果酸呈良好的線性關(guān)系。經(jīng)精密度實驗、穩(wěn)定性實驗、加標回收實驗，結(jié)果證明該方法的準確度高，可用于八角皂苷的定量分析。

不同提取方法對八角皂苷進行提取的得率不同，超聲波輔助法提取八角皂苷的得率為2.67%，5次平行提取得率的相對標準偏差（RSD）為1.21%；加熱回流法提取八角皂苷的得率為5.47%，5次平行提取得率的RSD為0.52%。由結(jié)果可知，這兩種方法都可以用來提取皂苷。比較兩種方法提取八角皂苷的得率及RSD可知，加熱回流提取的得率明顯比超聲波輔助法提取的要高，并且更加穩(wěn)定可行，故加熱回流法用于提取八角皂苷更優(yōu)。這是因為超聲波輔助法提取時間短、能耗少，但沒有加熱回流法提取得充分，且超聲波容易破壞皂苷的結(jié)構(gòu)，所以，超聲波輔助法提取皂苷的得率沒有加熱回流法提取的得率高，且所得皂苷也沒有加熱回流法提取的穩(wěn)定。

2.3 八角皂苷的穩(wěn)定性研究

2.3.1 溫度對八角皂苷穩(wěn)定性的影響

不同溫度對八角皂苷穩(wěn)定性的影響可由皂苷所對應(yīng)的吸光度體現(xiàn)，結(jié)果見表1。

由表1可知，在40～80 ℃范圍內(nèi)，溫度對八角皂苷穩(wěn)定性的影響顯著。隨著溫度的升高，兩種提取物的吸光度均逐漸升高，這是因為溫度升高，提取物中雜質(zhì)發(fā)生變化，影響香草醛-濃硫酸法顯色，使得吸光度增大。溫度對八角皂苷加熱回流提取物的影響強于對八角皂苷超聲波輔助提取物，這可能是因為加熱回流法提取的八角皂苷提取物中皂苷含量更高，這與2.2中加熱回流法提取比超聲波輔助法提取的得率高且穩(wěn)定這一結(jié)論一致。所以，八角皂苷貯存時應(yīng)置于低溫的環(huán)境中，避免因熱造成皂苷結(jié)構(gòu)的改變。

2.3.2 氧化物對八角皂苷穩(wěn)定性的影響

氧化物H2O2對八角皂苷穩(wěn)定性的影響結(jié)果見表2。

由表2可知，氧化物H2O2對八角皂苷穩(wěn)定性有顯著的影響，說明氧化物H2O2對八角皂苷具有破壞性，這是植物皂苷易被氧化所引起的。

2.3.3 pH對八角皂苷穩(wěn)定性的影響

不同pH對八角皂苷穩(wěn)定性的影響結(jié)果見表3。

由表3可知，溶液的pH對八角皂苷穩(wěn)定性的影響較小。在pH為8時，對八角皂苷穩(wěn)定性的影響最小，故在生產(chǎn)、使用、存放時八角皂苷應(yīng)置于pH為8的環(huán)境中。

2.3.4 金屬離子對八角皂苷穩(wěn)定性的影響

不同金屬離子對八角皂苷穩(wěn)定性的影響結(jié)果見表4。

由表4可知，金屬離子對八角皂苷穩(wěn)定性有一定的影響，其中Na+對八角皂苷穩(wěn)定性的影響最小，K+、Mg2+、Ca2+對八角皂苷穩(wěn)定性的影響基本一致。

2.3.5 光照條件對八角皂苷穩(wěn)定性的影響

光照條件對八角皂苷穩(wěn)定性的影響結(jié)果見表5。

由表5可知，不同的光照條件對八角皂苷穩(wěn)定性的影響很小，但光照條件對八角皂苷穩(wěn)定性的影響較避光條件大一些，即避光處理時八角皂苷的穩(wěn)定性更佳，故八角皂苷儲存時最好避光。

3 結(jié)論

建立了香草醛-濃硫酸測定八角皂苷的分析方法，其線性方程為A=0.011C－0.024，R2=0.999 5，該方法操作簡便快捷，精密度和穩(wěn)定性好，可以準確分析八角皂苷的含量。

超聲波輔助法提取八角皂苷的得率為2.67%，加熱回流法提取八角皂苷的得率為5.47%。加熱回流法提取八角皂苷的效果比超聲波輔助法好。

溫度和氧化物H2O2對八角皂苷穩(wěn)定性的影響顯著，溶液的pH對八角皂苷穩(wěn)定性的影響較小，金屬離子對八角皂苷穩(wěn)定性有一定的影響，光照條件對八角皂苷穩(wěn)定性的影響很小。在生產(chǎn)、使用、存放時，八角皂苷在低溫、pH為8、避光環(huán)境中穩(wěn)定性更佳。

參考文獻：

[1]韋小杰，陳小鵬，王琳琳，等.八角油提取新方法的研究[J].食品工業(yè)科技，2003（3）：41-43.

[2]黃卓民.八角[M].北京：中國林業(yè)出版社，1994.

[3]陽小勇，唐榮平.八角茴香的化學(xué)成分及應(yīng)用研究[J].中國調(diào)味品，2018，43（8）：194-195，200.

[4]鄭燕菲，藍亮美，羅雅梅.八角茴香揮發(fā)油的化學(xué)成分及其包合物制備工藝研究[J].中國調(diào)味品，2020，45（11）：38-41.

[5]唐凱，南美娟，章丹，等.響應(yīng)面法篩選八角茴香多酚的提取工藝[J].陜西中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報，2019，42（5）：48-54.

[6]侯振麗，胡愛林，石旭柳，等.八角茴香的化學(xué)成分及生物活性研究進展[J].中藥材，2021（8）：2018-2027.

[7]劉慧勤，李秋庭，湯星月，等.八角籽油成分和抗氧化性分析[J].中國調(diào)味品，2021，46（8）：47-51.

[8]趙二勞，徐未芳，劉樂.八茴香抑菌作用研究進展[J].中國調(diào)味品，2019，44（4）：191-193.

[9]趙二勞，徐未芳，劉樂.八角茴香抗氧化活性研究進展[J].中國調(diào)味品，2019，44（5）：194-196.

[10]賈秀峰，李波，王佳瑩.苜蓿皂苷提取方法的研究及皂苷含量的測定[J].食品研究與開發(fā)，2007，28（9）：11-13.

[11]劉星，余江麗，劉敏，等.近10年甾體皂苷的生物活性研究進展[J].中國中藥雜志，2015，40（13）：2518-2523.

[12]羅林明，覃麗，裴剛，等.百合屬植物甾體皂苷成分及其藥理活性研究進展[J].中國中藥雜志，2018，43（7）：1416-1426.

[13]陳紅艷，陳安，盧芳國，等.三七總皂苷的藥理研究進展[J].湖南中醫(yī)雜志，2019，35（1）：154-157.

[14]馬園園，王靜，羅瓊，等.黃芪總皂苷藥理作用研究進展[J].遼寧中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報，2020，22（7）：153-157.

[15]譚亮，湯秋凱，王守章，等.三七皂苷R1藥理作用的研究進展[J].中國藥理學(xué)通報，2018，34（5）：604-607.

[16]李貴明，李燕.人參皂苷藥理作用研究現(xiàn)狀[J].中國臨床藥理學(xué)雜志，2020，36（8）：1024-1027.

[17]唐冕，許曉芬.藥用黃芪皂苷類化學(xué)成分及藥理作用研究進展[J].中醫(yī)藥導(dǎo)報，2018，24（20）：117-122.

[18]胡春鳳，張平平，劉金福，等.紅棗皂甙提取工藝及定性分析[J].食品研究與開發(fā)，2008（29）：8-12.

[19]弓曉峰，謝明勇，陳奕.黑靈芝中三萜及其皂苷類化合物總量的光度測定[J].天然產(chǎn)物研究與開發(fā)，2006（5）：825-829.

[20]耿立晶，周圍.苦瓜皂苷的提取方法及生理功能的研究進展[J].中國釀造，2009（7）：15-19.