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    基于甘蔗糖蜜的黑曲霉產(chǎn)β-Ffase酶的單因素條件研究

    2023-06-09 01:28:30雷光鴻樊紅日李莉嬌
    甘蔗糖業(yè) 2023年2期
    關(guān)鍵詞:糖蜜酵母粉產(chǎn)酶

    雷光鴻,樊紅日,李 元,陳 亮,李莉嬌,尹 麗*

    (1廣西工業(yè)職業(yè)技術(shù)學(xué)院輕工化工學(xué)院,廣西南寧 530003;2廣西大學(xué)輕工與食品工程學(xué)院,廣西南寧 530004)

    0 引言

    低聚果糖(FOS)合成過程中的關(guān)鍵酶是β-呋喃果糖苷酶(β-Ffase),葡萄糖和果糖分子的同時存在,調(diào)控好該過程中主要的底物分子蔗糖的濃度,將有助于酶將其聚合生成低聚果糖,在提高轉(zhuǎn)化效率的情況下,促進了產(chǎn)物FOS的產(chǎn)生[1]。目前有關(guān)微生物催化生產(chǎn)低聚果糖的相關(guān)報道較少,Shin等[2]在研究利用蔗糖生產(chǎn)低聚果糖之后,評估3種不同的金黃色葡萄球菌菌株使用糖蜜作為蔗糖等效物生產(chǎn)低聚果糖的能力,并且在55℃和pH 5.5條件下培育24 h后實現(xiàn)了FOS的生產(chǎn),但是FOS的產(chǎn)率低。黑曲霉具有良好的特性,本文研究了黑曲霉菌株的不同發(fā)酵條件(糖蜜添加量、氮源、孢子接種量、溫度和pH等單因素條件)對黑曲霉菌株產(chǎn)β-Ffase酶酶活和菌絲體濃度(DCW)的影響,得到利用糖蜜產(chǎn)β-Ffase酶的優(yōu)化條件。

    1 材料與方法

    1.1 菌株與原料

    黑曲霉Aspergillus niger,編號:ATCC 20611,下簡稱黑曲霉,凍干管保藏菌種,購于美國模式培養(yǎng)物集存庫(American Type Culture Collection);甘蔗糖蜜:由廣西南寧糖業(yè)股份有限公司明陽糖廠提供。

    1.2 試驗方法

    1.2.1 培養(yǎng)基的配制

    YM培養(yǎng)基:麥芽糖提取物3.0 g/L,葡萄糖10.0 g/L,酵母提取物3.0 g/L,蛋白胨5.0 g/L,115℃滅菌30 min,作為黑曲霉活化(種子)培養(yǎng)基。

    FM培養(yǎng)基:蔗糖20.0 g/L,酵母提取物15.0 g/L,MgSO4·7H2O 0.5 g/L,KCl 0.5 g/L,NaNO32.0 g/L,K2HPO45.0 g/L,用0.1 mol/L HCl調(diào)pH至5.5,121℃滅菌20 min,作為黑曲霉發(fā)酵產(chǎn)酶培養(yǎng)基。

    1.2.2 黑曲霉菌絲體的制備

    先將黑曲霉ATCC 20611菌株經(jīng)YM培養(yǎng)基活化,在通過發(fā)酵培養(yǎng)基誘導(dǎo)產(chǎn)酶后,分離出成熟的菌絲體并將其保存在檸檬酸-磷酸氫二鈉緩沖液中。

    1.2.3 黑曲霉菌絲體酶活的測定

    β-Ffase酶活的測定:1 U的β-Ffase定義為1 min酶催化蔗糖反應(yīng)產(chǎn)生1 μmol的還原糖所需的酶量,參考Dorta等[3]的酶活測定方法并加以修改后具體如下:配制4 mL 25%的蔗糖溶液和6 mL pH 5.0的檸檬酸磷酸氫二鈉緩沖液,混合,加入0.04 g黑曲霉菌體后,50℃條件下水浴震蕩反應(yīng)2 h后置于電爐上后加熱沸騰10 min使酶失活。加入1 mL上述稀釋適當(dāng)倍數(shù)的上清液于25 mL的酶標(biāo)管中,隨后加入2 mL DNS試劑,置于沸水浴中計時2 min后,迅速放置于冰水中冷卻,最后在酶標(biāo)管中加入超純水至25 mL,于540 nm波長下測定樣品對的吸光值。根據(jù)制備的DNS標(biāo)準(zhǔn)曲線代入計算出菌絲體酶活。

    1.2.4 DCW的測定

    使用干重法測定發(fā)酵液菌絲體濃度。分別將離心管置于烘箱中烘干至恒重,隨后置于干燥器中冷卻至室溫后稱重(X1),黑曲霉發(fā)酵過程中每間隔12 h取5 mL發(fā)酵液樣品于上述已經(jīng)烘干處理后的離心管中,在7000 r/min的條件下離心10 min,棄上清液,加入10 mL生理鹽水振蕩混勻,隨后同樣在7000 r/min的條件下離心10 min后倒掉上清液,重復(fù)該步驟1次。隨后將帶有菌絲體沉淀的離心管置于烘箱烘干至恒重,再稱重(X2),每個樣品進行3次平行測定后取平均值。

    式(1)中,DCW為β-Ffase酶菌絲體濃度,g/L;X2為干燥至恒重后菌絲體和離心管的總質(zhì)量,g;X1為干燥至恒重后離心管的質(zhì)量,g;V為發(fā)酵液體積,mL。

    1.2.5 糖蜜預(yù)處理方法

    量取500 mL糖蜜于燒杯中,以1∶1將糖蜜與蒸餾水在2 L大燒杯中混合,將2 mmol/L EDTA溶液加入甘蔗糖蜜溶液中,靜置12 h,取上清液,在上清液中加入適量的活性炭(1.5% w/v),脫色,12000 r/min離心15 min,取上清液。

    1.2.6 黑曲霉發(fā)酵產(chǎn)酶條件優(yōu)化

    根據(jù)參考文獻[3-4]提供的培養(yǎng)條件,預(yù)處理后糖蜜添加量10%,氮源酵母粉添加量10 g/L,孢子接種量7.5 %,培養(yǎng)基pH 6.0,發(fā)酵溫度35℃,200 r/min條件下培養(yǎng)48 h,β-Ffase酶活289.17 U/mL,細胞干重7.95 g/L。在此基礎(chǔ)上,將新鮮的黑曲霉孢子接種于糖蜜發(fā)酵培養(yǎng)基中,進行培養(yǎng)基的優(yōu)化,考察不同條件單因素對黑曲霉菌株產(chǎn)β-Ffase酶酶活和DCW的影響。

    2 結(jié)果與分析

    2.1 糖蜜添加量對菌株產(chǎn)β-Ffase的影響

    預(yù)處理后的糖蜜,極大程度上保留甘蔗糖蜜中蔗糖含量,有效地除去了原糖蜜中膠體灰分等不利于微生物生長產(chǎn)酶的有害成分,另外,糖蜜本身就含有豐富的營養(yǎng)物質(zhì),生物素含量也很可觀,是很好的發(fā)酵原料,可作為黑曲霉菌絲體發(fā)酵生長和產(chǎn)酶的發(fā)酵原料(廉價碳源替代品)。本研究進一步選取2.5%、5%、10%、15%和20%糖蜜添加量分析β-Ffase酶活和菌絲體DCW,將新鮮的黑曲霉孢子接種于糖蜜發(fā)酵培養(yǎng)基中,孢子接種量7.5%,氮源(酵母粉)添加量為10 g/L,培養(yǎng)基pH 6.0,發(fā)酵溫度35℃,200 r/min條件下培養(yǎng)48 h,考察不同糖蜜添加量對黑曲霉發(fā)酵產(chǎn)酶及菌株生長的影響。實驗結(jié)果由圖1所示。

    圖1 糖蜜添加量對黑曲霉菌株生長和產(chǎn)酶的影響

    由圖1可知,不同糖蜜添加量對黑曲霉菌株產(chǎn)酶活性和菌絲體干重的影響呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢。當(dāng)糖蜜添加量由2.5%增加到15%時,β-Ffase酶活由268.10 U/mL增長到382.01 U/mL;菌絲體DCW由4.68 g/L增長到7.93 g/L,該階段黑曲霉菌株不斷利用糖蜜中的營養(yǎng)成分,生長旺盛的同時持續(xù)產(chǎn)酶,糖蜜培養(yǎng)基可有效提高菌株的生長量和產(chǎn)酶效果,而當(dāng)糖蜜添加量繼續(xù)增大達到20%時,過多的糖蜜添加對菌絲體生長和產(chǎn)酶情況產(chǎn)生抑制作用,菌絲體酶活和DCW分別下降到338.86 U/mL和7.55 g/L,此后糖蜜量的增加不利于黑曲霉菌株生長和產(chǎn)酶。綜合考慮,以15%糖蜜添加量作為發(fā)酵培養(yǎng)基中的碳源,更適合黑曲霉菌株的糖蜜發(fā)酵生長,用于后續(xù)實驗。

    2.2 溫度對菌株產(chǎn)β-Ffase的影響

    黑曲霉對發(fā)酵溫度較敏感,之前有關(guān)黑曲霉菌株研究表明[5],黑曲霉菌株適合在25℃之間的環(huán)境下發(fā)酵生長產(chǎn)酶。當(dāng)發(fā)酵培養(yǎng)溫度過高或過低時,菌株代謝活性都會受到影響,從而抑制黑曲霉菌株的生長和酶的合成分泌。因此,為了使得菌株生長旺盛并獲得較高的β-Ffase酶活性,需要探究黑曲霉菌株在糖蜜條件下生長的合適溫度。實驗以20℃、25℃、30℃、35℃和40℃來分析β-Ffase酶活和菌絲體DCW,將新鮮的黑曲霉孢子接種于糖蜜發(fā)酵培養(yǎng)基中,糖蜜添加量15%,氮源(酵母粉)添加量為10 g/L,孢子接種量7.5%,培養(yǎng)基pH 6.0,200 r/min條件下培養(yǎng)48 h,考察不同溫度對黑曲霉發(fā)酵產(chǎn)酶及菌株生長的影響。實驗結(jié)果如圖2所示。

    圖2 溫度對黑曲霉菌株生長和產(chǎn)酶的影響

    從圖2可知,隨著溫度的升高,黑曲霉菌絲體的DCW和β-Ffase酶活呈先升高再降低的趨勢,由20℃上升到30℃之前,β-Ffase酶活和DCW隨著溫度的升高而增加,發(fā)酵溫度為30℃時,黑曲霉菌株產(chǎn)酶活性達到最大,β-Ffase酶活為372.43 U/mL,DCW為8.11 g/L;當(dāng)溫度超過30℃后,黑曲霉菌株的酶活呈現(xiàn)下降趨勢,溫度升高到35℃時,菌株產(chǎn)酶活力有所下降,β-Ffase酶活降至335.18 U/mL;DCW為7.19 g/L,在40℃時,β-Ffase酶活只有308.15 U/mL,DCW為6.49 g/L。溫度過高,酶的產(chǎn)生受到抑制,黑曲霉菌株生物量減少,β-Ffase酶活力降低,影響發(fā)酵周期及產(chǎn)酶效率。由此,選定30℃為黑曲霉菌株在糖蜜發(fā)酵條件下最適的產(chǎn)酶溫度較為合適。

    2.3 pH值對菌株產(chǎn)β-Ffase的影響

    pH值是影響黑曲霉生長和代謝活性的重要因素之一,且黑曲霉菌株所分泌的果糖基轉(zhuǎn)移酶多為酸性酶(pH 5.0左右),pH值通過影響甘蔗糖蜜培養(yǎng)環(huán)境下,菌絲體對有效成分溶解后利用進程,發(fā)酵過程中的氧化還原反應(yīng)和β-Ffase酶活性,對菌絲體生長和酶的積累有較大影響[6]。以pH 4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5和7.0分析β-Ffase酶活和菌絲體DCW,將新鮮的黑曲霉孢子接種于糖蜜發(fā)酵培養(yǎng)基中,糖蜜添加量15%,氮源(酵母粉)添加量為10 g/L,孢子接種量7.5%,發(fā)酵溫度30℃,200 r/min條件下培養(yǎng)48 h,考察不同pH值對黑曲霉發(fā)酵產(chǎn)酶及菌株生長的影響。實驗結(jié)果如圖3所示。

    圖3 pH對黑曲霉菌株生長和產(chǎn)酶的影響

    由圖3可見,糖蜜培養(yǎng)基中pH值對黑曲霉菌株生長和產(chǎn)酶有較大影響,在初始pH值由4不斷增大的過程中,DCW和β-Ffase酶活呈現(xiàn)增加的趨勢;當(dāng)pH值為5.5時,β-Ffase酶活達到最大值,為409.30 U/mL,此時DCW為8.75 g/L,黑曲霉菌株生長良好,菌絲體適應(yīng)在此偏酸性環(huán)境下繁殖和產(chǎn)酶;而隨著pH值繼續(xù)增加,pH值為6.0時菌株產(chǎn)酶活力有所下降,β-Ffase酶活降至364.60 U/mL,此時DCW為9.17 g/L;當(dāng)pH值6.5時,β-Ffase酶活降至345.02 U/mL,此時DCW為8.23 g/L。糖蜜培養(yǎng)基環(huán)境中的氫離子濃度調(diào)節(jié)微生物的增殖和酶的合成,在中性至堿性環(huán)境下會分散質(zhì)膜抑制酶活性和膜轉(zhuǎn)運蛋白,抑制黑曲霉菌絲體生長和產(chǎn)酶[7],由此,黑曲霉菌株在糖蜜培養(yǎng)基中最適合的生長產(chǎn)酶pH值為5.5。

    2.4 氮源對菌株產(chǎn)β-Ffase的影響

    以5、10、15、20和25 g/L酵母粉添加量分析β-Ffase酶活和菌絲體DCW,將新鮮的黑曲霉孢子接種于糖蜜發(fā)酵培養(yǎng)基中,糖蜜添加量15%,孢子接種量7.5%,培養(yǎng)基pH 5.5,發(fā)酵溫度30℃,200 r/min條件下培養(yǎng)48 h,考察酵母粉(氮源)添加量對黑曲霉發(fā)酵產(chǎn)酶及菌株生長的影響。實驗結(jié)果如圖4所示。

    圖4 酵母粉添加量對黑曲霉菌株生長和產(chǎn)酶的影響

    從圖4可知,隨著酵母粉添加量增加,菌絲體酶活呈現(xiàn)上升趨勢,當(dāng)酵母粉的添加量為20 g/L時,β-Ffase酶活力最大,達到411.48 U/mL,菌絲體生長良好,DCW達到8.56 g/L。當(dāng)酵母粉添加量達到25 g/L時,其菌絲體進一步生長,DCW達到9.69 g/L,而此時β-Ffase酶活卻下降,為380.99 U/mL,過量的氮和磷可能導(dǎo)致菌株的快速生長但不利于細胞產(chǎn)酶,限制了β-Ffase酶活力[8]。菌絲過度生長,培養(yǎng)基中營養(yǎng)物質(zhì)多用于其他生命活動而產(chǎn)酶量減少,酶活性開始下降,由此確定最適的酵母粉添加量為20 g/L。

    2.5 孢子接種量對菌株產(chǎn)β-Ffase的影響

    以2.5%、5%、7.5%、10%、12.5%和15%孢子接種量分析β-Ffase酶活和菌絲體DCW,將新鮮的黑曲霉孢子接種于糖蜜發(fā)酵培養(yǎng)基中,糖蜜添加量15%,氮源(酵母粉)添加量為20 g/L,培養(yǎng)基pH 5.5,發(fā)酵溫度30℃,200 r/min條件下培養(yǎng)48 h,考察不同接種量對黑曲霉發(fā)酵產(chǎn)酶及菌株生長的影響。實驗結(jié)果如圖5所示。

    圖5 孢子接種量對黑曲霉菌株生長產(chǎn)酶的影響

    由圖5可見當(dāng)孢子接種量由2.5%增長到10%時,黑曲霉菌株的β-Ffase酶活和DCW均呈現(xiàn)上升趨勢,該階段菌絲體生物量處于增長時期,且黑曲霉菌株生物量過少而不能有效的利用糖蜜發(fā)酵液中的營養(yǎng)成分,使得發(fā)酵周期滯后,不利于菌株分泌β-Ffase酶,從而影響了黑曲霉發(fā)酵甘蔗糖蜜的效率和產(chǎn)酶效果,因此需進一步增大接種量,黑曲霉菌株在短時間內(nèi)快速繁殖且產(chǎn)酶活性良好的效果[9]。

    當(dāng)孢子接種量達到10% 時,β-Ffase酶活達到最高為414.82 U/mL,菌絲體DCW達到8.45 g/L。此后,接種量繼續(xù)增加時,β-Ffase酶活性出現(xiàn)下降趨勢,菌絲體卻在進一步生長。當(dāng)接種量為12.5%時,β-Ffase酶活為386.67 U/mL,DCW達到9.23 g/L;因為孢子接種量過大,黑曲霉菌絲體迅速生長繁殖,糖蜜發(fā)酵液粘度增大而溶氧量不夠,不利于黑曲霉菌株分泌β-Ffase,菌株產(chǎn)酶受抑制;當(dāng)接種量為15%時,菌株已過量生長,糖蜜中的營養(yǎng)物質(zhì)大量消耗,菌絲體生長受限,β-Ffase酶活降至371.27 U/mL,DCW為8.91 g/L;這與前人研究黑曲霉的生長和產(chǎn)酶曲線隨著時間的推移,菌絲體的生長和產(chǎn)酶效率所呈現(xiàn)先增加而后減少的趨勢相一致[6]。因此,選取10%接種量作為黑曲霉產(chǎn)酶的最適孢子接種量,更利于黑曲霉菌株在糖蜜條件下生長和產(chǎn)酶。

    3 討論與結(jié)論

    實驗結(jié)果表明,黑曲霉菌株產(chǎn)β-Ffase酶的優(yōu)化發(fā)酵條件為:采用預(yù)處理的甘蔗糖蜜,添加量為15%、有機氮源酵母粉20 g/L、pH 5.5、孢子接種量10%、溫度30℃;進一步加入0.3%表面活性劑吐溫-80,促進β-Ffase酶活性的表達;在優(yōu)化條件下連續(xù)培養(yǎng)黑曲霉,菌株生長和產(chǎn)酶情況如圖6所示,菌株在此條件下生長良好。培養(yǎng)48 h后,與文獻[3-4]提供的培養(yǎng)基條件相比較,β-Ffase酶活達到463.87 U/mL,提高了1.6倍,菌絲體DCW為11.77 g/L,提高了1.48倍,提高菌株產(chǎn)酶活性和促進菌株生長的效果。

    圖6 糖蜜培養(yǎng)基優(yōu)化條件下的發(fā)酵過程

    本研究提出黑曲霉菌株產(chǎn)β-Ffase酶的發(fā)酵條件,這將有助于探究甘蔗糖蜜發(fā)酵生產(chǎn)低聚果糖,促進其工業(yè)化利用。研究發(fā)現(xiàn)具有高β-Ffase酶活性的黑曲霉菌株能夠催化甘蔗糖蜜,高效地轉(zhuǎn)化為FOS,該過程避免了昂貴的酶純化程序的需要[10]。糖蜜作為催化底物,整個黑曲霉菌絲體作為生物催化劑,能大大降低工業(yè)上生產(chǎn)FOS的生產(chǎn)成本。因此,本研究中開發(fā)的用于FOS生產(chǎn)的黑曲霉菌株和生物工藝在FOS食品和飼料添加劑等生產(chǎn)中具有很高的應(yīng)用潛力。

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