云南耿馬甘蔗宿根矮化病的發(fā)生分布和病原分子檢測(cè)

馬永德，王曉燕，李銀煳，李 婕，張榮躍，單紅麗，黃應(yīng)昆

(1耿馬縣農(nóng)業(yè)農(nóng)村局，云南耿馬 677500；2云南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院甘蔗研究所，云南開遠(yuǎn) 661699)

0 引言

耿馬地處云南省西南部，縣域內(nèi)冬無嚴(yán)寒、夏無酷暑、雨熱同季、日照充足、晝夜溫差大，有利于甘蔗生長和蔗糖分積累，是中國糖料蔗核心基地縣之一，也是云南省甘蔗產(chǎn)業(yè)“一縣一業(yè)”特色縣。2021年耿馬甘蔗種植面積2.71萬hm2，涉及全縣47個(gè)村民委員會(huì)、1個(gè)社區(qū)和15個(gè)農(nóng)場(chǎng)生產(chǎn)隊(duì)，種蔗農(nóng)戶達(dá)2.25萬戶10萬余人，蔗糖產(chǎn)業(yè)已成為云南耿馬邊疆民族地區(qū)“脫貧攻堅(jiān)、鄉(xiāng)村振興”支柱產(chǎn)業(yè)，其在促進(jìn)邊疆地區(qū)經(jīng)濟(jì)發(fā)展、農(nóng)民增收和助力鄉(xiāng)村振興中發(fā)揮著重要作用。

甘蔗宿根矮化病(Ratoon stunting disease，RSD)是由一種寄生在蔗株維管束中的棒桿菌屬細(xì)菌(Leifsonia xylisubsp.xyli，Lxx)引起的世界性種傳病害[1-7]，造成甘蔗宿根年限縮短、種性退化，嚴(yán)重影響甘蔗產(chǎn)量和品質(zhì)。據(jù)調(diào)查，受害蔗田一般減產(chǎn)10%～30%[8-12]，干旱缺水時(shí)達(dá)60%以上，蔗糖分降低0.5%，宿根年限縮短1～2年，每年可造成上億元的經(jīng)濟(jì)損失，嚴(yán)重阻礙了蔗糖產(chǎn)業(yè)的高質(zhì)量發(fā)展[13]。國內(nèi)外研究結(jié)果表明，防治RSD最經(jīng)濟(jì)有效的措施是種植溫水脫毒健康種苗[9,14-15]，此方法對(duì)甘蔗具有顯著的增產(chǎn)增糖效果，新植蔗增產(chǎn)5.01～49.83 t/hm2；宿根蔗增產(chǎn)4.41～30.84 t/hm2，蔗糖分提高0.35%～0.86%，宿根年限延長2～3年[16-19]。耿馬作為云南省甘蔗產(chǎn)業(yè)“一縣一業(yè)”特色縣，也是今后甘蔗生產(chǎn)重點(diǎn)布局和最具潛力的發(fā)展區(qū)域，由于多年均未對(duì)RSD在耿馬各主產(chǎn)鄉(xiāng)鎮(zhèn)的分布、發(fā)生危害和品種感病程度等進(jìn)行系統(tǒng)全面調(diào)查，致使推廣應(yīng)用溫水脫毒健康種苗、有效防控RSD缺乏可靠依據(jù)。為此筆者于2022年對(duì)云南耿馬不同蔗區(qū)的RSD發(fā)生危害情況進(jìn)行了系統(tǒng)調(diào)查和病原分子檢測(cè)，分析明確了云南耿馬不同蔗區(qū)、不同品種、不同植期RSD的發(fā)生狀況，為甘蔗溫水脫毒健康種苗的生產(chǎn)繁殖和推廣應(yīng)用及有效防控甘蔗宿根矮化病提供了科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 病害調(diào)查與樣品采集

于2022年12月甘蔗成熟期，對(duì)云南耿馬縣耿馬鎮(zhèn)、賀派鄉(xiāng)和四排山鄉(xiāng)等主產(chǎn)蔗區(qū)宿根矮化病的發(fā)生和分布進(jìn)行了調(diào)查和田間采樣。采樣選擇具有代表性的主栽或主推品種，根據(jù)品種、蔗地、植期分類，隨機(jī)取樣，共采集80個(gè)樣本。其中耿馬鎮(zhèn)采集了29個(gè)樣本，賀派鄉(xiāng)采集了30個(gè)樣本，四排山鄉(xiāng)采集了21個(gè)樣本。品種上，采集了22個(gè)粵糖93-159樣本，8個(gè)新臺(tái)糖22號(hào)樣本，9個(gè)柳城05-136樣本，8個(gè)盈育91-59樣本，6個(gè)粵糖83-88樣本，4個(gè)云瑞06-189樣本，4個(gè)云瑞07-1433樣本，3個(gè)云瑞10-328樣本，7個(gè)云蔗05-51樣本，9個(gè)云蔗08-1609樣本。植期上，采集了1年植期樣本10個(gè)，2年植期樣本17個(gè)，3年植期樣本24個(gè)，4年植期樣本25個(gè)，5年植期樣本3個(gè)和7年植期樣本1個(gè)。

每個(gè)樣本取10株，每株截取中下部莖節(jié)各1節(jié)，每節(jié)切成約7 cm長，縱向“十”字剖為4份，再用鉗子擠壓蔗莖，共取約25 mL的蔗汁于50 mL離心管內(nèi)混勻，樣品放于冰箱中，于-20℃保存待用。每取1個(gè)樣品后，取樣工具先用清水沖洗，再用75%酒精進(jìn)行消毒。RSD陽性對(duì)照由云南省甘蔗遺傳改良重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室鑒定保存，陰性對(duì)照為(50±0.5)℃熱水處理2 h的無菌蔗株，空白對(duì)照為滅菌去離子水。

1.2 蔗汁總DNA的提取

各樣品取4 mL蔗汁，12000 r/min離心10 min，棄上清，沉淀采用北京全式金生物技術(shù)有限公司的EasyPure Plant Genomic DNA Kit試劑盒提取蔗汁總DNA，具體步驟參照說明書進(jìn)行操作。

1.3 RSD分子檢測(cè)

RSD的PCR分子檢測(cè)采用Pan等[20]反應(yīng)體系及擴(kuò)增程序，即PCR擴(kuò)增體系20 μL：ddH2O 8.6 μL，2×EasyTaq PCR SuperMix 8 μL(北京全式金生物技術(shù)有限公司，AS111-11)，DNA模板3 μL，上下游引物各0.2 μL(20 μg/μL)；擴(kuò)增程序?yàn)椋?5℃預(yù)變性5 min，94℃變性30 s，56℃退火30 s，72℃延伸1 min，35個(gè)循環(huán)后72℃延伸5 min。Lxx特異性引物L(fēng)xxl：5’-CCGAAGTGAGCAGATTGACC- 3’和Lxx2：5’-ACCCTGTGTTGTTTTCAACG-3’，預(yù)期擴(kuò)增片段大小438 bp，委托上海生工生物工程有限公司合成。擴(kuò)增產(chǎn)物用1.5%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。

2 結(jié)果與分析

2.1 各主產(chǎn)鄉(xiāng)鎮(zhèn)RSD發(fā)生情況

對(duì)云南耿馬縣耿馬鎮(zhèn)、賀派鄉(xiāng)和四排山鄉(xiāng)等3個(gè)甘蔗主產(chǎn)鄉(xiāng)鎮(zhèn)宿根矮化病的調(diào)查和檢測(cè)結(jié)果表明見表1、圖1。耿馬蔗區(qū)RSD發(fā)生普遍。采用RCR法對(duì)采集的80個(gè)樣本進(jìn)行RSD檢測(cè)，結(jié)果一致。80個(gè)樣本中61個(gè)呈陽性，陽性檢出率為76.25%；其中強(qiáng)陽性樣本34個(gè)，占42.50%；3個(gè)甘蔗主產(chǎn)鄉(xiāng)鎮(zhèn)均檢測(cè)出RSD，陽性檢出率在70.00%～85.71%之間，檢出率和強(qiáng)陽性率最高的是四排山鄉(xiāng)，分別為85.71%和66.67%；其次是耿馬鎮(zhèn)、賀派鄉(xiāng)，檢出率為75.86%、70.00%，強(qiáng)陽性率為31.03%、36.67%(見圖2)。

圖1 云南耿馬甘蔗宿根矮化病(RSD)PCR檢測(cè)電泳圖

圖2 各主產(chǎn)鄉(xiāng)鎮(zhèn)甘蔗宿根矮化病發(fā)生情況

表1 云南耿馬甘蔗宿根矮化病(RSD)檢測(cè)結(jié)果

2.2 不同品種、植期RSD發(fā)生情況

從檢測(cè)結(jié)果看，耿馬蔗區(qū)粵糖93-159、新臺(tái)糖22號(hào)、粵糖83-88、柳城05-136、盈育91-59、云瑞06-189、云瑞07-1433、云瑞10-328、云蔗05-51、云蔗08-1609等10個(gè)主栽或主推品種均發(fā)病，發(fā)病率在37.50%～100%之間，其中尤以粵糖93-159、粵糖83-88、云瑞07-1433、盈育91-59、柳城05-136發(fā)病最重，發(fā)病率為77.27%～100%，強(qiáng)陽性率為44.44%～66.67%，其次是新臺(tái)糖22號(hào)、云瑞06-189、云瑞10-328、云蔗05-51和云蔗08-1609，發(fā)病率為37.5%～100%，強(qiáng)陽性率為0%～14.29%(見圖3)。植期上1、2、3、4、5年均不同程度發(fā)病，但幾者之間發(fā)病率和發(fā)病程度都沒有明顯的規(guī)律性差異(見圖4)。

圖3 不同甘蔗品種宿根矮化病發(fā)生情況

圖4 不同植期宿根矮化病發(fā)生情況

3 小結(jié)與討論

3.1 RSD在云南耿馬蔗區(qū)普遍發(fā)生且危害嚴(yán)重

田間隨機(jī)采樣檢測(cè)結(jié)果表明，地域上，耿馬鎮(zhèn)、賀派鄉(xiāng)和四排山鄉(xiāng)等甘蔗主產(chǎn)鄉(xiāng)鎮(zhèn)都檢測(cè)出RSD，陽性檢出率為70.00%～85.71%，強(qiáng)陽性率為31.03%～66.67%；80個(gè)供試樣本中61個(gè)呈陽性，陽性檢出率為76.25%；其中強(qiáng)陽性樣品34個(gè)，占42.50%。品種上，10個(gè)主栽或主推品種的RSD陽性檢出率為37.5%～100%，強(qiáng)陽性率為14.28%～66.67%。植期上，1、2、3、4、5年均不同程度發(fā)病，陽性檢出率為60.00%～91.67%，強(qiáng)陽性率為30.00%～52.94%。由此可見，RSD已在云南耿馬蔗區(qū)普遍發(fā)生且危害嚴(yán)重。

3.2 科學(xué)布局溫水脫毒健康種苗示范基地

耿馬全縣境內(nèi)甘蔗種植面積近2.67萬hm2，是云南省甘蔗種植面積最大的縣。甘蔗種植區(qū)覆蓋面廣，蔗糖產(chǎn)業(yè)是耿馬關(guān)聯(lián)度最大、涉及面最廣、影響最深的重要支柱產(chǎn)業(yè)，也是全縣經(jīng)濟(jì)發(fā)展的一張王牌。本文研究結(jié)果表明，RSD在耿馬蔗區(qū)普遍發(fā)生、危害嚴(yán)重，現(xiàn)已成為制約耿馬蔗糖產(chǎn)業(yè)持續(xù)高質(zhì)量發(fā)展、蔗農(nóng)增產(chǎn)增收和鄉(xiāng)村振興的重大問題。國內(nèi)外研究結(jié)果表明，種植溫水脫毒健康種苗, 甘蔗出苗快，分蘗強(qiáng)，株高高，蔗莖粗，新植蔗增產(chǎn)5.01～49.83 t/hm2，宿根蔗增產(chǎn)4.41～30.84 t/hm2，蔗糖分提高0.35%～0.86%，是防治RSD最經(jīng)濟(jì)有效的措施[15-19]。因此，在耿馬蔗區(qū)生產(chǎn)和推廣應(yīng)用溫水脫毒種苗是有效防治甘蔗病害，特別是RSD傳播，提高甘蔗產(chǎn)量、延長宿根年限最具潛力和效能的重要措施。根據(jù)RSD檢測(cè)結(jié)果，耿馬蔗區(qū)應(yīng)重點(diǎn)加強(qiáng)粵糖93-159、粵糖83-88、云瑞07-1433、盈育91-59、柳城05-136等易感病品種的溫水脫毒種苗生產(chǎn)繁殖和推廣應(yīng)用。同時(shí)建立規(guī)范化、標(biāo)準(zhǔn)化的甘蔗溫水脫毒健康種苗一級(jí)種苗圃133.33 hm2，二級(jí)種苗圃1333.33 hm2，以進(jìn)行種苗擴(kuò)繁，提供每年近6666.67 hm2的脫毒種苗供生產(chǎn)種植。一級(jí)種苗圃專用于繁育經(jīng)溫水處理的脫毒種苗，宜選擇與糖廠相鄰近，交通便利、排灌方便，地勢(shì)平坦，地塊土質(zhì)、肥力均較好的田塊。脫毒種苗擺放1～2天待胚芽硬化后種植(不超過5天)，下種量為120000～150000芽/hm2，雙行接頂擺放(與當(dāng)?shù)爻Ｒ?guī)種植方式相同)。一級(jí)苗圃需強(qiáng)化病蟲害綜合防治，各項(xiàng)操作應(yīng)由經(jīng)過培訓(xùn)技術(shù)人員擔(dān)任。在耿馬各甘蔗主產(chǎn)鄉(xiāng)鎮(zhèn)規(guī)劃建立甘蔗溫水脫毒種苗基地二級(jí)種苗圃，二級(jí)苗圃大量繁育從一級(jí)苗圃收獲的蔗種，從下種開始直至收獲，都應(yīng)由專業(yè)種植大戶加強(qiáng)田間管理，專業(yè)技術(shù)人員定期巡查指導(dǎo)病蟲害防治。二級(jí)苗圃收獲的蔗種即為生產(chǎn)用脫毒種苗，提供蔗農(nóng)種植。溫水脫毒種苗一、二級(jí)專用種苗圃擴(kuò)繁，田間管理按當(dāng)?shù)厣a(chǎn)實(shí)際；全程注重病蟲監(jiān)測(cè)、種苗純度檢測(cè)，種苗砍收、種植全過程，所用工具應(yīng)經(jīng)75%酒精液消毒。